錦燈籠配方顆粒UPLC指紋圖譜研究

唐雙燕，魏家保，趙偉志，鄭曉英，張輝，譚沛

（1.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518000；2.華潤三九現(xiàn)代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000）

錦燈籠為茄科植物酸漿Physalis alkekengiL.var.franchetii（Mast.）Makino 的干燥宿萼或帶果實(shí)的宿萼。秋季果實(shí)成熟、宿萼呈紅色或橙紅色時(shí)采收，干燥[1]。錦燈籠中的化學(xué)成分主要含有甾體、黃酮、氨基酸、生物堿及其他類型化合物[2-4]。其中甾體類、黃酮類為其主要成分，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、降血糖等藥理作用[5-6]。甾體類化合物是近十年來在錦燈籠植物中發(fā)現(xiàn)最多的一類化學(xué)成分，主要包括酸漿苦味素類、新酸漿苦味素類和甾醇類化合物，其中以酸漿苦味素類居多且為其特征性化學(xué)成分；黃酮類化合物也是錦燈籠中發(fā)現(xiàn)比較多的成分之一，包括木犀草苷、木犀草素等[7]。

傳統(tǒng)湯劑存在服用、存儲、攜帶不便等問題。中藥配方顆粒和傳統(tǒng)湯劑相比具有質(zhì)量穩(wěn)定、療效可靠、服用方便、便于攜帶保管等優(yōu)勢[8-10]。近年來，對錦燈籠的指紋圖譜研究也有報(bào)道[11-13]，但大多集中在錦燈籠藥材的質(zhì)量控制研究方面，另有邢海燕等[14]僅對錦燈籠飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜進(jìn)行研究，許亮等[15]建立了錦燈籠配方顆粒的木犀草素含量測定方法，均無針對錦燈籠配方顆粒的指紋圖譜研究，因此本研究采用超高效液相色譜（UPLC）法建立錦燈籠配方顆粒的指紋圖譜，通過共有峰指認(rèn)，分析不同產(chǎn)地的配方顆粒化學(xué)成分差異，從共同監(jiān)控多種特征性成分的角度出發(fā)，建立錦燈籠配方顆粒指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)，為錦燈籠配方顆粒質(zhì)量的整體評價(jià)提供思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜儀：Thermo Fisher Vanquish UPLC 色譜系統(tǒng)，配置四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、色譜柱溫箱、二極管陣列紫外檢測器、Chromeleon 色譜管理系統(tǒng)；AB Sciex Triple TOF 4600 高分辨質(zhì)譜儀和Analyst質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件；ME36S百萬分之一天平（瑞士梅特勒）；XS204 十萬分之一天平（瑞士梅特勒）；SK5200H 超聲波儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑試藥

錦燈籠對照藥材（批號：DST181212-026）購于成都德斯特生物技術(shù)有限公司；對照品木犀草苷（批號：111720-202111，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：96.6%）、木犀草素（批號：111520-202006，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：94.4%）、酸漿苦味素L（批號：111831-201903）購于中國食品藥品檢定研究院；對照品酸漿苦味素A（批號：CFS202002，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.0%）、4，7-二脫氫新酸漿苦素B（批號：CFS202102，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.0%）購于Chemfaces 公司。乙腈為色譜純，水為超純水；磷酸、甲醇、乙酸乙酯等其他試劑均為分析純。

1.3 樣品及制備方法

15 批錦燈籠藥材分別來源于遼寧省撫順、黑龍江省哈爾濱、吉林省遼源、陜西省西安、山西省臨汾。經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)劉守金教授鑒定為茄科植物酸漿P.alkekengiL. var.franchetii（Mast.）Makino的干燥宿萼或帶果實(shí)的宿萼。詳細(xì)信息見表1。

表1 樣品信息及編號Table 1 Sample information and number

錦燈籠配方顆粒制備方法：取錦燈籠飲片4 000 g，加8倍量水，浸泡30 min，武火煮沸，再文火煎煮30 min，200 目濾布過濾；藥渣再加6 倍量水煎煮25 min，合并2 次濾液，經(jīng)70 ℃減壓濃縮至相對密度1.06～1.12 g/mL 的流浸膏，噴霧干燥（進(jìn)風(fēng)溫度：150～210 ℃，出風(fēng)溫度：70～115 ℃），加麥芽糊精至1 000 g，混勻，制粒，即得錦燈籠配方顆粒（15 批飲片按此方法制備得到15 批次的配方顆粒，每1 g 顆粒相當(dāng)于4 g飲片）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為CORTECS UPLC T3（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）和0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，15%A→17%A；7～15 min，17%A→25%A；15～30 min，25%A→28%A；30～32 min，28%A→38%A；32～40 min，38%A→42%A），檢測波長220 nm，柱溫25 ℃，流速0.30 mL·min-1，進(jìn)樣量為3 μL，理論板數(shù)按木犀草苷計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.2 參照物溶液的制備

稱取錦燈籠對照藥材1.021 g，置具塞錐形瓶中，加水25 mL，加熱回流40 min，取出，濾過，用乙酸乙酯萃取兩次，每次25 mL，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，放冷，殘?jiān)?0%甲醇水溶液10 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，取續(xù)濾液作為對照藥材參照物溶液。另稱取木犀草苷4.013 mg、木犀草素4.022 mg、酸漿苦味素A 2.479 mg、酸漿苦味素L 2.577 mg、4，7-二脫氫新酸漿苦素B 2.396 mg，分別加甲醇定容于100 mL 的容量瓶中，作為對照品參照物溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取錦燈籠配方顆粒0.4 g，加水10 mL 使溶解，用乙酸乙酯萃取兩次，每次10 mL，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，殘?jiān)?0%甲醇水溶液10 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號：S1），連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD，結(jié)果表明，11 個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD 均小于2%。綜合判斷，方法的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號：S1），制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD 結(jié)果表明，11 個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD均小于2%。綜合判斷，方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液（批號：S1），配制后在第0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣。記錄色譜圖，計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD。結(jié)果表明，11 個(gè)特征峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積RSD均小于2%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 特征峰指認(rèn) 色譜條件：參照“2.1”項(xiàng)下，將“0.2%磷酸水溶液（B）”優(yōu)化為“0.2%甲酸水溶液（B）”。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源，正、負(fù)離子監(jiān)測模式；噴霧裂解電壓3.80 kV；輔助氣流量10 mL/min；毛細(xì)管溫度350 ℃；輔助氣溫度350 ℃；掃描模式Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS 分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500；正負(fù)離子模式下的碰撞能均為10 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 700。MS/MS 模式時(shí)，正負(fù)離子模式下的碰撞能均為20 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 250。

參照上述色譜及質(zhì)譜條件，分別吸取“2.2”項(xiàng)參照物溶液和“2.3”項(xiàng)供試品溶液，對15 批錦燈籠配方顆粒UPLC 指紋圖譜11 個(gè)共有色譜峰成分進(jìn)行定性分析，以正、負(fù)離子模式掃描供試品，得供試品溶液的ESI-MS 總離子流，見圖1。結(jié)合文獻(xiàn)[16-19]報(bào)道和二級質(zhì)譜裂解碎片的離子信息對特征峰進(jìn)行識別，經(jīng)對照品比對，確認(rèn)色譜峰1 為木犀草苷，色譜峰3 為木犀草素，色譜峰4 為酸漿苦味素A，色譜峰6 為酸漿苦味素L，色譜峰10 為4，7-二脫氫新酸漿苦素B，定位結(jié)果見圖2。酸漿苦味素類化合物為酸漿屬植物的特征性化學(xué)成分，根據(jù)文獻(xiàn)[16-17，20]總結(jié)的裂解規(guī)律得出，該類化合物的質(zhì)譜裂解特征主要為丟失CO、CO2、H2O，產(chǎn)生[M-H-H2O]－、[M-H-2H2O]－、[M-H-H2O-CO]－、[M-H-H2O-2CO2]－以及發(fā)生RDA 裂解和環(huán)的裂解而形成一系列特征離子峰?；诖?，對其余特征峰的鑒定分析數(shù)據(jù)列于表2，為后續(xù)特征成分峰的定性提供參考依據(jù)。

圖1 錦燈籠配方顆粒總離子流圖Figure 1 Total ion current diagrams of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

圖2 錦燈籠配方顆粒對照品定位液相色譜圖Figure 2 Reference location chromatograms of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

表2 錦燈籠配方顆粒成分分析結(jié)果Table 2 Results of composition analysis of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

2.5.2 指紋圖譜的建立 取“1.3”項(xiàng)下15 批錦燈籠藥材制備成錦燈籠配方顆粒，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”，將各色譜峰匹配，建立對照指紋圖譜，15 批錦燈籠配方顆粒對照指紋圖譜具有11 個(gè)特征峰，共有特征峰峰面積之總和占總峰面積91.4%，表明選定的11 個(gè)特征峰可以作為錦燈籠鑒定的標(biāo)志峰，見圖3。根據(jù)各峰響應(yīng)及藥效方面所具的代表性，選擇以峰1（木犀草苷）參照峰相應(yīng)的峰為S峰，計(jì)算特征峰2－11與S峰相對保留時(shí)間，相對保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±10%之內(nèi)，規(guī)定值為：2.23（色譜峰2）、2.75（色譜峰3）、3.52（色譜峰4）、3.69（色譜峰5）、4.07（色譜峰6）、4.26（色譜峰7）、4.46（色譜峰8）、4.61（色譜峰9）、5.45（色譜峰10）、6.32（色譜峰11）。

圖3 15批錦燈籠配方顆粒共有模式圖譜Figure 3 Common pattern chromatograms of 15 batches of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

2.6 相似度評價(jià)

中藥指紋圖譜相似度可以評價(jià)各待測樣品與能表征中藥產(chǎn)品化學(xué)組分特征的標(biāo)準(zhǔn)圖譜之間的差異化。將15 批錦燈籠配方顆粒圖譜中各色譜峰匹配后，建立對照指紋圖譜，計(jì)算得到各批次與對照圖譜的相似度在0.984～1.000，相似度極高，結(jié)果表明了15批次樣品的化學(xué)成分較為類似，沒有明顯的差異。結(jié)果見表3－5。

表3 15批錦燈籠配方顆粒相對保留時(shí)間結(jié)果Table 3 Results of relative retention time of 15 batches of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

表4 15批錦燈籠配方顆粒相對峰面積結(jié)果Table 4 Results of relative peak area of 15 batches of Physalis Calyxseuf Ructus formula granules

表5 相似度結(jié)果Table 5 Similarity results

2.7 聚類分析評價(jià)

采用SPSS 22.0 軟件，以共有峰的峰面積為變量，采用組間聯(lián)接法、歐平方式距離對15 批錦燈籠配方顆粒進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖4 所示。根據(jù)聚類分析結(jié)果，歐式間距小于5 時(shí)，15 批錦燈籠配方顆粒樣品可以分為4類：第1類為S7、S8、S9，藥材產(chǎn)地為山西省臨汾市洪洞縣；第2 類為S1、S2、S3，藥材產(chǎn)地為陜西省西安市藍(lán)田縣；第3 類為S4、S10、S11，藥材產(chǎn)地為遼寧省撫順市清原滿族自治縣和黑龍江省哈爾濱市依蘭縣；第4 類為S5、S6、S12、S13、S14、S15，藥材產(chǎn)地為吉林省遼源市東豐縣和黑龍江省哈爾濱市依蘭縣。當(dāng)歐式間距增大至15時(shí)，陜西省藍(lán)田縣和山西省洪洞縣樣品聚為一類，遼寧省清原滿族自治縣、黑龍江省依蘭縣和吉林省東豐縣樣品聚為一類，由聚類分析的結(jié)果可知，共有峰的峰面積與產(chǎn)地分布存在一定關(guān)聯(lián)，即藥材產(chǎn)地在地理位置上越接近，配方顆粒間的差異性越小。

圖4 系統(tǒng)聚類分析結(jié)果Figure 4 Results of systematic cluster analysis

2.8 主成分分析評價(jià)

采用SPSS 22.0 軟件，以11 個(gè)共有峰的峰面積為變量，進(jìn)行主成分的分析，結(jié)果見表6。根據(jù)特征值大于1 和貢獻(xiàn)率達(dá)到85%以上作為提取原則，提取的主成分1 的特征值為6.438，貢獻(xiàn)率達(dá)到58.525%，提取的主成分2 的特征值為3.245，貢獻(xiàn)率達(dá)到29.497%，這兩個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率達(dá)到了88.022%。對成分矩陣進(jìn)行了具有Kaiser 標(biāo)準(zhǔn)化的正交旋轉(zhuǎn)，見圖5，得到11個(gè)指標(biāo)（峰）在2個(gè)主成分旋轉(zhuǎn)成分矩陣。成分載荷矩陣的數(shù)值及符號代表變量在主成分當(dāng)中的載荷，載荷越大，表明該化合物在主成分分析中作用越大。由表7結(jié)果可知，峰1對主成分1的影響力較大，其中峰1為木犀草苷。峰4對主成分2的影響力較大，峰4為酸漿苦味素A。以主成分1-X軸為例，主成分1主要信息來自距離原點(diǎn)最遠(yuǎn)的峰1，而主成分2-Y 軸，距離原點(diǎn)最遠(yuǎn)的為峰4。綜上結(jié)果，提示木犀草苷和酸漿苦味素A 適宜作為錦燈籠配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行含量控制。

圖5 旋轉(zhuǎn)成分載荷圖Figure 5 Rotating component load diagram

表6 主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率Table 6 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components

表7 旋轉(zhuǎn)成分矩陣Table 7 Rotational component matrix

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對梯度洗脫條件、不同色譜柱［CORTECS UPLC T3（2.1 mm × 100 mm，1.6 μm）、SB RRHD C18（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm）、BEH Shield RP18（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）、CORTECS UPLC T3（2.1 mm × 150 mm，1.6 μm）］進(jìn)行篩選及優(yōu)化，CORTECS UPLC T3（2.1 mm × 100 mm，1.6 μm）色譜柱下峰信息量最為豐富，對不同柱溫（23、25、27 ℃）、不同流速（0.28、0.30、0.32 mL·min-1）進(jìn)行考察，流速為0.30 mL·min-1、柱溫為25 ℃時(shí)各特征峰分離最佳，并對不同儀器（Thermo Fisher Vanquish UPLC 和Agilent 1290Ⅱ）進(jìn)行驗(yàn)證，各特征峰較為一致且分離好，相對保留時(shí)間無偏差，同時(shí)采用二極管陣列檢測器（DAD）進(jìn)行全波段檢測，發(fā)現(xiàn)在220 nm 處，色譜峰數(shù)較多且響應(yīng)值較好。最終選擇色譜條件流動(dòng)相乙腈-0.2% 磷酸水溶液，流速0.30 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測波長220 nm。

在供試品制備方法考察中對比了不同提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、50%乙醇）、不同萃取溶劑（乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚、正丁醇）。三氯甲烷、乙醚因極性過低，導(dǎo)致萃取時(shí)特征峰缺失。水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇提取，乙酸乙酯、正丁醇萃取所得特征峰數(shù)量最多且基本一致，均呈現(xiàn)11 個(gè)特征峰，共有峰峰面積占總峰面積90%以上，能較好地代表錦燈籠配方顆粒整體質(zhì)量，并指認(rèn)了其中5個(gè)共有峰，分別為木犀草苷、木犀草素、酸漿苦味素A、酸漿苦味素L、4，7-二脫氫新酸漿苦素B。但經(jīng)乙酸乙酯萃取富集后的圖譜基線平穩(wěn)，特征峰更容易辨別和指認(rèn)，因此最終確定了使用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，圖譜較為全面的展現(xiàn)了錦燈籠中的甾體類和黃酮類主要化學(xué)成分信息，可用于錦燈籠配方顆粒的質(zhì)量監(jiān)測。

綜上所述，通過建立錦燈籠配方顆粒UPLC 指紋圖譜，以相似度結(jié)合特征峰的相對保留時(shí)間，并使用聚類分析和主成分分析法對不同產(chǎn)地的樣品生產(chǎn)制得的配方顆粒質(zhì)量進(jìn)行分析，來自山西、陜西、黑龍江、遼寧、吉林5 個(gè)產(chǎn)地的錦燈籠藥材制備的配方顆粒都具有11 個(gè)特征峰，相似度均大于0.980，說明不同產(chǎn)地的錦燈籠成分組成基本一致。由聚類分析的結(jié)果可知，共有峰的峰面積與產(chǎn)地分布存在一定關(guān)聯(lián)，即藥材產(chǎn)地在地理位置上越接近，配方顆粒所含的成分越接近。主成分分析的結(jié)果表明對錦燈籠的質(zhì)量控制研究可首要關(guān)注木犀草苷和酸漿苦味素A 的差異，二者可作為錦燈籠配方顆粒質(zhì)量控制的質(zhì)量標(biāo)志物。本研究為錦燈籠配方顆粒的質(zhì)量評價(jià)和質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。