蘇神合劑揮發(fā)性成分分析

陳偉韜，張靖年，肖觀林，李養(yǎng)學(xué)，楊敏娟，邱錦燕，陳昭，李素梅

[1.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405]

廣東氣候炎熱潮濕，因濕熱致病的患者較多，為滿足臨床需求，廣東省第二中醫(yī)院基于本院多年治療濕熱證的臨床驗(yàn)方“蘇神方”[1-3]開發(fā)了院內(nèi)制劑蘇神合劑，具有芳香健脾、化濕止瀉的功效。本制劑氣香，處方由紫蘇葉、六神曲、豆蔻、陳皮、蒼術(shù)、甘草等組成，其中君藥紫蘇葉、臣藥豆蔻、蒼術(shù)富含揮發(fā)油，當(dāng)中成分多與芳香化濕的治療目的相關(guān)[4-13]，但目前未有針對本品揮發(fā)性成分的研究報(bào)道。本研究通過水蒸氣蒸餾法對蘇神合劑中揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，采用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）檢測結(jié)合保留指數(shù)、對照品確認(rèn)及歸屬成分來源藥味等方式，分析蘇神合劑揮發(fā)性成分，通過多批樣品檢測，確定共有成分，以期為篩選蘇神合劑質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)成分提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890B-7000D 氣相-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2 試藥

檸檬烯（批號：100470-201503，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：96.0%）、桉油精（批號：110788-201707，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：100.0%）、芳樟醇（批號：111503-202004，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；α-蒎烯（批號：AF21081709，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%）、β-蒎烯（批號：AF20122009，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：95%）、紫蘇烯（批號：AFBG0515，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%）、L-α-松油醇（批號：AF20081520，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：97%）、紫蘇醛（批號：AF21041412，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%）、β-石竹烯（批號：AF20032353，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%）均購自成都埃法生物科技公司；34種正構(gòu)烷烴（C7-C40）混合對照品溶液（批號：D0018994，質(zhì)量濃度：1 000 μg/mL）購自北京曼哈格生物技術(shù)公司。

紫蘇葉（批號：220501，產(chǎn)地：廣東，生產(chǎn)日期：20220526）、蒼術(shù)（批號：220601，產(chǎn)地：安徽，生產(chǎn)日期：20220615）購自廣東天泰藥業(yè)公司；豆蔻（批號：220401，產(chǎn)地：云南，生產(chǎn)日期：20220419）購自廣州至信中藥飲片公司；陳皮（批號：C1722213，產(chǎn)地：廣東，生產(chǎn)日期：20220711）購自廣東省藥材公司，經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）李素梅副主任中藥師和張靖年主管中藥師鑒定紫蘇葉為唇形科植物紫蘇Perillafrutescens（L.）Britt.的干燥葉、蒼術(shù)為菊科植物茅蒼術(shù)Atracty‐lodeslancea（Thunb.）DC.、豆蔻為姜科植物白豆蔻AmomumkravanhPierre ex Gagnep.、陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco的干燥成熟果皮。

蘇神合劑（批號：190801、190802、190803、210101、210102、210103、220701、220801、220802、220803）由廣東省第二中醫(yī)院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液的制備

量取本品100 mL，置250 mL 圓底燒瓶中，連接揮發(fā)油提取器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶為止，再加環(huán)己烷2 mL，按揮發(fā)油測定法（《中國藥典》2020年版四部通則2204）測定，保持微沸3 h，放冷，分取環(huán)己烷層，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶，測定器中水液用乙酸乙酯2 mL 振搖提取，乙酸乙酯液并入同一量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，置填充有無水硫酸鈉的0.22 μm 針筒微孔濾膜濾過，即得。

2.2 各藥味揮發(fā)性成分的提取

依處方分別取紫蘇葉、豆蔻、陳皮、蒼術(shù)等適量，加水100 mL，按“2.1”項(xiàng)自“分取環(huán)己烷層……”同法操作，置填充有無水硫酸鈉的0.22 μm 針筒微孔濾膜濾過，分別制成紫蘇葉、豆蔻、陳皮、蒼術(shù)揮發(fā)性成分提取溶液。

2.3 對照品溶液的制備

取α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、桉油精、芳樟醇、紫蘇烯、L-α-松油醇、紫蘇醛、β-石竹烯適量，加乙酸乙酯配成含各成分質(zhì)量濃度為200 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.4 儀器條件

2.4.1 氣相色譜條件 HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；分流比30∶1；載氣為高純氦氣（≥99.999%）；載氣流速1 mL/min；程序升溫：初始溫度70 ℃，保持3 min，以3 ℃/min的速率升溫至280 ℃，保持3 min。

2.4.2 質(zhì)譜條件 離子源為電子轟擊源（EI），離子源溫度280 ℃，能量70 eV。質(zhì)譜傳輸線溫度280 ℃。溶劑延遲4 min。質(zhì)譜監(jiān)測模式MS1 掃描模式，掃描范圍為50～550m/z，增益5。

2.5 成分鑒定和藥味歸屬

2.5.1 保留指數(shù)（IR） 取待測溶液和正構(gòu)烷烴（C7-C40）混合對照品溶液，測定結(jié)果按積分查找化合物，記錄各主要化合物的質(zhì)譜峰保留時(shí)間，按以下公式計(jì)算各化合物保留指數(shù)IR：

式中：IR為目標(biāo)化合物的保留指數(shù)；n為正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；Tx為目標(biāo)化合物的保留時(shí)間，min；Tn和Tn+1分別為碳原子數(shù)為n、n+1 的正構(gòu)烷烴的保留指數(shù)，min，且Tn+1＞Tx＞Tn。

2.5.2 化合物的鑒定和篩選 通過儀器工作站MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 比對NIST 14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，檢索各化合物質(zhì)譜圖得分高于50的匹配結(jié)果，再運(yùn)用MS search 2.2 檢索，以保留指數(shù)、匹配度篩選結(jié)果。

2.5.3 化合物的藥味歸屬 取各藥味樣品溶液測定，檢索鑒定化合物，分析蘇神合劑揮發(fā)性成分的來源藥味，驗(yàn)證化合物篩選結(jié)果。

2.5.4 對照品的確認(rèn) 選取部分主要化合物對照品進(jìn)行測定，確認(rèn)化合物鑒定結(jié)果。

2.6 成分分析結(jié)果

取本品（批號：210103）按“2.1”項(xiàng)方法制備樣品提取溶液，取各藥味按“2.2”項(xiàng)方法制備各藥味揮發(fā)性成分提取溶液，取“2.3”項(xiàng)下制備的對照品溶液，分別按“2.4”項(xiàng)方法測定，按“2.5”項(xiàng)方法進(jìn)行蘇神合劑揮發(fā)性成分鑒別和藥味歸屬分析，采用峰面積歸一化法計(jì)算成分相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖1－2、表1。

表1 蘇神合劑揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 1 Analysis results of volatile components in Sushen mixture

圖1 蘇神合劑樣品溶液和各藥味提取溶液總離子流圖Figure 1 TIC of Sushen mixture sample and ingredient samples

圖2 對照品對照總離子流圖Figure 2 TIC of reference substance confirmation

通過儀器工作站軟件共分離出177 個(gè)化合物，經(jīng)進(jìn)一步篩選確認(rèn)，共鑒定出29 種揮發(fā)性成分，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總量（按峰面積歸一化計(jì)算）的90.56%，其中桉油精為49.74%、β-石竹烯為11.92%、檸檬烯為9.92%，是樣品中含量最高的3 個(gè)化合物，并均以對照品確認(rèn)。

2.7 多批樣品揮發(fā)性成分分析

取其余9 個(gè)批次樣品，參照“2.6”項(xiàng)方法以水蒸氣蒸餾法提取、檢測并分析成分，結(jié)果見表2?？梢姡?0 批樣品含有22 個(gè)共有成分，桉油精為各批樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的化合物。

表2 各批蘇神合劑揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 2 Analysis results of volatile components in different batches of Sushen mixture

3 討論

3.1 GC-MS結(jié)合保留指數(shù)法分析化合物

質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對能夠快速定性化合物，但對于同分異構(gòu)體，如蘇神合劑中的α-蒎烯與β-蒎烯、β-石竹烯與葎草烯（α-石竹烯）、α-松油烯與γ-松油烯等，譜圖信息相似，難以準(zhǔn)確匹配。此外，本品為合劑，藥味多，成分復(fù)雜，干擾較大，不利于譜圖比對。保留指數(shù)法是氣相色譜經(jīng)典的化合物定性方法，通過保留指數(shù)進(jìn)行定性，結(jié)合質(zhì)譜信息，有利于提高化合物鑒定的準(zhǔn)確性[14-16]。本研究中，各化合物實(shí)測IR與數(shù)據(jù)庫IR相差均不超過5，且部分化合物通過對照品確認(rèn)，準(zhǔn)確性較高。

3.2 化合物成分來源藥味歸屬

蘇神合劑中紫蘇葉、陳皮、豆蔻、蒼術(shù)，是本制劑揮發(fā)性成分的主要來源。鑒定的29 種化合物確認(rèn)歸屬為紫蘇葉、陳皮、豆蔻、蒼術(shù)的分別為15 種、17 種、17 種和14 種，其中β-石竹烯主要來源于紫蘇葉、檸檬烯主要來源于陳皮、桉油精主要來源于豆蔻，是蘇神合劑最主要的揮發(fā)性成分。紫蘇醛、紫蘇烯為紫蘇葉揮發(fā)油的特征成分，但工作站軟件未鑒定出該兩種化合物，經(jīng)對照品確認(rèn)，樣品中未檢出紫蘇烯，而紫蘇醛含量低，質(zhì)譜圖受干擾，難以通過譜圖匹配。依《中國藥典》2020 年版一部，豆蔻仁含桉油精不得少于3.0 %，紫蘇葉應(yīng)檢出紫蘇醛薄層色譜斑點(diǎn)，關(guān)于β-石竹烯、紫蘇烯、檸檬烯等對應(yīng)品種項(xiàng)下未作規(guī)定。本品原料符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但未對相關(guān)成分進(jìn)行考察和控制，可能導(dǎo)致了各批樣品中成分含量存在差異，擬提高原料內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)以更好地控制本品質(zhì)量。

3.3 不同提取方法的比較

本研究比較了水蒸氣蒸餾（SD）、乙醚萃取（DE）、環(huán)己烷萃?。–E）、乙酸乙酯萃?。‥E）、頂空加熱溶劑萃?。℉S）等不同樣品提取方法，其中水蒸氣蒸餾提取法樣品鑒定的29 種化合物，質(zhì)譜響應(yīng)高、干擾少；乙醚萃取、環(huán)己烷萃取、乙酸乙酯萃取的樣品分別鑒定出18、20、18種化合物；頂空加熱溶劑萃取法因進(jìn)樣方法受樣品量（頂空瓶體積）和樣品基質(zhì)（水）限制，樣品中僅桉油精峰質(zhì)譜響應(yīng)明顯，故選擇水蒸氣蒸餾法提取蘇神合劑揮發(fā)性成分，見圖3－4。

圖3 不同方法提取蘇神合劑揮發(fā)性成分樣品總離子流圖Figure 3 TIC of Sushen mixture samples processed by different methods

圖4 不同提取方法質(zhì)譜總峰面積對比圖Figure 4 Comparison of mass spectra total peak area of samples processed by different methods

本研究通過GC-MS 結(jié)合保留指數(shù)方法進(jìn)行化合物鑒別，為蘇神合劑針對其揮發(fā)性成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高、制劑工藝優(yōu)化篩選指標(biāo)成分、制劑穩(wěn)定性考察提供參考，也為進(jìn)一步研究蘇神合劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。同時(shí)本研究還進(jìn)行了成分藥味歸屬分析，對于制劑藥材原料質(zhì)量控制和深入研究蘇神方組方具有一定指導(dǎo)意義。