一株木糖氧化無色桿菌的分離鑒定及其對小麥赤霉病的防治效果

鄧云　蘇妍　姚錦愛　田大剛　阮宏椿　肖翔　劉友

摘要： 為豐富小麥赤霉病病菌拮抗菌資源，尋找替代化學(xué)殺菌劑的生物防治方法，采用平板稀釋涂布法從小麥赤霉病抗性鑒定圃土壤、小麥根部和周邊植物根部分離拮抗細(xì)菌，明確其分類地位，并采用灌根和穗部噴施法測定其對小麥赤霉病防治效果。結(jié)果表明，本研究共分離獲得18株拮抗細(xì)菌，篩選出殺菌譜廣、對小麥赤霉病病菌抑菌效果較好的拮抗菌D09；其對小麥赤霉病禾谷鐮刀菌抑制率達(dá)到67.92%。根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特性和分子鑒定，初步鑒定拮抗菌D09為木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）。木糖氧化無色桿菌D09發(fā)酵液灌根處理對小麥赤霉病的田間防治效果達(dá)到50.93%，與常用殺菌劑氟硅唑穗部噴霧處理無顯著性差異。D09發(fā)酵液灌根處理的小麥籽粒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）毒素含量低于苯甲嘧菌酯穗部噴霧處理，與氟硅唑穗部噴霧處理無顯著性差異，玉米赤霉烯酮（ZEN）、雪腐鐮刀菌烯醇（NIV） 2種毒素含量與戊唑多菌靈、苯甲嘧菌酯、氟硅唑穗部噴霧處理無顯著性差異。綜上，木糖氧化無色桿菌D09對多種植物病原真菌具有廣譜抗性，對小麥赤霉病有較好的防治效果，對DON、ZEN、 NIV 3種毒素具有抑制作用，作為小麥赤霉病的生防材料，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞： 無色桿菌；拮抗菌；小麥赤霉病

中圖分類號： S476 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）02-0328-08

Isolation and identification of an Achromobacter xylosoxidans strain and its control effect on Fusarium head blight

DENG Yun¹， SU Yan¹， YAO Jin-ai²， TIAN Da-gang³， RUAN Hong-chun²， XIAO Xiang¹， LIU You¹

（1.Nanping Institute of Agricultural Sciences， Nanping 354200， China；2.Institute of Plant Protection， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350013， China;3.Institute of Biotechnology， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350001， China）

Abstract： In order to enrich the resources of antagonistic bacteria against Fusarium head blight and find a biological control method to replace chemical fungicides， antagonistic bacteria were isolated from the soil of wheat scab resistance identification nursery， wheat roots and the roots of the surrounding plants by plate dilution coating method， and their classification status was clarified. The control effect against Fusarium head blight was determined by root irrigation and ear spraying. The results showed a total of 18 strains of antagonistic bacteria were isolated in this study， and the antagonistic bacterium D09 with broad bactericidal spectrum and good antagonistic effect on wheat scab was screened out. Its inhibition rate against Fusarium graminearum reached 67.92%. According to the morphological characteristics， physiological and biochemical characteristics and molecular identification， the D09 was preliminarily identified as Achromobacter xylosoxidans. The control effect of Achromobacter xylosoxidans D09 fermentation broth on Fusarium head blight reached 50.93%， which was not significantly different from that of the commonly used fungicide flusilazole. The content of deoxynivalenol （DON） toxin in the diseased wheat grains treated with D09 fermentation broth was lower than that treated with difenoconazole·azoxystrobin， and there was no significant difference with flusilazole treatment. The contents of zearalenone （ZEN） and nivalenol （NIV） were not significantly different from those in the treatments of tebuconazole·carbendazim， difenoconazole·azoxystrobin， and flusilazole. In summary， Achromobacter xylosoxidans D09 has broad-spectrum resistance to various plant pathogenic fungi， has good control effect on Fusarium head blight， and has degradation effect on DON， ZEN and NIV toxins. As a biocontrol material for Fusarium head blight， D09 has good development and application prospects.

Key words： Achromobacter;antagonistic bacteria;Fusarium head blight

赤霉病（FHB）是世界性病害，主要是由禾谷鐮刀菌引起的一種嚴(yán)重影響禾谷類作物產(chǎn)量和品質(zhì)的毀滅性病害^[1]。小麥赤霉病廣泛分布于中國溫暖潮濕或半潮濕地區(qū)，多發(fā)于長江中下游冬麥區(qū)、川滇冬麥區(qū)及華南冬麥區(qū)，對小麥生產(chǎn)的危害甚大^[2]。1993-2001年，赤霉病給美國小麥和大麥生產(chǎn)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)7.67×10⁹美元^[3]。赤霉病在帶來產(chǎn)量損失的同時，引發(fā)小麥赤霉病的鐮刀菌所產(chǎn)生的DON（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇）、NIV（雪腐鐮刀菌烯醇）、ZEN（玉米赤霉烯酮）等真菌毒素在糧食中存在，會使得人類或動物食用后出現(xiàn)嘔吐、懷孕母畜中毒后流產(chǎn)等癥狀^[2]。DON、NIV等毒素能影響真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)、DNA、RNA的合成以及線粒體功能、細(xì)胞分裂、膜功能等，從而對人和動物的健康與免疫產(chǎn)生抑制作用^[4]。1998年，國際癌癥機(jī)構(gòu)公布的評估報告中，DON被列為第3類致癌物，與人類食管癌、IgA腎病、胃癌和骨關(guān)節(jié)病有關(guān)^[4]。小麥赤霉病的流行主要是由于稻樁或土壤中的腐殖質(zhì)殘留攜帶鐮刀菌，在合適的氣候環(huán)境下爆發(fā)引起的。土壤中如富含抑制禾谷鐮刀菌的微生物，將有利于控制赤霉病的流行^[5-9]。使用化學(xué)殺菌劑是目前麥類生產(chǎn)中控制赤霉病的主要方法^[10]，但是長期使用化學(xué)農(nóng)藥一方面容易導(dǎo)致禾谷鐮刀菌產(chǎn)生抗藥性，另一方面還會帶來農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題。因此，篩選出具有抑制赤霉病病菌等多種病原真菌的廣譜拮抗菌，研制微生物農(nóng)藥對促進(jìn)和提升小麥生產(chǎn)具有現(xiàn)實意義。

微生物農(nóng)藥具有易降解、無污染、無殘留的特點，符合國家綠色生產(chǎn)的需求，已經(jīng)在綠色農(nóng)產(chǎn)品和有機(jī)農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中得到應(yīng)用^[11-13]。目前，微生物農(nóng)藥研究比較多的菌種為解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、多黏類芽孢桿菌^[14-17]等。近年來，無色桿菌引起了眾多研究人員的重視。無色桿菌一方面可以產(chǎn)生廣譜抗生素，對歐文氏菌、白色念球菌、肺炎克雷伯菌等具有較強的抑菌活性^[18-19]，另一方面也可以分泌殺蟲蛋白，對害蟲生物防治同樣具有良好的應(yīng)用價值^[20]。此外，無色桿菌在環(huán)境保護(hù)中也有很好的應(yīng)用價值，常用于土壤或廢水中、農(nóng)藥殘留、染料等有害物質(zhì)的降解^[21-22]。本研究從福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所小麥赤霉病自然抗性鑒定圃中土壤、小麥植株根部及鑒定圃周邊植物的根系中分離出具有廣譜抑制真菌活性的菌株，根據(jù)形態(tài)特征觀察、生理生化反應(yīng)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定其種屬及分類地位。進(jìn)一步通過田間試驗測定其對小麥赤霉病的防治效果和對DON、ZEN、NIV等毒素生成的抑制作用，為該菌株的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 拮抗菌菌株和真菌菌株 拮抗菌菌株分離自福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所小麥赤霉病自然抗性鑒定圃表層下5～20 cm深度的土樣、鑒定圃中供試小麥品種的根部及鑒定圃周圍的植物根部。供試的12株病原真菌菌株編號和具體來源見表1。

1.1.2 供試的化學(xué)藥劑 60.0%戊唑多菌靈水分散粒劑和32.5%苯甲嘧菌酯懸浮劑由河北冠龍農(nóng)化有限公司生產(chǎn)，40.0%氟硅唑乳油由陜西標(biāo)正作物科學(xué)有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 供試小麥品種 高感赤霉病的冬小麥揚輻麥4號，由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

1.1.4 培養(yǎng)基配制 NA（細(xì)菌）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g，定容至1 000 ml，pH 值7.3。NB（細(xì)菌）培養(yǎng)液：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、定容至1 000 ml、pH 值7.3。PDA培養(yǎng)基（真菌或細(xì)菌）：馬鈴薯250 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、定容至1 000 ml。紅糖豆粉發(fā)酵液：紅糖23.3 g、CaCO₃4.9 g、豆粉11.1 g、KNO₃8.0 g、KH₂PO₄0.5 g、K₂HPO₄1.2 g、MgSO₄·7H₂O 5.0 g、NaCl 3.0 g、定容至1 000 ml。

1.1.5 微生物菌液助劑配方 添加劑配方為濕潤劑D425 （烷基磺酸縮聚物）4.8%，分散劑PVA（聚乙烯醇）7.2%，保護(hù)劑FWA（熒光增白劑）0.1%，穩(wěn)定劑CMC-Na（羧甲基纖維素鈉）2.0%^[23]。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌菌株的分離和純化 土壤樣品中的菌株采用稀釋涂布平板法分離^[24]，植物根部內(nèi)生菌采用表面消毒法進(jìn)行分離^[25]。得到的拮抗菌菌株進(jìn)行編號，2次單菌落劃線純化，純化后的菌株采用甘油法保藏于-80 ℃冰箱。

1.2.2 拮抗菌菌株的篩選及拮抗譜的測定 分離的菌株采用劃線平板對峙法進(jìn)行拮抗菌菌株篩選。選擇表1中的12個真菌作為靶標(biāo)病原真菌。先挑取純化后的細(xì)菌菌落在對應(yīng)的PDA或NA培養(yǎng)基上活化，挑取靶標(biāo)病原真菌新鮮菌塊接種到PDA或NA培養(yǎng)基（直徑6 cm培養(yǎng)皿）的中央，再以靶標(biāo)病原真菌菌株的菌絲塊為中心，對拮抗細(xì)菌菌落畫邊長為4 cm的正方形方框^［26］，以只接種靶標(biāo)病原真菌作為對照；于28 ℃下培養(yǎng)5～7 d，觀察生長情況，篩選出的拮抗效果好的菌株進(jìn)行抑菌譜測定，測量抑菌帶寬度和菌落直徑，計算抑菌效果。

1.2.3 拮抗菌的鑒定 菌落形態(tài)特征觀察：純化后的菌株用NB培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，取100 μl菌液用無菌水稀釋1 000倍，取100 μl均勻涂布于PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察單菌落的形態(tài)特征^[27]。菌體形態(tài)采用革蘭氏染色法染色后，在1 000倍顯微鏡下用帶刻度尺的載玻片進(jìn)行觀察。

16S rDNA序列同源性鑒定：結(jié)合菌落特征和菌體形態(tài)對菌株進(jìn)行初步分類，對菌株進(jìn)行16S rDNA序列測定，DNA提取由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。PCR所用的引物融合了Miseq測序平臺的V3-V4通用引物805R（上游引物5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′，下游引物5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）和341F（上游引物5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3′，下游引物5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）。PCR 反應(yīng)體系：2×Taq master Mix 15 μl，Bar-PCR primer F（10 μmol/L） 1 μl，Primer R （10 μmol/L） 1 μl，Genomic DNA 20 ng，加H₂O至 30 μl。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，25次循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。DNA序列測定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。16S rDNA 序列在核糖體數(shù)據(jù)庫（http：//rdp.cme.msu.edu/index.jsp）中進(jìn)行BLAST比對，利用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

生理生化測試：對具有生防潛力的菌株進(jìn)一步開展D-葡萄糖、D-木糖、乳糖、蔗糖、纖維素利用及耐鹽性、水解淀粉、甲基紅試驗、V-P反應(yīng)、H₂S產(chǎn)生、纖維素利用、42 ℃生長、厭氧生長等生理生化指標(biāo)測試。

1.2.4 拮抗菌對小麥赤霉病田間防效及小麥籽粒毒素測定 拮抗菌對小麥赤霉病田間防效試驗于2020-2021年度在福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗基地進(jìn)行。該基地有全國冬小麥國家區(qū)試赤霉病自然抗性鑒定圃，赤霉病常年自然發(fā)生，無需接種赤霉病菌。冬小麥品種揚輻麥4號于11月16日播種，次年2月11日始穗，2月14日始花。試驗設(shè)拮抗菌發(fā)酵液（按微生物菌液助劑配方配置）灌根、拮抗菌發(fā)酵液穗部噴霧、60%戊唑多菌靈水分散粒劑穗部噴霧、32.5%苯甲嘧菌酯穗部噴霧、40%氟硅唑穗部噴霧5個處理及清水穗部噴霧對照。施藥前用平板血球計數(shù)法檢測菌液的有效菌含量，穗部噴施發(fā)酵液有效成分含量為1.5×10¹³CFU/hm²，土壤灌根澆施有效成分含量3.0×10¹³CFU/hm²。灌根處理在小麥?zhǔn)妓肫诠喔?次，噴霧處理分別在始穗期、始花期和盛花期各噴施1次，每個小區(qū)20 m²，3次重復(fù)。4月15日小麥成熟后調(diào)查赤霉病發(fā)病情況，各處理選取病麥粒1 kg，3次重復(fù)，委托中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所對小麥籽粒的DON、ZEN、NIV毒素含量進(jìn)行檢測。各處理防效的計算按下式進(jìn)行：

防效=（清水對照下的病小穗率-處理下病小穗率）/清水對照下的病小穗率×100%

1.2.5 數(shù)據(jù)處理和分析 采用IBM SPSS Statistics 19軟件選擇單因素方差分析、方差同質(zhì)性檢測和Waller-Duncan的選項進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的篩選

本試驗共分離出18株拮抗菌菌株，16S rDNA序列測定均為細(xì)菌，18株拮抗菌菌株對12種病原真菌的抗菌譜結(jié)果見表2。其中，枯草芽孢桿菌（D01）、多黏類芽孢桿菌（D04、D17）、木糖氧化無色桿菌（D09、D11）、越南伯克霍爾德氏菌屬（D12）、洋蔥伯克霍爾德氏菌屬（D14）等7株菌株對小麥赤霉病等病原真菌表現(xiàn)出廣譜拮抗效果，而菌株D09木糖氧化無色桿菌的抑制作用明顯高于其他6株菌菌株。此外，表2中有3株木糖氧化無色桿菌D08、D09和D11，但3者卻表現(xiàn)出不同的抑菌效果。

2.2 拮抗菌D09的鑒定

2.2.1 拮抗菌D09的形態(tài)學(xué)觀察 篩選出的廣譜抗病原真菌的木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）D09為赤霉病鑒定圃周邊生長多年的吊蘭根系中分離，中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏號為M20211002。菌株在PDA固體培養(yǎng)基上生長時，表面濕潤、淡黃色、光滑、透明、微隆起、邊緣較整齊、膠狀、黏性強；革蘭氏染色陰性，1 000倍顯微鏡下觀察菌體短桿狀（圖1），長度為2.0～4.0 μm，寬度為0.5～0.9 μm。

2.2.2 拮抗菌D09的的生理生化特性 拮抗菌D09能利用D-葡萄糖、D-木糖、乳糖、蔗糖等多種碳源，產(chǎn)酸，能利用纖維素，明膠液化速度快，其他生理生化特征見表3。

2.2.3 拮抗菌D09的分子鑒定 拮抗菌D09的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2。16S rDNA的堿基序列長度為1 469 bp，在GenBank的登錄號為CP012046.1。根據(jù)BLAST比對結(jié)果，并結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特性，鑒定該菌株為木糖氧化無色桿菌（Achromobacter xylosoxidans）。

2.3 木糖氧化無色桿菌D09的抑菌譜

木糖氧化無色桿菌D09對12種病原真菌的抑菌效果如圖3所示。D09菌株對所有測試的病原真菌均有不同程度的拮抗作用，表現(xiàn)出廣譜抗病原真菌的特性。其中，對水稻紋枯病立枯絲核菌、蘆筍頸枯病菌、香蕉褐緣灰斑病菌和大豆炭疽病菌的抑制率均達(dá)到70%以上（表4）。

2.4 木糖氧化無色桿菌D09對小麥赤霉病的田間防治效果

不同處理對小麥赤霉病的田間防治效果如表5。除戊唑多菌靈和苯甲嘧菌酯處理下的赤霉病病穗率比噴清水對照有顯著降低，其他處理病穗率均在95.00%以上，與對照無顯著差異。而各處理下病小穗率均顯著低于噴清水對照；木糖氧化無色桿菌D09發(fā)酵液灌根處理和穗部噴霧處理后，病小穗率分別為14.42%和21.42%，比CK下降50.93%和27.12%；其中D09發(fā)酵液灌根處理病小穗率與苯甲嘧菌酯和氟硅唑穗部噴霧處理相當(dāng)?；瘜W(xué)藥劑的防效大多在60%以上，而木糖氧化無色桿菌D09發(fā)酵液灌根處理和穗部噴霧處理的防效分別為50.93%和27.12%。

2.5 木糖氧化無色桿菌D09對小麥籽粒毒素含量的影響

不同處理下小麥籽粒DON、ZEN、NIV 3種毒素含量檢測結(jié)果如表6所示。木糖氧化無色桿菌D09發(fā)酵液灌根處理小麥籽粒3種毒素的含量分別為0.628 mg/kg、0.016 mg/kg、1.308 mg/kg，穗部噴施D09發(fā)酵液處理小麥籽粒3種毒素的含量分別為0.836 mg/kg、0.080 mg/kg、2.688 mg/kg，均顯著低于噴清水對照；D09發(fā)酵液灌根處理小麥籽粒3種毒素的含量均低于穗部噴施D09發(fā)酵液處理；D09發(fā)酵液灌根處理小麥籽粒DON毒素含量低于苯甲嘧菌酯穗部噴霧處理，與氟硅唑穗部噴霧處理相當(dāng)；D09發(fā)酵液灌根處理小麥籽粒ZEN、NIV毒素含量與戊唑多菌靈穗部噴霧、苯甲嘧菌酯穗部噴霧、氟硅唑穗部噴霧處理相當(dāng)。

3 討論

3.1 無色桿菌屬抑菌功能屬性的發(fā)現(xiàn)

目前，國內(nèi)外對無色桿菌研究主要在于其抑菌活性及降解農(nóng)藥殘留、染料等功能方面^[28-36]，本研究在篩選鑒定木糖氧化無色桿菌菌株D09的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析了菌株D09對小麥赤霉病的田間防治效果及小麥籽粒毒素含量的影響，為無色桿菌的農(nóng)業(yè)應(yīng)用進(jìn)行了初步嘗試。木糖氧化無色桿菌菌株D09已申請國家發(fā)明專利（申請?zhí)枺?021110421242）。

3.2 微生物農(nóng)藥防治效果低于化學(xué)農(nóng)藥的探討

本研究結(jié)果表明，木糖氧化無色桿菌D09發(fā)酵液灌根處理，雖然病穗率與清水對照差異不大，但病小穗率和防效與常用化學(xué)藥劑苯甲嘧菌酯穗部噴霧、氟硅唑穗部噴霧等處理相當(dāng)，而D09發(fā)酵液穗部噴霧處理雖然防治效果只有27.12%，但病小穗率亦顯著低于清水對照，說明木糖氧化無色桿菌D09能有效抑制赤霉病病菌在穗部的擴(kuò)散?？傮w來說，木糖氧化無色桿菌D09發(fā)酵液處理的防效不及化學(xué)殺菌劑，這與拮抗菌的作用機(jī)制及其對環(huán)境的敏感性有關(guān)。研究中D09灌根處理和穗部噴霧處理之間在病小穗率和防效上亦有一定差異，這說明不同施用方式對拮抗菌在田間的定殖有較大影響。木糖氧化無色桿菌D09在田間定殖情況及其與化學(xué)殺菌劑復(fù)配使用方法還需要進(jìn)一步研究。

3.3 菌株D09對小麥籽粒毒素含量的探討

本研究結(jié)果顯示微生物農(nóng)藥或化學(xué)藥劑對毒素的抑制效果和對赤霉病的防治效果不完全同步。如苯甲嘧菌酯穗部噴霧處理對赤霉病的控制效果高于D09發(fā)酵液灌根，防效達(dá)77.78%，但小麥籽粒3種毒素含量卻高于D09發(fā)酵液灌根處理。Magan等研究結(jié)果表明，嘧菌酯降低了小麥赤霉病的發(fā)病率，但其處理過的小麥籽粒DON毒素含量較高，可能與嘧菌酯使用導(dǎo)致毒素累積有關(guān)^[37]；本研究中嘧菌酯處理后DON等毒素含量雖比對照有所減少，但和其他藥劑相比，嘧菌酯對毒素的產(chǎn)生和累積的抑制效果較低。D09發(fā)酵液處理對小麥籽粒DON、ZEN、NIV 3種毒素含量的控制機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

致謝： 衷心感謝葛桂梅、黃繼平、洪紅升等同事對該試驗給予的無私幫助！

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（責(zé)任編輯：石春林）