精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5 發(fā)揮促血管平滑肌表型轉(zhuǎn)化作用研究

劉思彤，段巖，蔡思棟，麥艷琪，羅文威，劉培慶，李卓明

（1.中山大學藥學院，廣東 廣州 510006；2.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院特需醫(yī)療服務中心，廣東 廣州 510280）

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)的主要細胞類型，它的主要功能是調(diào)節(jié)血管張力和血流量，從而控制血壓和組織血流分布。成熟的VSMCs 是一種未終末分化且保留可塑性的細胞，可在不同的表型之間進行轉(zhuǎn)換，分為收縮表型和合成表型。正常成人動脈的VSMCs 以收縮表型為主，而當感知到環(huán)境壓力和細胞外信號的刺激，一部分VSMCs 會失去收縮特性并轉(zhuǎn)化為合成表型，其特征是α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和平滑肌蛋白22（SM22）等平滑肌標記基因的表達減少，細胞呈現(xiàn)高度增殖和遷移，細胞外基質(zhì)合成增加，使血管產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性變化，如管壁增厚、管壁/管腔比值增大、微小動脈數(shù)量減少，導致血管重塑（vascular remodeling）[1]。VSMCs 表型轉(zhuǎn)化在多種心血管疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括動脈粥樣硬化[2]、損傷后再狹窄[3]、血管鈣化[4]、動脈瘤[5]等。因此，探尋VSMCs表型轉(zhuǎn)化的潛在干預靶標和治療藥物有著亟為重要的臨床意義。

表觀遺傳調(diào)控是指不改變基因的DNA 序列而主要通過DNA 或染色質(zhì)蛋白的化學修飾來調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的機制，廣泛調(diào)控細胞分化、個體發(fā)育、腫瘤發(fā)生和發(fā)展等眾多生物學過程。組蛋白甲基化修飾是基于組蛋白翻譯后修飾的重要表觀遺傳調(diào)控方式，主要發(fā)生在組蛋白N 端的賴氨酸和精氨酸殘基上。組蛋白甲基化在心血管疾病中的調(diào)控作用受到廣泛重視，已有報道其對擴張型心肌病、心力衰竭、心肌肥厚和動脈粥樣硬化的病理進展起重要作用[6]。

目前對賴氨酸甲基化的研究較為廣泛和深入，精氨酸甲基化也受到越來越多的關(guān)注。催化精氨酸甲基化的酶稱為精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferase，PRMT），目前已發(fā)現(xiàn)人源的PRMTs 共有9 個亞型，分別是PRMT1～9[7]。其中，PRMT5可催化精氨酸殘基的單甲基化和對稱二甲基化，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、RNA 剪接、翻譯和DNA 損傷反應等多種生物學過程[8]。已有大量的研究明確PRMT5 具有促癌作用，可促進多種類型癌癥的發(fā)生發(fā)展，被認為是腫瘤的潛在靶標[9]。然而，PRMT5在心血管疾病中的研究卻十分有限。

本文通過考察PRMT5在VSMCs表型轉(zhuǎn)化模型中的表達，利用其抑制劑EPZ015666 和腺病毒過表達手段，探究PRMT5 對表型轉(zhuǎn)化的影響，為其作為血管重塑相關(guān)的心血管疾病的潛在靶點提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、藥物及儀器

特級胎牛血清（ABW）；高糖DMEM 培養(yǎng)基（Gibco）；人血小板衍生生長因子PDGF-BB（Pepro‐Tech）；增殖細胞核抗原（PCNA）、SM22、α-SMA 抗體（Proteintech）；PRMT5抗體（SAB）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；蛋白Marker（Thermo Fisher Scientific）；ECL 化學發(fā)光液（Tanon）；鼠尾膠原蛋白I 型（Solarbio）；PRMT5 過表達腺病毒及空載對照病毒（維真生物）。

EPZ015666是高效、高選擇性的PRMT5小分子抑制劑，被廣泛用作研究PRMT5和精氨酸甲基化的工具藥[10]。本實驗所用EPZ 購自MedChemExpress公司。EPZ粉末用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成1 mmol/L的儲備液，使用時用培養(yǎng)基稀釋。

XD5-1B 型倒置顯微鏡（Olympus）；Forma 371型CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）；SW-CJ-2F型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；5424R型冷凍臺式高速離心機（Eppendorf）；PL602-S型電子分析天平（Mettler-Toledo）；Synergy H1 型酶標儀（BioTek）；PowerPac Basic 型蛋白電泳儀（Bio-Rad）；5200型化學發(fā)光成像儀（Tanon）。

1.2 實驗動物

SPF 級180～220 g 雄性SD 大鼠由中山大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2021-0029。實驗根據(jù)《中山大學實驗動物生物安全管理實施細則》進行。本實驗經(jīng)中山大學實驗動物倫理委員會批準，批準編號：SYSU-IACUC-2022-001506。

1.3 VSMCs的原代培養(yǎng)與鑒定

參考文獻[11]方法并進行適當優(yōu)化，采用組織貼塊法取大鼠主動脈組織塊培養(yǎng)VSMCs。SD 大鼠頸椎脫臼處死，于無菌超凈臺解剖取胸主動脈，去除外部脂肪組織，刮去內(nèi)膜，剪成小組織塊貼于25 cm2培養(yǎng)瓶，加入5 mL 高糖DMEM 培養(yǎng)基（添加20%FBS 和1%青鏈霉素混合液），將培養(yǎng)瓶底部朝上置于培養(yǎng)箱中，4～6 h 后小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使培養(yǎng)基浸沒組織塊。約5～7 d后可見平滑肌細胞從組織塊爬出，約10～14 d細胞融合度可達80%以上，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，第3 代起用添加10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，取3～5 代細胞用于后續(xù)試驗。采用形態(tài)學鑒定和免疫熒光染平滑肌標志性蛋白α-SMA 的方法鑒定培養(yǎng)細胞的純度。

1.4 細胞分組與給藥

本研究共分為5 組：（1）對照組：細胞用無血清DMEM 培養(yǎng)基饑餓處理24 h 后換為2%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；（2）PDGF-BB 模型組：細胞用無血清DMEM 培養(yǎng)基饑餓處理24 h 后換為2%FBS 的DMEM，加入PDGF-BB（30 ng/mL），根據(jù)實驗需求處理12 h，24 h 或48 h；（3）PDGF-BB+EPZ015666 處理組：細胞饑餓處理24 h 后換為2%FBS 的DMEM，同時給予PDGF-BB（30 ng/mL）和EPZ015666（1 μmol/L），根據(jù)實驗需求處理12 h，24 h 或48 h；（4）對照GFP 腺病毒組：加入含綠色熒光GFP 的空載腺病毒處理48 h；（5）PRMT5 腺病毒過表達組：加入PRMT5腺病毒處理48 h。

1.5 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測蛋白表達

采用RIPA裂解液（加入1%PMSF）收集細胞總蛋白，離心取蛋白上清，BCA定量試劑盒測定蛋白濃度。取10～20 g蛋白，向其中加入適量5×Loading Buffer并用超純水稀釋為1×，100 ℃金屬浴煮樣5 min。采用恒壓法進行SDS-PAGE凝膠電泳使不同分子量的蛋白分離，采用恒流濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%牛奶封閉1 h。TBST充分洗凈牛奶后將膜裁剪為目標蛋白分子量條帶孵相應的一抗，4°C 搖床孵育過夜。條帶洗凈一抗后室溫孵育對應二抗2 h，洗滌后采用ECL化學發(fā)光液處理并顯影。所得的顯影結(jié)果用Image J進行灰度統(tǒng)計并定量分析。

1.6 免疫熒光染色檢測α-SMA表達

將VSMCs 接種于共聚焦專用玻底皿中，置培養(yǎng)箱過夜貼壁。棄皿中培養(yǎng)基，PBS 洗3 次，加水浴至37°C 的4%（φ）多聚甲醛固定30 min。PBS 洗3 次，加入1%Triton-PBS 溶液室溫透膜10 min。PBS 洗3 次，加入山羊血清封閉30 min。傾去不洗，加入一抗稀釋液（α-SMA，體積比1∶400），4°C 孵育過夜。PBS 洗3 次，室溫孵育鼠熒光二抗1 h。PBS洗3次，DAPI染核10 min。PBS洗3次，于激光共聚焦顯微鏡下檢測熒光。

1.7 膠原凝膠收縮實驗檢測細胞收縮

參考文獻[12]方法并進行適當優(yōu)化制備細胞膠原凝膠。胰酶消化細胞，離心，用無FBS 的DMEM重懸，對單個孔，配制345 μL 細胞懸液，使總細胞數(shù)為5×104個。冰上操作，加入100 μL 鼠尾膠原混勻。迅速轉(zhuǎn)移入有6 μL 0.1mol/L NaOH 的EP管中，吹打3～5次。迅速轉(zhuǎn)移入48孔板中，室溫靜置30～60 min至倒置無液體流動。用刮刀小心貼孔壁分離凝膠，把膠倒入裝有1 mL 5%FBS 無酚紅DMEM 的24 孔板中。24 h后拍照記錄凝膠大小，并用Image J進行凝膠面積統(tǒng)計，計算24 h 時間點的凝膠面積與原始凝膠面積的比值表征細胞收縮能力。

1.8 劃痕實驗檢測細胞遷移

將VSMCs 接種于6 孔板中，待長至融合度為80%左右時，將直尺架于6孔板正上方，用200 μL的槍頭沿直尺劃線，PBS 洗1 次除去懸浮細胞，重新加入PBS，于顯微鏡下找到劃痕視野，拍攝0 h 時間點照片。將PBS 更換為普通培養(yǎng)基或?qū)幬锾幚淼呐囵B(yǎng)基，12 h 后棄培養(yǎng)基，PBS 洗1 次后重新加入PBS，于顯微鏡下拍攝照片。用Image J 進行劃痕面積統(tǒng)計，用傷口愈合率（12 h 劃痕面積/原始劃痕面積）表征細胞遷移能力。

1.9 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，用GraphPad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計學分析并作圖，兩組之間比較采用t檢驗，多組間比較用one-way ANOVA，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠主動脈VSMCs形態(tài)學及免疫熒光鑒定

采用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠原代平滑肌細胞，組織塊貼壁后約5～7 d 可見有細胞從組織塊邊緣爬出，呈長梭形，或呈三角型，不規(guī)則型。此后1～2 周增長迅速，形態(tài)逐漸拉長，且呈現(xiàn)VSMCs 的特征性“峰-谷”狀生長，“峰”處細胞互相重疊，可疊加多層，“谷”處細胞僅1～2 層，甚至無細胞，這是VSMC 的特征性生長表現(xiàn)（圖1A）。采用免疫熒光染平滑肌細胞特異性蛋白α-SMA 結(jié)果呈陽性（圖1B），表明原代平滑肌細胞分離培養(yǎng)成功，后續(xù)采用第3～5 代細胞進行實驗。

圖1 大鼠主動脈VSMCs原代培養(yǎng)形態(tài)學及細胞免疫熒光鑒定Figure 1 Morphological and cell immunofluorescence identification of primary cultivated rat aortic VSMCs

2.2 PRMT5 在PDGF-BB 誘導的VSMCs 表型轉(zhuǎn)化模型中的表達

以PDGF-BB（30 ng/mL）持續(xù)刺激VSMCs 48 h，可觀察到增殖表型指標PCNA 明顯上調(diào)，收縮表型指標SM22 和α-SMA 下調(diào)，表明VSMCs 發(fā)生表型轉(zhuǎn)化（圖2）。PRMT5 蛋白在PDGF-BB 誘導的VSMCs 表型轉(zhuǎn)化模型中表達水平顯著升高（P＜0.05）（圖2）。

圖2 PRMT5 在PDGF-BB 誘導的VSMCs 表型轉(zhuǎn)化模型中表達增加Figure 2 Increased expression of PRMT5 in PDGF-BB induced VSMCs phenotype transformation model(n=3)

2.3 PRMT5抑制劑EPZ015666對PDGF-BB 誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

在PDGF-BB誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化模型上給予1 μmol/L的EPZ處理48 h，與PDGF-BB模型組相比，α-SMA 和SM22 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），說明EPZ 可逆轉(zhuǎn)PDGF-BB 誘導的收縮表型蛋白下調(diào)（圖3A）。使用VSMCs與鼠尾膠原混合制膠，膠的收縮狀態(tài)可反映細胞的收縮力。制膠后24 h觀察凝膠面積大小，并計算此時收縮力（凝膠面積/原始面積），比值越小，說明收縮力越強。與對照組相比，PDGF-BB組的24 h凝膠面積與原始凝膠面積的比值顯著增大（P＜0.05），表明其收縮力有所下降；與PDGF-BB 組相比，PDGF-BB+EPZ 處理組的24 h 凝膠面積與原始凝膠面積的比值顯著下調(diào)（P＜0.01），表明其收縮力有所上升，即EPZ 處理可逆轉(zhuǎn)PDGF-BB 誘導的VSMCs 收縮力下調(diào)（圖3B）。劃痕實驗可表征細胞的遷移水平。與對照組相比，PDGF-BB 組傷口愈合率（12 h 劃痕面積/原始劃痕面積）增大（P＜0.01），表明VSMCs 的遷移能力增強；與PDGF-BB 組相比，使用EPZ 處理后傷口愈合率減?。≒＜0.05），細胞遷移能力下降，表明EPZ 處理可逆轉(zhuǎn)PDGF-BB 誘導的VSMCs 遷移能力上升（圖3C）。以上結(jié)果表明，抑制PRMT5 可阻抑PDGF-BB 誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化，維持VSMCs收縮表型，抑制細胞遷移。

圖3 PRMT5抑制劑EPZ015666逆轉(zhuǎn)PDGF-BB誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化Figure 3 PRMT5 inhibitor EPZ015666 reverses PDGF-BB induced phenotypic transformation of VSMCs（n=3）

2.4 過表達PRMT5對VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響

利用腺病毒過表達PRMT5，與空載組相比，過表達組的PRMT5 蛋白水平顯著升高，說明過表達成功（圖4）。PRMT5 過表達可顯著升高增殖表型標志蛋白PCNA（P＜0.01），并降低收縮表型標志蛋白SM22的表達（P＜0.01），表明過表達PRMT5可促進VSMCs從收縮表型向增殖表型轉(zhuǎn)化（圖4）。

圖4 過表達PRMT5促進VSMCs表型轉(zhuǎn)化Figure 4 Overexpression of PRMT5 promotes phenotypic transformation of VSMCs(n=3)

3 討論

作為調(diào)控血壓和維持血管結(jié)構(gòu)完整性的主要細胞類型，VSMCs 發(fā)揮著重要的病理生理調(diào)節(jié)作用。VSMCs 異常的表型改變和功能改變是血管重塑的病理基礎(chǔ)，參與多種心血管疾病的病理進程[13]。基于表觀遺傳調(diào)控機制探討VSMCs 表型轉(zhuǎn)化和血管重塑的干預策略和防治靶標，是當前心血管研究領(lǐng)域的熱點。本文聚焦于組蛋白甲基化酶PRMT5，探討PRMT5在VSMCs表型轉(zhuǎn)化中的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，PRMT5在PDGF-BB 誘導的VSMCs表型轉(zhuǎn)化模型中表達顯著增加，提示PRMT5 可能參與VSMCs 表型轉(zhuǎn)化過程的生物學調(diào)控。本研究通過“功能缺失”和“功能獲得”實驗，利用PRMT5 抑制劑EPZ015666 和腺病毒過表達手段，考察PRMT5對VSMCs 收縮表型和增殖表型相關(guān)指標的影響。結(jié)果表明，EPZ015666 可逆轉(zhuǎn)PDGF-BB 誘導的VSMCs收縮表型標志蛋白α-SMA 和SM22的下調(diào)，逆轉(zhuǎn)細胞收縮力的下降和遷移能力的增加，表明抑制PRMT5具有抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化的作用；反之，利用腺病毒過表達PRMT5 可促進收縮指標的下調(diào)和增殖指標的上調(diào)，證明了PRMT5 具有促進平滑肌表型轉(zhuǎn)化的作用。綜上，本研究數(shù)據(jù)提示PRMT5是VSMCs表型轉(zhuǎn)化和血管重塑的潛在干預靶標。

PRMT5 是催化蛋白質(zhì)精氨酸殘基單甲基化和對稱二甲基化修飾的主要酶，可以催化多種組蛋白和非組蛋白底物，在組織穩(wěn)態(tài)維持、疾病演進的關(guān)鍵過程中起重要作用。對組蛋白而言，PRMT5 對H4R3 和H3R8 的單甲基化和對稱二甲基化修飾方面的研究最為廣泛和深入。本課題組前期亦報道了PRMT5 通過對H4R3 的對稱二甲基化修飾，上調(diào)靶基因Filip1L 的轉(zhuǎn)錄和表達，抑制β-catenin 信號通路，從而發(fā)揮抗心肌肥大的保護效應[14]。在非組蛋白方面，PRMT5 的過度表達通過促進HoxA9 的對稱二甲基化修飾并抑制HoxA9的表達，抑制HoxA9與心肌肥大因子BNP 啟動子的結(jié)合，從而抑制心肌肥大[15]；心肌細胞中PRMT5 的缺失通過對蛋白OGA 的調(diào)控誘導擴張型心肌病，PRMT5 可通過調(diào)節(jié)OGA 的轉(zhuǎn)錄維持心臟穩(wěn)態(tài)[16]；此外，通過介導NF-κB p65 的Arg-3 位點二甲基化，PRMT5 可在體外和體內(nèi)促進VSMCs 中TMAO 誘導的炎癥反應[17]。目前，PRMT5 調(diào)節(jié)VSMCs 表型轉(zhuǎn)化的確切機制尚不清楚。PRMT5 介導的單甲基化和對稱二甲基化修飾，究竟發(fā)生在H4R3、H3R8 等組蛋白，或其他與VSMCs 表型調(diào)節(jié)相關(guān)的非組蛋白，仍有待進一步闡明。此外，綜合目前的文獻和已有數(shù)據(jù)，PRMT5 分子在不同的心血管疾病中扮演著截然不同的調(diào)控角色，其對不同心血管疾病的貢獻仍需進一步探索。

鑒于PRMT 家族在癌癥中的關(guān)鍵作用，關(guān)于PRMT家族成員的特異性抑制劑的研究正在全球范圍內(nèi)開展，幾家大型制藥公司已經(jīng)啟動了針對PRMT5 抑制劑在實體瘤和淋巴瘤的臨床試驗[18]。PRMT抑制劑的開發(fā)也為研究其對癌癥外的其它疾病的調(diào)控提供了便利。隨著PRMT5 作為心血管疾病靶標研究的深入，以及越來越多更強效更高特異性的PRMT5 抑制劑面世，靶向PRMT5 的心血管疾病藥物研發(fā)將會迎來更多的機遇。