藍苓解毒顆粒的質(zhì)量標準研究

熊青，何佳瑩，楊敏

（江西中醫(yī)藥大學附屬生殖醫(yī)院，江西 南昌 330004）

藍苓解毒顆粒是根據(jù)我院陳勝輝主任中醫(yī)師多年的臨床經(jīng)驗總結(jié)擬定的中藥協(xié)定方研制而成，為傳統(tǒng)中藥制劑。主要由板藍根、土茯苓、大青葉、薏苡仁、白花蛇舌草、虎杖、醋柴胡、關(guān)黃柏和甘草九味中藥組成，具有清熱解毒[1-3]、利濕通淋之功效。用于濕熱下注所致淋證，證見：小便不利，淋漓澀痛，尿血，以及下生殖道感染、慢性前列腺炎見上述證候者。原中藥處方中沒有固定的質(zhì)量標準，難以對藥品的質(zhì)量進行控制，為保障臨床應用安全，本研究參考《中國藥典》2020 年版一部及相關(guān)文獻[4]，對藍苓解毒顆粒的質(zhì)量標準進行了研究。通過對其性狀進行規(guī)范化描述，并使用薄層色譜鑒別板藍根[5-6]、關(guān)黃柏[7]和虎杖[8]，采用HPLC 測定藍苓解毒顆粒中（R，S）-告依春[9-11]的含量，制訂了可靠有效的含量限度。同時，參照相關(guān)文獻中顆粒劑的質(zhì)量檢查標準[12-14]，分別對藍苓解毒顆粒的粒度、水分、溶化性等項目進行檢查，確保有效控制該產(chǎn)品質(zhì)量。

1 儀器與材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀（VWD 檢測器）；超聲波清洗器（深圳市冠博科技實業(yè)有限公司）；萬分之一分析天平（METTLER-TOLEDO 公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

（R，S）-告依春對照品（批號：111753-201706）、大黃素對照品（批號：110756-201913）、鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-201814）、甘草苷對照品（批號：111610-201908）、齊墩果酸對照品（批號：110709-201808）、落新婦苷對照品（批號：111798-201805），關(guān)黃柏對照藥材（批號：120937-201408）、白花蛇舌草對照藥材（批號：121183-201605）、薏苡仁對照藥材（批號：121254-201504）、柴胡對照藥材（批號：120992-201509），均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。硅膠GF254板、硅膠G 板（青島海洋化工廠分廠，0.20～0.25 mm）。

藍苓解毒顆粒（批號：20190301、20190302、20190303），均由江西中醫(yī)藥大學附屬生殖醫(yī)院提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

對3批樣品性狀進行觀察，均為棕黃色粉末；氣香，味甜、微苦。見圖1?？紤]到中藥顏色的差異及檢驗人員主觀性，性狀擬確定為：本品呈棕黃色至棕褐色；氣香，味微苦。

圖1 3批樣品的性狀Figure 1 Traits of three batches of samples

2.2 TLC鑒別

2.2.1 板藍根的TLC 鑒別 取本品5 g，研細，加80%的甲醇25 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另?。≧，S）-告依春對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。再取除板藍根外處方比例的其余中藥，按處方工藝制備板藍根陰性樣品。稱取適量板藍根陰性樣品，照供試品溶液的制備方法同法制成板藍根陰性對照溶液。分別吸取上述供試品、對照品和陰性對照溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，斑點分離度較好，陰性無干擾（見圖2）。

圖2 板藍根TLC圖Figure 2 TLC of Isatidis Radix

2.2.2 關(guān)黃柏的TLC 鑒別 取本品2 g，研細，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加鹽酸10 mL使溶解，用乙酸乙酯15 mL提取兩次，水層用氨試液調(diào)節(jié)pH 至10，再用三氯甲烷15 mL 提取2 次，三氯甲烷液水浴蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取關(guān)黃柏對照藥材，加甲醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液，作為對照藥材溶液。另取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。再取除關(guān)黃柏外處方比例的其余中藥，按處方工藝制備關(guān)黃柏陰性樣品。稱取適量關(guān)黃柏陰性樣品，照供試品溶液的制備方法同法制成關(guān)黃柏陰性對照溶液。分別吸取上述供試品、對照藥材、對照品和陰性對照溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以正丁醇-冰乙酸-水（7∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材、對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，斑點分離度較好，陰性無干擾（見圖3）。

圖3 關(guān)黃柏TLC圖Figure 3 TLC of Phellodendri Amurensis Cortex

2.2.3 虎杖的TLC 鑒別 取本品3 g，研細，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇2 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取大黃素對照品，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液，作為對照品溶液。再取除虎杖外處方比例的其余中藥，按處方工藝制備虎杖陰性樣品。稱取適量虎杖陰性樣品，照供試品溶液的制備方法同法制成虎杖陰性對照溶液。分別吸取上述供試品、對照品和陰性對照溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-乙醇（9∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，斑點分離度較好，陰性無干擾（見圖4）。

圖4 虎杖TLC圖Figure 4 TLC of Rhizoma Polygoni Cuspidati

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Welch C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.02%磷酸水溶液（6∶94）；檢測波長245 nm；流速1.0 mL·min-1；進樣量10 μL。

2.3.2 樣品的處理與配制 對照品溶液的配制：精密稱?。≧，S）-告依春對照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為10 g·mL-1的（R，S）-告依春對照品溶液，備用。供試品溶液的制備：取裝量差異項下的內(nèi)容物研成粉末，取約8 g，精密稱定，放在具塞的錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，蓋上塞子，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，室溫放置至涼，再稱定錐形瓶和樣品的質(zhì)量，用甲醇補足減少的質(zhì)量，搖勻，用漏斗過濾，取濾液過0.45 μm 的微孔濾膜，取續(xù)濾液作為藍苓解毒顆粒含量測定的供試品溶液。缺板藍根陰性溶液的制備：取缺板藍根陰性樣品適量，照“供試品溶液的制備”方法制備，即得。

2.3.3 專屬性試驗 ?。≧，S）-告依春對照品溶液、供試品溶液和缺板藍根陰性溶液各10 μL，分別注入液相分析，記錄色譜圖并保存，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示本品系統(tǒng)適應性良好，（R，S）-告依春保留時間約在25 min，與其他各峰達到基線分離，且陰性無干擾，理論塔板數(shù)＞5 000，符合方法學要求。

圖5 HPLC圖譜Figure 5 HPLC chromatograms

2.3.4 線性關(guān)系考察 配制濃度為2.040 μg·mL-1的（R，S）-告依春對照品儲備溶液。分別精密吸取對照品儲備溶液1、2.5、4、5、7.5 mL，放于10 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為2.004、5.010、8.016、10.020、15.030 μg·mL-1線性溶液，分別將上述對照品溶液及對照品儲備液（20.040 μg·mL-1）各10 μL，注入液相中分析，記錄峰面積。以峰面積對進樣量（ng）進行回歸分析，回歸方程為：y=6.603 9x-17.444，R2=0.999 3，結(jié)果表明（R，S）-告依春在20.04～200.40 ng 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，符合方法學要求。

2.3.5 精密度試驗 取（R，S）-告依春對照品溶液，連續(xù)注入液相色譜儀6 次，記錄色譜圖的峰面積。結(jié)果顯示，峰面積的平均RSD值為1.73%，小于5%，本方法精密度良好，符合方法學要求。

2.3.6 重復性試驗 取藍苓解毒顆粒樣品（批號：20190302）6 份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下方法測定，計算含量。結(jié)果顯示，樣品含量平均RSD 值為1.75%，小于5%，本方法重復性結(jié)果良好，符合方法學要求。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按“2.3.1”項下方法，分別在0、2、4、8、12、18、24 h 后進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示平均RSD 值為1.91%，表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定，本方法穩(wěn)定性良好，符合方法學要求。

2.3.8 加樣回收率試驗 取已知含量的藍苓解毒顆粒（批號：20190302，每1 g 含（R，S）-告依春0.050 4 mg）各6個樣品，每個樣品取4 g，精密稱定，分別精密加入1 mL（R，S）-告依春對照品溶液（0.232 6 mg·mL-1），揮干，按供試品溶液的處理方法同法制成6份加樣回收樣品，注入液相分析，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，6個樣品加樣回收率平均RSD＜5%，本方法加樣回收率良好，符合方法學要求。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果Table 1 The results of sample recovery

2.3.9 耐用性試驗 取樣品（批號20190302）進行耐用性試驗，分別在不同流速、柱溫、流動相比例條件下測定（R，S）-告依春含量，結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，不同流速、柱溫和流動相比例對（R，S）-告依春的含量測定結(jié)果無顯著性差異，說明本法耐用性好。

表2 耐用性試驗結(jié)果Table 2 Durability test results

2.3.10 樣品含量測定 測定3 批樣品的（R，S）-告依春含量，結(jié)果顯示，批號20190301、20190302、20190303的樣品含量分別為0.60、0.60、0.59 mg·袋-1，3 批樣品均符合規(guī)定，且無明顯差異。

2.3.11 含量限度《中國藥典》2020 年版一部板藍根項下規(guī)定：水分不得過13.0%，含量按干燥品計算，含（R，S）-告依春不得少于0.030%。本品每1 袋中含板藍根5.001 6 g，（R，S）-告依春的轉(zhuǎn)移率約為30%。考慮到大生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的損耗等因素，以24%轉(zhuǎn)移率計算，本品每袋含（R，S）-告依春為0.313 3 mg。故擬將本制劑含量限度定為：本品每袋含板藍根以（R，S）-告依春計，不得少于0.31 mg。因此3批樣品的含量均符合規(guī)定。

2.4 其他檢查

照《中國藥典》2020 年版通則0104 顆粒劑項下要求，對3 批中試樣品（批號：20190301、20190302、20190303）的粒度、水分、溶化性、裝量差異和微生物限度等項目進行檢查。

2.4.1 粒度測定 照粒度和粒度分布測定法（《中國藥典》2020年版通則0982第二法篩分法）測定，不能通過一號篩的量與能通過五號篩的量的總和不得過15%。 結(jié)果顯示，批號20190301、20190302、20190303 的樣品粒度檢查結(jié)果分別為2.0%、2.1%、2.0%，3批樣品的粒度檢查結(jié)果均＜15%，符合規(guī)定。

2.4.2 水分測定 照水分測定法（《中國藥典》2020年版通則0832）測定，水分不得超過8.0%。取供試品內(nèi)容物，進行水分測定，結(jié)果顯示，批號20190301、20190302、20190303 的樣品水分分別為4.0%、4.1%、4.2%，3 批樣品的水分測定結(jié)果均＜8.0%，水分檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

2.4.3 溶化性測定 照溶化性測定法（《中國藥典》2020 年版通則0104 顆粒劑）測定，取供試品1 袋，加熱水200 mL，攪拌5 min，立即觀察。結(jié)果顯示，3批樣品顆粒全部溶化，有輕微渾濁，溶化性檢查結(jié)果符合規(guī)定。

2.4.4 裝量差異測定 照《中國藥典》2020 年版通則0104 顆粒劑（裝量差異）項下規(guī)定，取供試品10 袋，除去復合膜袋包裝，分別精密稱定每袋含有的內(nèi)容物，求出每袋中含有的內(nèi)容物裝量與平均裝量，每袋裝量與平均裝量相比較，規(guī)定6.0 g以上裝量差異限度為±5%，超出裝量差異限度的顆粒劑不得多于2 袋，并不得有1 袋超出裝量差異限度1 倍。結(jié)果顯示，3批樣品的裝量差異均在±5%以內(nèi)，均符合相關(guān)規(guī)定。

2.4.5 微生物限度測定 照《中國藥典》2020 年版顆粒劑檢查項和微生物計數(shù)法、控制菌檢查法及非無菌藥品微生物限度標準檢查，藍苓解毒顆粒為不含藥材原粉的口服給藥制劑，其檢出需氧菌總數(shù)不得超過103cfu·g-1，霉菌和酵母菌總數(shù)不得超過102cfu·g-1，每1 g中不得檢出大腸埃希菌。

藍苓解毒顆粒微生物限度檢查方法：取本品10 g，置錐形瓶中，加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，保溫振搖，作為1∶10 供試液。取1∶10 供試液按平皿法（1 mL·皿-1），依法測定需氧菌總數(shù)；取1∶10 供試液按平皿法（1 mL·皿-1），依法測定霉菌和酵母菌總數(shù)；取1∶10 供試液10 mL 至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，依法檢查大腸埃希菌。結(jié)果顯示，3 批樣品檢出需氧菌總數(shù)不超過100 cfu·g-1，霉菌和酵母菌總數(shù)不超過10 cfu·g-1，均未檢出大腸埃希菌。表明3批樣品的微生物限度檢查均符合規(guī)定。

2.4.6 重金屬檢查 照《中國藥典》2020 年版通則0821 重金屬檢查法，對樣品中含有的重金屬進行相關(guān)檢查。結(jié)果表明，3 批樣品的重金屬均未超過百萬分之十，低于藥典標準限量。

2.4.7 砷鹽檢查 照《中國藥典》2020年版通則0822砷鹽檢查法，對樣品進行檢查，結(jié)果表明，3批樣品的砷鹽均未超過百萬分之二，低于藥典標準限量。

3 討論

質(zhì)量標準研究過程中，曾對處方中的土茯苓、白花蛇舌草、醋柴胡、甘草、薏苡仁等藥味進行了薄層鑒別方法的研究。土茯苓的鑒別以落新婦苷對照品，白花蛇舌草的鑒別以白花蛇舌草為對照藥材、齊墩果酸為對照品，醋柴胡的鑒別以北柴胡為對照藥材，甘草的鑒別以甘草苷為對照品，薏苡仁的鑒別以薏苡仁為對照藥材，結(jié)果陰性樣品皆有干擾，且改變展開劑及樣品提取方法效果不明顯，故未作為質(zhì)量控制指標。

板藍根、關(guān)黃柏和虎杖的TLC 鑒別過程中，分別對點樣量、點樣后的溫度和濕度進行考察。鑒別板藍根時，供試品溶液和對照品溶液點樣量為10 μL 時斑點明顯；鑒別關(guān)黃柏時，供試品溶液和對照品溶液點樣量為2 μL 時斑點明顯；鑒別虎杖時，供試品溶液和對照品溶液點樣量為1 μL 時斑點明顯。不同溫度的考察：取點樣后的薄層板，分別在溫度10 ℃、溫度35 ℃條件下進行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同溫度下分離效果無顯著性差異。不同濕度的考察：取點樣后的薄層板，分別在相對濕度42%、相對濕度88%條件下進行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濕度條件下分離效果無顯著性差異。這表明以上3種藥材的鑒別方法在溫濕度條件變化較大時，仍具有較好的穩(wěn)定性和適宜性。

藍苓解毒顆粒源自醫(yī)院協(xié)定處方，該方根據(jù)濕熱下注所致的淋證的臨床辯證，按照中醫(yī)理論和多年臨床經(jīng)驗，由古代經(jīng)典名方“四妙散”加減而成。經(jīng)工藝開發(fā)，將湯劑研制成顆粒劑，在臨床上為廣大患者提供有效、經(jīng)濟、安全的用藥選擇。

4 結(jié)論

本研究建立了藍苓解毒顆粒中主要成分板藍根、關(guān)黃柏和虎杖的TLC鑒別方法，并采用HPLC法測定了（R，S）-告依春的含量。此方法專屬性強、重復性好、準確度高，能夠有效評價藍苓解毒顆粒的質(zhì)量。使得該制劑的質(zhì)量標準更加完善，能夠全面有效地控制其質(zhì)量。