基于P72、MGF和CD2v基因的非洲豬瘟三重熒光定量PCR檢測方法的建立

張紅云 陳秋英 嚴斯剛 杜泓明 陸志翔 鄭敏 羅廷榮*

（1.廣西大學生命科學與技術(shù)學院，廣西 南寧 530004；2.廣西悅牧生物科技有限公司，廣西 南寧 530006；3.廣西璞締恩葳生物技術(shù)有限公司，廣西 南寧 530006；4. 柳州市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 柳州 545026；5.廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西 南寧 530004；6.廣西壯族自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530004）

2018年8月在我國遼寧省首次報道非洲豬瘟（African swine fever，ASF）疫情，隨后疫情從東北地區(qū)迅速蔓延至全國各地，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟損失［1］。非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）的一種病毒，僅感染豬科動物［2］。

ASF剛傳入中國呈現(xiàn)出感染性強、毒力強的特點，表現(xiàn)為高熱、皮膚充血、多器官出血及流產(chǎn)、快速傳染和死亡等急性癥狀，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。隨著ASFV在中國的定殖，逐步出現(xiàn)基因缺失株、自然變異株、自然弱毒株等基因變異毒株，與傳統(tǒng)的野毒株相比，生豬感染基因變異毒株后，表現(xiàn)為排毒滴度低、間隙性排毒、潛伏期長、難以早期發(fā)現(xiàn)和精確監(jiān)測?；蜃儺惗局甑幕蚪M序列、致病力等發(fā)生明顯變化。

ASFV基因變異毒株侵染初期沒有明顯的臨床癥狀，采用抗體檢測無法區(qū)分所感染病毒株的類型，采用保守的P72蛋白序列研制的熒光定量PCR方法進行檢測，雖然可以盡早發(fā)現(xiàn)被ASFV感染的豬只，但是無法鑒別野毒株與基因變異毒株，因此建立能夠鑒別野毒株和基因變異毒株的多重熒光定量PCR方法，對構(gòu)建豬場生物安全屏障，開展ASFV的野毒株和基因變異毒株的鑒別診斷意義重大，有利于養(yǎng)殖場采取相應(yīng)措施進行防控。

1 材料與方法

1.1 材料

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）和豬細小病毒（PPV） 的DNA陽性對照由廣西璞締恩葳生物技術(shù)有限公司實驗室提供。本實驗的陽性對照及構(gòu)建質(zhì)粒的模板是在廣西動物疫病預(yù)防控制中心組織的ASFV比對試驗中驗證為ASFV陽性的樣本。經(jīng)鑒定，在陽性樣本中，有野生型ASFV及MGF-CD2v基因雙缺失的ASFV兩種樣本。2×Taq PCR Mastermix（KT201-12）、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP209-02）、pLB 零背景快連接試劑盒（VT205-01）、DH5α感受態(tài)細胞（CB101-01）和質(zhì)粒小提試劑盒（DP103-02）購自天根生化科技（北京）有限公司。DNA marker LD DS2000（LM1101）購自廣州東盛生物科技有限公司。Animal Detection U+ Probe Master Mix （QV110-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 引物設(shè)計

以專利《基因缺失的減毒非洲豬瘟病毒及其作為疫苗的應(yīng)用》為參考［3］，對非洲豬瘟病毒中國流行株P(guān)ig/CN/HLJ/2018（GenBank登錄號：MK333180.1）的缺失情況進行分析。根據(jù)ASFV基因缺失毒株（HLJ/18-7GD株）的兩個基因CD2v和MGF的缺失位置設(shè)計引物（見表1），用于鑒定野生毒株和基因缺失毒株。

表1 ASFV野生株與基因缺失毒株鑒別引物列表

1.3 重組質(zhì)粒標準品的構(gòu)建與鑒定

通過PCR方法從ASFV陽性DNA模板擴增相應(yīng)基因片段。反應(yīng)體系如下：2×Taq PCR Mastermix 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，核酸模板5 μL，加ddH2O補充至50 μL。

將PCR產(chǎn)物純化回收后分別連接在pLB Vector載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞上，涂布于Amp抗性LA平板篩選陽性克隆，送至北京擎科生物科技股份有限公司測序。篩選序列正確的陽性菌落擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)以下公式計算拷貝數(shù)：雙鏈 DNA拷貝數(shù)（copies/mL）＝6.02×1023（copies/mL）×濃度（g/mL）/ 重組質(zhì)粒長度×660。

1.4 三重熒光定量PCR檢測方法及標準曲線的建立

根據(jù)重組質(zhì)粒序列設(shè)計相應(yīng)的引物和探針（見表2），稀釋至10 μmol，建立三重熒光定量PCR檢測方法。三重熒光定量PCR體系反應(yīng)條件探索如下：Animal Detection U+ Probe Master Mix 12.5 μL，正反向引物0.2~0.8 μL，以0.1 μL遞增，探針引物0.1~0.4 μL，以0.1 μL遞增，采用矩陣法優(yōu)化引物和探針的最優(yōu)濃度配比。陽性對照核酸模板1 μL，用ddH2O補足25 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)程序詳見QV110-01產(chǎn)品說明書。

表2 三重熒光定量PCR引物及探針列表

測定pLB-P72、pLB-CD2v、pLB-MGF重組質(zhì)粒濃度，稀釋至（5.44~6.46）×1012copies/mL，按1∶1∶1混勻后作為陽性對照標準品，以10 倍的梯度稀釋成11個濃度，按照優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件進行多重熒光定量 PCR 擴增，以標準品濃度的對數(shù)為橫坐標，Ct 值為縱坐標建立標準曲線［用（5.44~6.46）×109copies/mL到（5.44~6.46）×105copies/mL這5個濃度梯度建立標準曲線］。

1.5 特異性試驗

以PCV2、PRV 和PPV的 DNA為模板，按照1.4優(yōu)化出的條件，進行PCR擴增檢測，以評估檢測方法的特異性。

1.6 敏感性試驗

將重組質(zhì)粒標準品10倍梯度（從1012-102copies/μL）稀釋后，按照1.4已優(yōu)化的條件，以三個重組質(zhì)粒為陽性對照，確定該方法的敏感性。

1.7 重復(fù)性試驗

以上述不同濃度的質(zhì)粒標準品混合物為模板，利用本研究建立的方法檢測，每個濃度設(shè)3個生物學重復(fù)，進行組內(nèi)重復(fù)性分析。將上述試驗重復(fù)3次，進行組間重復(fù)性分析，計算變異系數(shù)，分析該方法的重復(fù)性。

1.8 三重熒光定量PCR方法的驗證試驗

以廣西動物疫病預(yù)防控制中心提供的野生型ASFV及MGF-CD2v基因雙缺失的ASFV兩種樣本為驗證材料，使用P72、CD2v、MGF這3個基因的引物（表2）進行普通PCR驗證。驗證正確后使用上述兩種樣本的DNA為模板，用1.4優(yōu)化出的三重熒光定量PCR來檢測，鑒別ASFV的野生毒株和MGF-CD2v基因雙缺失毒株。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標準品的構(gòu)建

采用表1設(shè)計的引物均能擴增出大小正確的目的片段。選取ASFV-P72-F3/R3擴增產(chǎn)物（382 bp）、ASFV-MGF-F1/R1擴增產(chǎn)物（827 bp）和ASFV-CD2v-F1/R1擴增產(chǎn)物（548 bp）連接pLB Vector，轉(zhuǎn)化DH5α。挑選菌落PCR驗證正確的陽性克隆送測序，獲得測序正確的重組質(zhì)粒pLB-P72、pLB-MGF和pLB-CD2v。

2.2 引物和探針濃度配比的優(yōu)化

在引物和探針濃度均在10 μmol情況下，采用矩陣法優(yōu)化引物和探針的最優(yōu)濃度配比：取0.1~0.5 μL的引物，擴增效率隨引物濃度顯著提升；取0.5~0.7 μL的引物，擴增效率不再隨引物濃度提升。探針濃度在0.2 μL附近為最優(yōu)。故優(yōu)化后體系如下：上下游引物（10 μmol）各0.5 μL，探針（10 μmol）各0.2 μL。

2.3 標準曲線的建立

以pLB-P72（FAM通道）、pLB-CD2v（HEX通道）、pLB-MGF（CY5通道）重組質(zhì)粒標準品作為陽性對照，建立標準曲線。因為從（5.44~6.46）×1012copies/mL到（5.44~6.46）×1010copies/mL以及從（5.44~6.46）×104copies/mL到（5.44~6.46）×102copies/mL這兩個濃度范圍的線性關(guān)系并不是很顯著，所以選取從（5.44~6.46）×109copies/mL到（5.44~6.46）×105copies/mL建立標準曲線。三個重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)值與Ct值在上述濃度范圍有較好的線性關(guān)系（圖1）。

圖1 FAM、HEX和CY5通道的擴增曲線圖及標準曲線

2.4 特異性試驗

以PCV2 、PRV、PPV的DNA為模板，按照1.4已優(yōu)化的條件進行檢測，未出現(xiàn)特異性擴增曲線，說明引物的特異性良好。

2.5 敏感性試驗

以pLB-P72、pLB-CD2v、pLB-MGF重組質(zhì)粒標準品為模板，按照1.4已優(yōu)化的條件，從（5.44~ 6.46）×1012copies/mL到（5.44~6.46×102）copies/mL濃度范圍均可以檢測出明顯的擴增曲線（圖2），其檢測閾限在（5.44~6.46）×102copies/ mL之下，其靈敏度可以達到102~103copies/mL之間。

圖2 三重熒光定量PCR擴增曲線圖

2.6 重復(fù)性試驗

對FAM、HEX和CY5三個信號通道下109、107和105這3個模板濃度下的數(shù)據(jù)進行組間的重復(fù)性比較，利用變異系數(shù)計算公式計算變異系數(shù)。結(jié)果顯示，大部分組間變異系數(shù)均小于 2%或接近2%，只有一組數(shù)據(jù)HEX和CY5二組數(shù)據(jù)稍大于2%（表3），表明該檢測方法具有較好的重復(fù)性。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.7 三重熒光定量PCR方法的驗證

ASFV的野生毒株可擴增出P72、CD2v和MGF3個基因的所有片段，而MGF-CD2v基因雙缺失毒株僅可擴增出P72基因的片段。通過三重熒光定量PCR檢測鑒別，ASFV的野生毒株出現(xiàn)FAM、HEX和CY5 3個通道的擴增曲線，而MGF-CD2v基因雙缺失毒株僅有FAM通道的擴增曲線（圖3）。

圖3 三重熒光定量PCR的樣本檢測試驗

3 討論

本實驗建立的三重熒光定量PCR方法可以有效檢測ASFV，并能對ASFV的野毒株和MGFCD2v基因缺失毒株進行鑒別，檢測的敏感性為102~103copies/mL。該靈敏度已經(jīng)達到目前查閱到的基于TaqMan探針的多重熒光PCR檢測企業(yè)標準（1000 copies/mL）的要求（T/GDMDMA 0001—2021）。同時我們也注意到CY5和HEX擴增效率比較低，可能與使用的Animal Detection U+ Probe Master Mix的擴增效率有關(guān)，使用擴增效率更高的Taq酶或能提高檢測精確性。

據(jù)張靜遠等報道［4］，基于P72基因設(shè)計的TaqMan探針，其對陽性重組質(zhì)粒的檢測靈敏度在10 copies/μL，對已知陽性臨床組織樣品可檢至 1∶103稀釋度。據(jù)韓玉等人研究［5］，基于CD2v基因設(shè)計的TaqMan探針熒光定量檢測方法，對重組質(zhì)粒的檢測閾限在16 copies/μL。而根據(jù)蔡曉麗等人所報道的P72和CD2v雙基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測方法，其檢測閾限在7.3 copies/μL~24.5 copies/μL的ASFV核酸濃度［6］。目前現(xiàn)行的非洲豬瘟檢測國家標準《非洲豬瘟診斷技術(shù)》（GB/T 18648—2020）僅有基于P72基因的單重探針熒光PCR方法［7］，本研究建立的基于P72、MGF和CD2v基因的三重探針熒光PCR方法可以區(qū)分野毒株和基因缺失變異株，將為兩類毒株的鑒別診斷標準的修訂提供數(shù)據(jù)支撐。綜上所述，本研究建立的基于P72、MGF和CD2v基因的TaqMan探針熒光定量檢測方法可靠有效，可為臨床應(yīng)用提供科學的試驗依據(jù)。