淺析高數(shù)值孔徑對(duì)STED超分辨顯微成像的影響

時(shí)金蒙 張會(huì)芳 郝振莉

（黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 開(kāi)封 475004）

0 前言

STED 超分辨率顯微鏡已被廣泛應(yīng)用于大氣水體環(huán)境物質(zhì)檢測(cè)、生理病理檢測(cè)以及生物制劑研制與生產(chǎn)等領(lǐng)域，具有分辨率高、聚焦能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1]。對(duì)傳統(tǒng)的顯微成像效果影響因素的研究較為成熟，對(duì)STED 超分辨率顯微成像影響因素的研究還有較大的提升空間[2]。當(dāng)前，很多使用者片面認(rèn)為數(shù)值孔徑越大，STED 超分辨率顯微鏡的成像效果一定就越好[3]，未進(jìn)行更深入的定量定性分析。實(shí)際情況并非完全如此，因此，研究高數(shù)值孔徑對(duì)STED 超分辨率顯微成像的影響具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

該文按照從理論到實(shí)際的思路，分別對(duì)STED 超分辨率顯微鏡的原理、作用以及不同評(píng)價(jià)指標(biāo)等進(jìn)行闡述，從有利影響、不利影響2 個(gè)方面論述了高數(shù)值孔徑對(duì)STED 超分辨率顯微成像的影響，并提出了一種新穎的定量確定高數(shù)值孔徑的算法。

1 STED 超分辨率顯微成像

受激輻射損耗（STED）對(duì)設(shè)備要求相對(duì)較高，可以實(shí)時(shí)拍攝且成像速度快，醫(yī)學(xué)實(shí)踐中常用于活細(xì)胞成像追蹤與檢測(cè)。

1.1 STED 超分辨率顯微成像的原理和作用

STED 顯微技術(shù)作為第一個(gè)突破光學(xué)衍射極限的遠(yuǎn)場(chǎng)顯微成像技術(shù)，其基本原理是采用2 束激光同時(shí)照射樣品，其中一束激光用來(lái)激發(fā)熒光分子，使物鏡焦點(diǎn)艾里斑范圍內(nèi)的熒光分子處于激發(fā)態(tài)；同時(shí)，用另外一束中心光強(qiáng)為0 cd的環(huán)形損耗激光與其疊加，使物鏡焦點(diǎn)艾里斑邊沿區(qū)域處于激發(fā)態(tài)的熒光分子通過(guò)受激輻射損耗過(guò)程返回基態(tài)而不自發(fā)輻射熒光，因此只有中心區(qū)域的熒光分子可以自發(fā)輻射熒光，從而獲得超衍射極限的熒光發(fā)光點(diǎn)。

1.2 STED 超分辨率顯微成像的評(píng)價(jià)指標(biāo)

STED 超分辨率顯微成像技術(shù)有多項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，一般是針對(duì)物鏡的。

1.2.1 分辨率

顯微鏡的分辨率是最核心的指標(biāo)，它是指能夠清晰區(qū)分2 個(gè)物點(diǎn)的最小間距，在有些場(chǎng)合又被稱為鑒別率。物鏡的分辨率與光線波長(zhǎng)成正比，與數(shù)值孔徑成反比。由于在現(xiàn)實(shí)中選擇不同波長(zhǎng)光線的可能性不大，因此數(shù)值孔徑成為影響分辨率的唯一因素。

1.2.2 焦深

焦深就是焦點(diǎn)深度，是指當(dāng)用物鏡進(jìn)行對(duì)焦時(shí)，在焦點(diǎn)上、下延伸一定范圍，在這個(gè)范圍內(nèi)也是完全意義上的清晰區(qū)域，這個(gè)延伸范圍的高度就是焦深。焦深概念引入的最大意義就是方便對(duì)所觀測(cè)物體立體成像清晰度進(jìn)行定量分析和評(píng)價(jià)[4]。

1.2.3 景深

當(dāng)使用物鏡進(jìn)行對(duì)焦時(shí)，除了在焦點(diǎn)的上、下進(jìn)行延伸以外，也可以在左、右部分延伸，左、右清洗區(qū)的長(zhǎng)度即為景深。通俗來(lái)說(shuō)，景深表示焦點(diǎn)左、右可以延伸到的清晰觀測(cè)范圍，這個(gè)清晰度不隨圖像的變大而變化[5]。

1.2.4 放大率和有效放大率

放大率是指顯微成像的大小與被觀測(cè)物質(zhì)實(shí)際大小的比值，實(shí)踐中一般等于目鏡放大倍數(shù)與物鏡放大倍數(shù)的乘積。由于受到實(shí)踐中各種條件的制約，一般達(dá)不到理論放大倍數(shù)，顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。

1.2.5 覆蓋率

由于顯微鏡蓋玻片的厚度不標(biāo)準(zhǔn)，光線從蓋玻片進(jìn)入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了變化，從而產(chǎn)生了相差，這就是覆蓋差。國(guó)際上規(guī)定，蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17 mm，許可范圍為0.16 mm～0.18 mm[6]。

1.2.6 視場(chǎng)直徑

由于目鏡是圓筒狀的，因此檢測(cè)員通過(guò)目鏡觀測(cè)的物質(zhì)成像也是圓形背景，大小由目鏡里的視場(chǎng)光闌決定。這個(gè)圓形背景的直徑被稱為視場(chǎng)直徑，是表征肉眼能夠觀察到的范圍大小的量值。視場(chǎng)直徑的計(jì)算公式為視場(chǎng)直徑=目鏡視場(chǎng)數(shù)/物鏡倍率。

2 高數(shù)值孔徑對(duì)STED 超分辨率顯微成像的影響

STED 超分辨率顯微成像器械繼承了傳統(tǒng)顯微鏡的一般原理，因此在高數(shù)值孔徑下具有許多優(yōu)勢(shì)。

2.1 數(shù)值孔徑與顯微成像的關(guān)系

顯微鏡結(jié)構(gòu)及成像原理如圖1 所示（195 mm 的物象距離是我國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的）。

圖1 顯微鏡結(jié)構(gòu)及成像原理示意圖

對(duì)物體的放大倍數(shù)取決于目鏡放大倍數(shù)與物鏡放大倍數(shù)的乘積，對(duì)顯微鏡來(lái)說(shuō)，目鏡放大倍數(shù)是根據(jù)需要由調(diào)節(jié)旋鈕進(jìn)行自動(dòng)調(diào)節(jié)的，而物鏡放大倍數(shù)需要根據(jù)不同數(shù)值孔徑的選擇進(jìn)行調(diào)整。通常情況下，數(shù)值孔徑越大，物鏡放大倍數(shù)越高，相應(yīng)的顯微鏡整體放大倍數(shù)也越高。

數(shù)值孔徑NA是透鏡與被檢物體之間介質(zhì)的折射率n和孔徑角2α半數(shù)的正弦的乘積，如公式（1）所示?？讖浇怯址Q鏡口角，是透鏡光軸上的物體點(diǎn)與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度。

2.2 高數(shù)值孔徑對(duì)STED 超分辨率顯微成像的正面影響

2.2.1 分辨率與數(shù)值孔徑之間基本上呈正相關(guān)

對(duì)傳統(tǒng)光學(xué)成像顯微鏡來(lái)說(shuō)，數(shù)值孔徑越大，分辨率越高，在目鏡中顯示的物體形象就越清晰。對(duì)STED 超分辨率顯微鏡來(lái)說(shuō)，被螺旋相位板整形的激光束經(jīng)過(guò)高數(shù)值孔徑透鏡聚焦后，數(shù)值孔徑會(huì)影響損耗光聚焦光斑的光強(qiáng)分布。不同的數(shù)值孔徑會(huì)對(duì)損耗光聚焦光斑光強(qiáng)分布和半高寬度造成不同的影響，隨著數(shù)值孔徑的增大，半高寬度逐漸變小，最后趨于飽和。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)數(shù)值孔徑增大時(shí)，STED 顯微鏡的分辨率會(huì)提高，但是不能證明數(shù)值孔徑越大，STED 顯微鏡的分辨率就越大。

由于STED 顯微鏡分辨率與受激光照光強(qiáng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而光強(qiáng)大小直接與損耗光聚焦光斑半高寬有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]，因此在模擬試驗(yàn)中，通過(guò)設(shè)置不同的數(shù)值孔徑來(lái)比較數(shù)值孔徑和損耗光聚焦光斑的半高寬之間的關(guān)系，該文計(jì)算了8 個(gè)不同數(shù)值孔徑對(duì)應(yīng)的半高寬度，結(jié)果見(jiàn)表1。

對(duì)STED 超分辨率顯微鏡來(lái)說(shuō)，數(shù)值孔徑突破了光的衍射限制，最高可以達(dá)到1.4 mm，由于該文研究的是高數(shù)值孔徑下STED 超分辨率顯微成像技術(shù)的影響，因此最低設(shè)定在普通顯微鏡數(shù)值孔徑較大區(qū)間的起始點(diǎn)0.7 mm。對(duì)數(shù)值孔徑在0.7 mm 以下的情況來(lái)說(shuō)，該文的研究對(duì)其意義不大，因此表1 中未列出相關(guān)數(shù)據(jù)。

2.2.2 高數(shù)值孔徑下STED 超分辨率顯微成像視野更寬闊

光線顯示的波狀延伸效果被稱為衍射。這就是為什么即便是使用無(wú)像差的高效能鏡頭也會(huì)以圓盤形狀的圖樣延伸而不是在單點(diǎn)匯聚。數(shù)值孔徑指示沒(méi)有光學(xué)像差的鏡頭的聚光限制或衍射限制，這個(gè)概念被認(rèn)為來(lái)自光的波狀表現(xiàn)。這種圓盤形狀的波稱為愛(ài)裏斑（Airy Disk）[8]。愛(ài)裏斑（Airy Disk） 的半徑r（寬度）如公式（2）所示。

式中：λ為光的波長(zhǎng)；NA為數(shù)值孔徑。

通過(guò)公式（2）得出的值稱為解析度。數(shù)值孔徑越大，愛(ài)裏斑 （Airy Disk） 的半徑就越?。贿@表明數(shù)值孔徑越大，影像就越清晰，這也是評(píng)估鏡頭的通用標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 高數(shù)值孔徑對(duì)STED 超分辨率顯微成像的不利影響分析

在高數(shù)值孔徑為STED 超分辨率顯微成像帶來(lái)很多益處的同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生一定的負(fù)面影響。

2.3.1 數(shù)值孔徑過(guò)高

數(shù)值孔徑過(guò)高會(huì)出現(xiàn)焦深和景深過(guò)小的現(xiàn)象。與傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像技術(shù)一樣，STED 超分辨率顯微成像技術(shù)的焦深與數(shù)值孔徑的平方成反比，數(shù)值孔徑越大，焦深越小。焦深小，允許的模糊圈就小，需要在實(shí)際檢測(cè)與拍攝過(guò)程中物距（攝距）減少，鏡頭焦距變短，光圈變大，會(huì)影響物體的觀測(cè)、拍攝范圍。焦深大， 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的1 個(gè)薄層。

雖然景深與焦深是不同的概念，但是數(shù)值孔徑越大，景深也越小。一般來(lái)說(shuō)，景深與焦深是呈正相關(guān)的，但是景深并不是越大越好。因?yàn)榈捅段镧R的景深較大，所以當(dāng)?shù)捅段镧R照相時(shí)會(huì)面臨困難。由于STED 超分辨率顯微鏡一半都具有較大的放大倍數(shù)，因此在其工作范圍內(nèi)，景深過(guò)小不利于細(xì)微圖像的鑒別。

圖2 中焦深為點(diǎn)B與點(diǎn)C連線，景深為點(diǎn)B'與點(diǎn)C'連線。雖然焦深和景深所代表的意義完全不同，但是可以通俗的理解為焦點(diǎn)實(shí)際上不是一個(gè)點(diǎn)，而是一個(gè)矩形區(qū)域范圍，其中矩形的長(zhǎng)度為景深，矩形的高度為焦深，兩者都是表征焦點(diǎn)區(qū)域范圍大小的重要指標(biāo)。

圖2 同一圖像焦深和景深位置關(guān)系示意圖

如果不同焦深和景深的圖像不需要進(jìn)行放大后觀察很小范圍內(nèi)的圖像具體效果，那么基本上沒(méi)有太大區(qū)別，如果需要放大一定倍數(shù)，那么圖像放大后的顯示質(zhì)量會(huì)存在明顯的差異。以南加利福尼亞大學(xué)圖像庫(kù)的狒狒圖像為例，放大相同倍數(shù)后，所產(chǎn)生的變化具體如圖3 所示。

圖3 不同焦深和景深情況圖像baboon 對(duì)比示意圖

圖3 是將焦深和景深不同的512×512 八位灰度圖像baboon 在MATLAB 軟件中放大3 倍之后的顯示效果，圖片格式均為JPG。圖3（a）的焦深和景深較大，圖3（b）的焦深和景深較小，通過(guò)肉眼可以明顯看到圖3（a）比圖3（b）更清晰。具體到顯微成像中，當(dāng)需要觀察很小區(qū)域圖像的具體細(xì)節(jié)時(shí)，需要通過(guò)調(diào)節(jié)目鏡旋鈕放大倍數(shù)進(jìn)行觀看，因此需要更大的焦深和景深，此時(shí)如果數(shù)值孔徑過(guò)大，反而不利于提高觀測(cè)精度。

2.3.2 高數(shù)值孔徑處在一定區(qū)間內(nèi)

高數(shù)值孔徑處在一定區(qū)間內(nèi)會(huì)導(dǎo)致受激輻射光強(qiáng)下降。從理論上來(lái)說(shuō)，由于STED 損耗光為環(huán)狀光束且其中心強(qiáng)度為0 cd，因此環(huán)狀損耗光越強(qiáng)，由第一束激發(fā)光激發(fā)的熒光分子所占的區(qū)域就越小，其橫向分辨率就越高。根據(jù)第2.1 節(jié)的分析可知，當(dāng)數(shù)值孔徑為0.7 mm～1.1 mm 時(shí)，損耗光半高寬度變窄，受激輻射光強(qiáng)下降的影響，光的通透力變?nèi)酰斐稍诖藚^(qū)間內(nèi)分辨率降低，同時(shí)三維層析能力降低。根據(jù)第3.1 節(jié)的分析可知，顯微成像技術(shù)的焦深景深不斷減少，當(dāng)需要精準(zhǔn)觀測(cè)某一較小范圍內(nèi)的情況且需要對(duì)所要觀測(cè)的圖像進(jìn)行放大時(shí)，會(huì)出現(xiàn)圖像模糊不清的情況。另外，由于數(shù)值孔徑的變大會(huì)導(dǎo)致觀測(cè)者必須將物距變小，因此工作距離也相應(yīng)縮短。綜上所述，高數(shù)值孔徑給視場(chǎng)寬度和工作距離帶來(lái)了一定的負(fù)面影響。

3 基于遺傳算法的高數(shù)值孔徑對(duì)STED 超分辨率顯微成像的效果優(yōu)化

3.1 遺傳算法適用性分析

根據(jù)第2 節(jié)的分析可知，高數(shù)值孔徑對(duì)STED 超分辨率顯微成像具有有利影響和不利影響。在當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的研究中多采用定性分析，缺乏定量分析，究竟數(shù)值孔徑為多大時(shí)能夠達(dá)到最好的綜合效果，需要根據(jù)建立模型使用優(yōu)化算法進(jìn)行局部尋優(yōu)與全局尋優(yōu)，最終達(dá)到收斂的效果，以此確定的自變量值就是數(shù)值孔徑具體的取值。實(shí)際中常用的優(yōu)化算法包括遺傳算法、粒子群算法、蟻群算法以及模擬退火算法等，該文以遺傳算法為例，將高數(shù)值孔徑對(duì)STED 超分辨率顯微成像的分析由定性拓展到定量層面。

遺傳算法包括3 個(gè)基本操作，分別是選擇、交叉和變異。選擇是指在進(jìn)化的每代中，根據(jù)適應(yīng)度函數(shù)計(jì)算個(gè)體的適應(yīng)度，選擇最佳個(gè)體及其代表的解。交叉是為了避免出現(xiàn)“早熟”現(xiàn)象，事先確定一個(gè)較小概率，每代中使用偽隨機(jī)數(shù)發(fā)生器產(chǎn)生一個(gè)隨機(jī)數(shù)，當(dāng)隨機(jī)數(shù)小于交叉概率時(shí)，對(duì)2個(gè)個(gè)體編碼進(jìn)行交叉操作（隨機(jī)選取交叉位）。變異是根據(jù)變異概率隨機(jī)反轉(zhuǎn)某一位的二進(jìn)制值，一般選取的變異概率要明顯小于交叉概率，其原因是如果變異概率很大，算法就類似于獨(dú)立的隨機(jī)算法，失去了遺傳尋優(yōu)的意義。

3.2 算法的設(shè)計(jì)和實(shí)現(xiàn)

3.2.1 確定適應(yīng)度函數(shù)

確定適應(yīng)度函數(shù)的整體思路是兼顧第2.2 節(jié)的有利影響和第2.3 節(jié)的不利影響，因此應(yīng)是2 個(gè)函數(shù)的和。由于是研究數(shù)值孔徑對(duì)成像的影響，因此自變量只有1 個(gè)值，代表STED 高分辨率顯微成像設(shè)備的數(shù)值孔徑寬度或者叫做直徑（用d來(lái)表示）。第一個(gè)函數(shù)是adv（d），其中又包括2 個(gè)小函數(shù)s（d）和r（d），分別代表分辨率和視野寬度隨數(shù)值孔徑的變化曲線，合起來(lái)代表有利影響。第二個(gè)函數(shù)是disadv（d），其中又包括3 個(gè)小函數(shù)x（d）、y（d）和z（d），分別代表焦深、景深和激光輻射光強(qiáng)隨數(shù)值孔徑變化的曲線，合起來(lái)代表不利影響。實(shí)踐中根據(jù)不同的應(yīng)用需求來(lái)確定每個(gè)分函數(shù)對(duì)應(yīng)的不同權(quán)值。因此適應(yīng)度函數(shù)如公式（3）所示。

式中：?1～?5為5 個(gè)不同的權(quán)值。。

3.2.2 確定步長(zhǎng)及權(quán)值每個(gè)分函數(shù)的數(shù)值

隨數(shù)值孔徑的變化不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，甚至不是單調(diào)關(guān)系，因此無(wú)法簡(jiǎn)單計(jì)算得出最優(yōu)解。通過(guò)確定合適步長(zhǎng)，使自變量d在較大量數(shù)值之間進(jìn)行變化，通過(guò)不斷的確定局部最優(yōu)解來(lái)不斷逼近全局最優(yōu)解。隨著納米科技的不斷發(fā)展和成熟應(yīng)用，理論上該算法可以達(dá)到納米級(jí)別，即計(jì)算最優(yōu)解的結(jié)果精確到納米。但實(shí)際考慮到顯微成像設(shè)備制造技術(shù)尚未達(dá)到納米級(jí)別且必須為算法效率考慮，盡量降低在普通計(jì)算機(jī)上算法耗用的時(shí)間，因此步長(zhǎng)以10-3量級(jí)為宜。

權(quán)值的確定需要根據(jù)實(shí)際使用過(guò)程中每個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的重要性排序來(lái)綜合確定，是一個(gè)客觀與主觀相結(jié)合的靈活變化的量。權(quán)值可以采取普通形式，也可以采取歸一化的形式。為了更方便進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)為其他智能優(yōu)化算法預(yù)留接口，該文采取歸一化的權(quán)值確定方式。同時(shí)注意權(quán)值務(wù)必使適應(yīng)度函數(shù)不能是單調(diào)函數(shù)，否則最優(yōu)值必然出現(xiàn)在邊界上，失去了尋優(yōu)的意義。

3.2.3 算法的流程

算法流程如下：1） 隨機(jī)產(chǎn)生初始種群，個(gè)體數(shù)目一定，每個(gè)個(gè)體為染色體的基因編碼。2） 由編碼得到數(shù)值孔徑大小，按照第2.2 節(jié)、第2.3 節(jié)的內(nèi)容計(jì)算每個(gè)小函量值，采用公式（3）計(jì)算適應(yīng)度函數(shù)。3） 每代進(jìn)行最優(yōu)化選擇，使用輪盤賭策略確定個(gè)體的適應(yīng)度，并判斷是否符合優(yōu)化準(zhǔn)則，如果符合，就輸出最佳個(gè)體及其代表的最優(yōu)解，結(jié)束計(jì)算，否則轉(zhuǎn)向第三步。記累計(jì)概率為PPi，Pi為個(gè)體的選擇概率，如公式（4）所示。共輪轉(zhuǎn)NP次，每次輪轉(zhuǎn)時(shí)隨機(jī)產(chǎn)生位于區(qū)間（0，1）內(nèi)的隨機(jī)數(shù)r，當(dāng)PPi-1≤PPi時(shí)，選擇個(gè)體i。因此，個(gè)體的適應(yīng)值越大，其選擇概率越大。4） 根據(jù)適應(yīng)度選擇再生個(gè)體，適應(yīng)度高的個(gè)體被選中的概率高，適應(yīng)度低的個(gè)體可能被淘汰。5） 按照一定的交叉概率和交叉方法生成新的個(gè)體。6） 按照一定的變異概率和變異方法生成新的個(gè)體。7） 由交叉和變異產(chǎn)生新一代的種群，返回到第二步。

3.3 算法性能分析

選用具體的權(quán)值和步長(zhǎng)進(jìn)行算法驗(yàn)證。硬件平臺(tái)為Intel Core i5-5200U（2.20 GHz），4G 內(nèi)存，軟件平臺(tái)為Windows 10（64 位）操作系統(tǒng)，Matlab2016Rb 軟件。主要驗(yàn)證算法的收斂性、時(shí)空性和有效性。步長(zhǎng)設(shè)定為0.001，權(quán)值分別為0.50、0.10、0.25、0.10 和0.05。采用第3.1 節(jié)、第3.2 節(jié)的內(nèi)容進(jìn)行全局尋優(yōu)，重復(fù)10 次，每次均取得了收斂，自變量的平均值為1.178，平均使用時(shí)間為25.234 s。由于分辨率在該算例中的權(quán)值最大，因此在實(shí)踐中對(duì)數(shù)值孔徑最接近1.178 的顯微成像設(shè)備和其他設(shè)備進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)分辨率在肉眼感知上明顯比其他設(shè)備高。綜上所述，該算法具有較好的收斂性和有效性，空間占用較小，但是算法耗費(fèi)時(shí)間略高，需要在下步的研究中進(jìn)行改進(jìn)。

4 結(jié)語(yǔ)

該文按照從理論到實(shí)際的思路，從有利方面和不利方面2 個(gè)部分分析了高數(shù)值孔徑對(duì)STED 超分辨率顯微成像的影響?？傮w來(lái)看，高數(shù)值孔徑下STED 超分辨率顯微成像效果更好，但是也會(huì)出現(xiàn)很多不利的方面。該文提出了一種新穎的對(duì)高數(shù)值孔徑進(jìn)行定量確定的算法，使用遺傳尋優(yōu)的方法達(dá)到全局收斂。在下步的研究工作中，要著重從拓展算法的角度選擇合適的智能算法，根據(jù)不同評(píng)價(jià)指標(biāo)所占比重的不同，制定完善的目標(biāo)函數(shù)，通過(guò)不斷訓(xùn)練達(dá)到收斂的自變量值，自動(dòng)確定數(shù)值孔徑的最優(yōu)數(shù)值，不斷提高STED 超分辨率顯微鏡數(shù)值孔徑選取的智能化、便捷化水平，并不斷提高算法的時(shí)空性能。