TNF-α聯(lián)合H2O2誘導(dǎo)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥損傷的影響

徐文珍,鄧澤元,李紅艷

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330031)

機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化反應(yīng)失衡,是造成機(jī)體氧化應(yīng)激的重要原因,其中活性氧的過(guò)量產(chǎn)生是導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的主要因素之一[1,2]。過(guò)氧化氫(H2O2)是致使細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要因子,使細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS,加速凋亡進(jìn)程,進(jìn)而誘發(fā)心血管疾病。H2O2對(duì)心肌細(xì)胞的氧化損傷是實(shí)驗(yàn)室中用來(lái)模擬心肌細(xì)胞損傷的常用方法[3]。

適量的免疫因子可以提高機(jī)體抵抗外界刺激和修復(fù)機(jī)體損傷的能力,而持續(xù)過(guò)量的刺激物產(chǎn)生的免疫活性物質(zhì)則會(huì)引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和凋亡[4]。腫瘤壞死因子α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)是體內(nèi)重要的炎癥細(xì)胞因子,在急性心肌梗死、冠狀動(dòng)脈硬化及心力衰竭等心血管疾病中起著重要作用[5],TNF-α可誘導(dǎo)趨化因子和細(xì)胞粘附分子,從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和破壞心肌組織[6,7]。TNF-α激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB( nuclear factor κB,NF-κB),NF-κB信號(hào)通路的激活可以干預(yù)炎癥反應(yīng)。

然而,傳統(tǒng)的心肌細(xì)胞損傷模型往往采用單一的高濃度脂多糖(LPS)或TNF-α誘導(dǎo)炎癥損傷,或者單一地用H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,并不能達(dá)到心肌細(xì)胞同時(shí)產(chǎn)生氧化應(yīng)激和慢性炎癥的效果。所以,本研究以低濃度TNF-α聯(lián)合H2O2共同誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞,同時(shí)達(dá)到氧化和炎癥損傷的效果,為抗氧化、抗炎作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

從武漢普諾賽生物購(gòu)入大鼠心肌細(xì)胞(H9c2)。

1.2 儀器與試劑

EXL800全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)買自美國(guó)Biotek Instruments有限公司;FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)買自美國(guó)Becton Dickinson公司;轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDocTMXRS+化學(xué)發(fā)光成像儀和CRX96 Touch 實(shí)時(shí)定量PCR均購(gòu)買自美國(guó)Bio-Rad公司;自蛋白質(zhì)電泳儀購(gòu)買自北京六一生物科技有限公司;Nano Drop 8000超微量分光光度計(jì)購(gòu)自Thermo Fisher科技公司;Neofuge 15R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和JY-86-2-50型-80 ℃冰箱均購(gòu)買自香港力康發(fā)展有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)買自國(guó)華電器有限公司;GPST200型CO2恒濕恒溫培養(yǎng)箱均購(gòu)買自長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司;37XC (XDS-1A)型倒置顯微鏡購(gòu)買自上海蔡康化學(xué)儀器公司;BHC-1300A/B3型生物安全柜購(gòu)買自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

TNF-α購(gòu)于美國(guó)PeproTech有限公司;二甲基亞砜和30 % H2O2溶液購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司;胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于以色列Biolnd公司;鏈霉素/青霉素、胰蛋白酶、丙酮酸鈉和DEPC水購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;磷酸緩沖鹽(PBS)購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒、總SOD活性檢測(cè)試劑盒、脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)試劑盒、CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA、蛋白酶抑制劑、蛋白酶抑制劑苯基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluorid ,PMSF)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;南京建成生物工程研究所購(gòu)入TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒和IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒;TRIzolTMReagent購(gòu)于Thermo Fisher科技公司,PrimeScriptTMRT reagent Kit with Gdna Eraser (Perfect Real Time)和Beastar? qPCR mastermix(SYBR Green)購(gòu)于日本TaKaRa公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

用10%胎牛血清+ 1%青霉素-鏈霉素+1%丙酮酸鈉配制成10% DMEM完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞,將細(xì)胞傳代后放在37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 CCK-8法檢測(cè)H2O2和TNF-α對(duì)H9c2大鼠心肌細(xì)胞細(xì)胞活力的影響

將H9c2細(xì)胞以5×104mL接種到96孔板中,在細(xì)胞達(dá)到70%～90%細(xì)胞密度后舍棄原始培養(yǎng)基,將藥物按一定的劑量進(jìn)行分組處理。采用0(Control組),50、100、150、200、250、300、350 μmol·L-1H2O2處理H9c2細(xì)胞1 h。在確定TNF-α的最佳濃度實(shí)驗(yàn)中,采用0(Control組),10、20、40、60、80、100、200 ng·mL-1TNF-α處理H9c2細(xì)胞12 h,每組 6 個(gè)復(fù)孔。倒掉舊培養(yǎng)基,用 PBS 洗滌 2 次。每孔加入10 μL CCK-8溶液,培養(yǎng)箱孵育1 h,在酶標(biāo)儀450 nm 處讀取光密度(OD) 值,以公式“細(xì)胞存活率 = OD待測(cè)孔/O D對(duì)照孔×100%” 計(jì)算各組細(xì)胞存活率,以反映細(xì)胞的增殖活性。在后續(xù)研究中,按照細(xì)胞存活率分別選取了H2O2和TNF-α的最佳刺激劑量。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平

將H9c2細(xì)胞以5×104mL接種到十二孔板中,細(xì)胞融合到70%～90%后棄去原培養(yǎng)基,再加入不同劑量的藥物進(jìn)行分組處理。隨后,用無(wú)血清培養(yǎng)基將DCFH-DA配制成5 μmol·L-1。PBS清洗3次后,每孔加入500 μL DCFH-DA,37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min[8]。加入無(wú)血清培養(yǎng)基清洗3次,加入0.15%的胰酶消化液,收集細(xì)胞后離心,流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

將H9c2細(xì)胞以5×104mL接種到十二孔板中,細(xì)胞融合到70%～90%后棄去原培養(yǎng)基,再加入不同劑量的藥物進(jìn)行分組處理。采用0(Control組),10,20,40,60,80,100 ng·mL-1TNF-α誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞12 h后,收集H9c2細(xì)胞上清液后,根據(jù)ELISA試劑盒的使用方法,按步驟檢測(cè)TNF-α和白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的分泌量。

1.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)

H9c2細(xì)胞接種到小平皿中,細(xì)胞融合到70%～90%后棄去原培養(yǎng)基,再加入不同劑量的藥物進(jìn)行分組處理。采集各組H9c2細(xì)胞,加入配制的冰冷裂解液(1 mL RAPA中加入10 μL蛋白磷酸酶抑制劑和10 μL苯甲基磺酰氟),在冰上裂解 30 min 后,離心并收集上清液,提取細(xì)胞總蛋白,然后使用 BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,用10% SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)蛋白質(zhì)分離,隨后利用恒流轉(zhuǎn)到PVDF膜上[9]。隨后用5%脫脂乳在室溫下封閉PVDF膜2 h,并與相應(yīng)的一抗[ICAM(1：5000),TNF-α(1：1000),IL-6(1：1000),VCAM(1：3000)]4 ℃ 孵育過(guò)夜。TBST清洗3個(gè)10 min,3個(gè)5 min后,將膜和相應(yīng)二抗置于搖床上孵育2 h 。最后,利用ECL化學(xué)發(fā)光液,避光孵育10～30 s,用凝膠成像儀對(duì)目的條帶拍照,并用 Image Lab 軟件對(duì)其進(jìn)行分析,以目標(biāo)蛋白條帶灰度值與 β-actin 條帶灰度值比值為指標(biāo)進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的相對(duì)定量[9]。

1.6 SOD和MDA水平

將H9c2細(xì)胞以5×104mL接種到十二孔板中,細(xì)胞融合到70%～90%后棄去原培養(yǎng)基,再加入不同劑量的藥物進(jìn)行分組處理。采用Control組、只加80 ng·mL-1TNF-α處理12 h組、只加200 μmol·L-1H2O2處理1 h組和200 μmol·L-1H2O2處理1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α處理12 h組,分別誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞后,用組織裂解液裂解細(xì)胞后收集H9c2細(xì)胞上清液,參照SOD酶活力檢測(cè)分析試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SOD活力,參照MDA檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA活性。

1.7 熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定炎癥因子mRNA的表達(dá)

H9c2細(xì)胞接種到六孔板中,細(xì)胞融合到70%～90%后棄去原培養(yǎng)基,再加入不同劑量的藥物進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)分為采用Control組、只加80 ng·mL-1TNF-α處理12 h組、只加200 μmol·L-1H2O2處理1 h組和200 μmol·L-1H2O2處理1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α處理12 h組誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞。隨后,PBS清洗3次,每孔加入1mL的TRIzol 試劑,4 ℃孵育10 min,將細(xì)胞吹散后,轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中,加入200 μL三氯甲烷后用力上下振蕩,室溫靜置10 min,后離心(4 ℃,12 000 r·min-1,15 min),吸取上清液至新的干凈EP管中,加入500 μL異丙醇,輕柔上下?lián)u晃混勻,靜置10 min后離心(4 ℃,12 000 r·min-1,15 min)。管壁可觀察到RNA沉淀,棄上清后加入1 mL 75%乙醇,靜置5 min后離心(4 ℃,12 000 r·min-1,15 min)。最后,吸掉多余上清,將RNA沉淀至于無(wú)菌操作臺(tái)晾干,加入20 μL DEPC水混勻,后利用超微量核酸分析儀測(cè)定濃度,判斷RNA樣品純度。為了測(cè)定各樣品的 TNF-α、IL-6、VCAM mRNA 表達(dá),TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并采用 SYBR Green PCR Master Mix 擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物,將cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR,利用熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工生物有限公司合成,引物序列如表1所示。對(duì)β-actin的mRNA表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,根據(jù)2(-ΔΔCt)法計(jì)算每種mRNA的基因表達(dá)的相對(duì)定量。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequence of target gene

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò) GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行處理,采用SPSS 26.0單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,以Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析,p<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

2 結(jié)果分析

2.1 不同濃度H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞的細(xì)胞活力和ROS水平的影響

采用CCK-8法測(cè)定H9c2細(xì)胞活力,如圖1A所示,與Control組(100%)相比,50、100、150、200、250、300、350 μmol·L-1H2O2組作用1 h后,H9c2細(xì)胞存活率分別下降至92%±1.6%、83%±1.4%、75%±3.5%、59%±2.6%、36%±1.9%、23%±0.29%、23%±0.21%。隨著H2O2濃度升高,大鼠心肌細(xì)胞細(xì)胞活力不斷降低。當(dāng)H2O2濃度高于100 μmol·L-1時(shí),細(xì)胞活力顯著下降,并呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系(p<0.05)。當(dāng)H2O2濃度為200 μmol·L-1時(shí),細(xì)胞存活率為59%±2.6%,表明細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài),但是當(dāng)細(xì)胞活力低于40%時(shí),細(xì)胞氧化損傷嚴(yán)重,無(wú)法進(jìn)行修復(fù)。

如圖1B所示,與Control組相比,不同濃度(50、100、150、200、250、300、350 μmol·L-1)H2O2作用1 h后,均對(duì)H9c2細(xì)胞造成了不同程度的氧化損傷。與Control組(100%)相比,50 μmol·L-1H2O2組H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平(97%±8.26%)無(wú)顯著性差異;100、150、200、250 μmol·L-1H2O2組H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升至 166%±14.8%、276%±3.04%、266%±13.9%、107%±4.78%;300、350 μmol·L-1H2O2組H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降至83%±12.6%、84%±10%。當(dāng)H2O2濃度為0～150 μmol·L-1時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(p<0.05),且呈劑量依賴性;當(dāng)H2O2濃度為150或200 μmol·L-1時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS水平達(dá)到最大。

結(jié)合H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞的細(xì)胞活力和ROS水平,初步將H2O2濃度設(shè)為200 μmol·L-1。此時(shí),ROS水平達(dá)到較高水平,細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài),不會(huì)導(dǎo)致立即細(xì)胞死亡,但在抗氧化活性物質(zhì)作用下,還可能被修復(fù)。

H2O2濃度/(μmol·L-1)

H2O2濃度/(μmol·L-1)

2.2 不同劑量TNF-α對(duì)H9c2細(xì)胞的細(xì)胞活力和ROS生成的影響

如圖2A所示,0(Control組),10、20、40、60、80、100、200 ng·mL-1TNF-α組H9c2細(xì)胞存活率分別為100%、112%±0.89%、109%±2%、107%±2%、107%±1.1%、110%±1%、111%±1.8%、106%±1.7%,與Control組相比,沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)。當(dāng)TNF-α低于200 ng·mL-1時(shí),對(duì)H9c2細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。

如圖2B所示,與Control組相比,與Control組(100%)相比,10、20、40、60、80、100、200 ng·mL-1TNF-α組H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平分別上升至103%±26.23%、168%±33.6%、169%±6%、126%±8.7%、213%±%、314%±40.6%。與Control相比,當(dāng)TNF-α作用濃度低于60 ng·mL-1時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS水平?jīng)]有顯著性差異(p>0.05);當(dāng)TNF-α作用濃度高于60 ng·mL-1時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著提高(p<0.05)。

TNF-α濃度/(ng·mL-1)

TNF-α濃度/(ng·mL-1)

2.3 不同劑量TNF-α對(duì)H9c2細(xì)胞中炎癥因子釋放的影響

如圖3A所示,0(Control組)、1、10、20、40、60、80、100 ng·mL-1TNF-α組作用12 h后,H9c2細(xì)胞上清液中IL-1β釋放量分別約為7.5、4.6、7.7、7.1、7.4、8.6、8.2、8.8 ng·mL-1。與Control組相比,不同劑量TNF-α作用12 h后,細(xì)胞上清液中IL-1β釋放量沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)。如圖3B所示,與Control組(4.4 ng·mL-1)相比,10、20、40、60、80、100 ng·mL-1TNF-α組作用12 h后,H9c2細(xì)胞上清液中TNF-α釋放量分別上升至6.5±0.3、6.7±0.45、6±0.34、7.9±0.4、7.1±0.59、5.3±0.3 ng·mL-1。當(dāng)使用TNF-α濃度高于10 ng·mL-1的TNF-α作用12 h后,細(xì)胞上清液中TNF-α釋放量顯著增強(qiáng)(p<0.05)。

TNF-α濃度/(ng·mL-1)

TNF-α濃度/(ng·mL-1)

綜合細(xì)胞內(nèi)ROS水平、上清液IL-1β釋放量、上清液TNF-α釋放量,初步選擇80 ng·mL-1TNF-α誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞炎癥損傷。此時(shí),ROS水平和上清液TNF-α釋放量均與Control組有顯著性差異,為Control組的2倍左右,提示出現(xiàn)炎癥損傷。

2.4 不同劑量H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1的TNF-α對(duì)H9c2細(xì)胞ROS水平的影響

與Control組相比,100、150、200 μmol·L-1H2O2作用1 h聯(lián)合80 ng·mL-1的TNF-α作用12 h后,各組H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平分別上升至456%±106.4%、639%±60%、845%±8.3%。當(dāng)H2O2濃度不斷增大時(shí),H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平也不斷增高。200 μmol·L-1H2O2作用1 h聯(lián)合80 ng·mL-1的TNF-α作用B12 h后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平增至最大,約為Control組的8.5倍。

TNF-α濃度/(ng·mL-1)

2.5 200 μmol·L-1 H2O2聯(lián)合不同劑量TNF-α對(duì)H9c2細(xì)胞炎癥因子蛋白表達(dá)的影響

采用200 μmol·L-1的H2O2處理1 h聯(lián)合不同劑量TNF-α處理12 h,與Control組相比,TNF-α相對(duì)蛋白表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異(p>0.05),但是,IL-6和ICAM的相對(duì)蛋白表達(dá)量顯著增加(p<0.05)。200 μmol·L-1的H2O2處理1 h聯(lián)合80 ng·mL-1的TNF-α處理12 h,炎癥因子ICAM相對(duì)蛋白表達(dá)量增至Control組的2.5倍,炎癥因子IL-6相對(duì)蛋白表達(dá)量增至Control組的2.2倍,顯著高于Control組,提示出現(xiàn)炎癥損傷。

綜合不同劑量H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1的TNF-α對(duì)H9c2細(xì)胞ROS水平以及不同劑量TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞炎癥因子蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果表明200 μmol·L-1的H2O2和80 ng·mL-1TNF-α聯(lián)合能同時(shí)誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激(ROS水平達(dá)到最大)和炎癥損傷(ICAM、IL-6和TNF-α炎癥因子等蛋白表達(dá)水平顯著高于Control組)。

圖5 不同劑量TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1 H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞炎癥因子蛋白表達(dá)的影響。A為不同劑量TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1 H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞ICAM蛋白表達(dá)的影響,B為不同劑量TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1 H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞TNF-α蛋白表達(dá)的影響,C為不同劑量TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1 H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞IL-6蛋白表達(dá)的影響.。不同字母(a,b,c,d)表示不同組別具有顯著性差異(p<0.05)。

為了驗(yàn)證200 μmol·L-1H2O2處理1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α作用12 h誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥損傷模型的建立是否成功,分別探索了Control組、單一的氧化損傷組(只加200 μmol·L-1H2O2作用1 h組)、單一的炎癥損傷組(只加80 ng·mL-1TNF-α作用12 h組)和聯(lián)合組(200 μmol·L-1H2O2作用1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α作用12 h組)的氧化損傷指標(biāo)(SOD和MDA水平)和炎癥損傷指標(biāo)(炎癥因子蛋白水平表達(dá)和基因水平表達(dá))方面的差異。若聯(lián)合組的氧化損傷指標(biāo)不亞于單一的氧化損傷組且炎癥損傷指標(biāo)不亞于單一的炎癥損傷組,則提示模型建立成功。

2.6 TNF-α聯(lián)合H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞SOD和MDA水平的影響

如圖6所示,與Control組相比,只加80 ng·mL-1TNF-α組的SOD和MDA水平?jīng)]有顯著性差異(p>0.05),說(shuō)明80 ng·mL-1TNF-α雖然能引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加,但并不引起抗氧化相關(guān)酶的變化。但是,加了200 μmol·L-1H2O2(200 μmol·L-1H2O2組和200 μmol·L-1H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α組)后,MDA水平顯著上升且SOD抗氧化酶活性顯著下降(p<0.05),SOD和MDA水平呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)。

圖6 TNF-α聯(lián)合H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞SOD和MDA水平的影響。A表示TNF-α聯(lián)合H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞SOD水平的影響,B表示TNF-α聯(lián)合H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞MDA水平的影響。不同字母(a,b)表示不同組別具有顯著性差異(p<0.05)。

2.7 TNF-α聯(lián)合H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞炎癥因子蛋白表達(dá)的影響

為了驗(yàn)證模型的成功與否,本研究用Western Blot法和Q-PCR分別探索了不同組別(Control組、只加80 ng·mL-1TNF-α作用12 h組、只加200 μmol·L-1H2O2作用1 h組和200 μmol·L-1H2O2作用1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α作用12 h組)炎癥因子蛋白表達(dá)和基因水平的影響。C通過(guò)Western Blot法探索炎癥因子蛋白表達(dá)的變化,從圖7可以看出:與Control組相比,只加200 μmol·L-1H2O2組的ICAM、VCAM和IL-6蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異(p>0.05),說(shuō)明只加200 μmol·L-1H2O2組并不引起炎癥因子蛋白表達(dá)的變化,200 μmol·L-1H2O2并不能誘導(dǎo)炎癥損傷。但是,與Control組相比,只加80 ng·mL-1TNF-α組和200 μmol·L-1H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α組的ICAM、VCAM和IL-6蛋白的表達(dá)顯著上升(p<0.05),說(shuō)明80 ng·mL-1TNF-α能提高炎癥因子蛋白表達(dá)。

圖7 TNF-α聯(lián)合H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞炎癥因子蛋白的影響。A表示TNF-α聯(lián)合H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞VCAM蛋白表達(dá)的影響。B表示TNF-α聯(lián)合H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞ICAM蛋白表達(dá)的影響。C表示TNF-α聯(lián)合H2O2對(duì)H9c2細(xì)胞IL-6蛋白表達(dá)的影響。不同字母(a,b)表示不同組別具有顯著性差異(p<0.05)。

基因可以調(diào)節(jié)蛋白表達(dá),因此本研究檢測(cè)了促炎因子VCAM、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平。從圖8可以看出:與Control組相比,只加200 μmol·L-1H2O2組的VCAM、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異(p>0.05),說(shuō)明只加200 μmol·L-1H2O2組并不引起炎癥因子VCAM、IL-6和TNF-α的mRNA的表達(dá)。但是,與Control組相比,只加80 ng·mL-1TNF-α組和200 μmol·L-1H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α組的VCAM、IL-6和TNF-α的mRNA的表達(dá)顯著上升(p<0.05),說(shuō)明80 ng·mL-1TNF-α能提高炎癥因子mRNA的表達(dá)。

VCAM

IL-6

TNF-α

3 討論

心血管疾病進(jìn)程中,活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)大量累積,使心肌細(xì)胞凋亡[10]。心血管疾病發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜,很多心血管疾病與氧化應(yīng)激和慢性炎癥密不可分。如動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死,氧化應(yīng)激和系統(tǒng)性炎癥是其最突出的特征[11,12]。氧化應(yīng)激增加了炎癥反應(yīng),持續(xù)的炎癥產(chǎn)生了大量的活性氧。

本研究采用TNF-α聯(lián)合H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞,同時(shí)建立細(xì)胞氧化應(yīng)激和慢性炎癥模型。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù),發(fā)現(xiàn)200 μmol·L-1H2O2刺激H9c2細(xì)胞1 h細(xì)胞存活率為55%;細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增至266%,初步以200 μmol·L-1H2O2刺激H9c2細(xì)胞1 h用于構(gòu)建H9c2細(xì)胞氧化損傷模型。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)采用80 ng·mL-1TNF-α刺激H9c2細(xì)胞12 h,與Control組相比,細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著性差異(p>0.05),細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平增至213%。上清液中IL-1β釋放量沒(méi)有顯著性差異(p>0.05),上清液中IL-6釋放量顯著增加至Control組的1.6倍,初步以80 ng·mL-1TNF-α刺激H9c2細(xì)胞12 h用于構(gòu)建H9c2細(xì)胞炎癥損傷模型。接著,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)探索不同劑量H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1的TNF-α對(duì)H9c2細(xì)胞ROS水平的影響,發(fā)現(xiàn)200 μmol·L-1H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α使H9c2細(xì)胞ROS水平增至Control組的8.5倍。本研究通過(guò)Western Blot法探索200 μmol·L-1H2O2聯(lián)合不同劑量TNF-α對(duì)H9c2細(xì)胞炎癥因子的影響,發(fā)現(xiàn)與Control組相比,TNF-α相對(duì)蛋白表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異(p>0.05),但炎癥因子ICAM相對(duì)蛋白表達(dá)量增至Control組的2.5倍,炎癥因子IL-6相對(duì)蛋白表達(dá)量增至Control組的2.2倍。所以,80 ng·mL-1TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1H2O2顯著增強(qiáng)H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS水平,顯著增強(qiáng)上清液中炎癥因子IL-6釋放量,顯著增加ICAM和IL-6炎癥因子蛋白的表達(dá)(p<0.05)。說(shuō)明80 ng·mL-1TNF-α聯(lián)合200 μmol·L-1H2O2既誘導(dǎo)了細(xì)胞氧化應(yīng)激,又誘導(dǎo)了細(xì)胞炎癥損傷。

為驗(yàn)證此模型的成功與否,本研究探索了不同組別(Control組、只加80 ng·mL-1TNF-α組、只加200 μmol·L-1H2O2組和200 μmol·L-1H2O2聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α組)對(duì)SOD、MDA氧化應(yīng)激指標(biāo)的差異,以及對(duì)相關(guān)炎癥因子在蛋白表達(dá)和基因調(diào)控上的差異。超氧化物歧化酶( SOD)是一種調(diào)控氧化應(yīng)激的酶,催化超氧陰離子和H2O2之間的反應(yīng),平衡氧化和抗氧化,保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[13]。丙二醛 (MDA) 是一種脂質(zhì)過(guò)氧化物,它在體內(nèi)的大量累積會(huì)對(duì)人體細(xì)胞、組織都有一定的損害。SOD水平反映細(xì)胞的抗氧化能力,MDA可以間接反映細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激造成的損傷程度[14]。SOD水平降低和MDA 的增加都心肌細(xì)胞氧化損傷加重。與Control組相比,加了200 μmol·L-1H2O2組MDA水平顯著上升且SOD水平顯著下降(p<0.05),只加80 ng·mL-1TNF-α組SOD 和 MDA水平?jīng)]有顯著性差異(p>0.05)。隨后,本研究分別探索了蛋白和基因方面相關(guān)炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果表明,加了80 ng·mL-1TNF-α組,在蛋白和基因水平上,一些炎癥因子的表達(dá)均顯著提高,尤其是一些黏附因子,如VCAM在mRNA表達(dá)上是Control組的350倍左右,并且在蛋白表達(dá)上是Control組的4倍左右,ICAM在蛋白表達(dá)上是Control組的3倍左右。而這些抗炎因子都是NF-κB信號(hào)通路的下游蛋白,結(jié)果提示200 μmol·L-1H2O2處理1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α處理12 h共同誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞激活NF-κB信號(hào)通路下游蛋白和mRNA的表達(dá),而NF-κB信號(hào)通路的異常激活與心肌細(xì)胞損傷有密切聯(lián)系[15,16]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB( Nuclear factor κB,NF-κB) 作為一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的重要核因子,在腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫應(yīng)答和炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[17,18]。

綜上所述,200 μmol·L-1H2O2處理1 h聯(lián)合80 ng·mL-1TNF-α處理12 h共同誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)ROS顯著增高,氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA水平增高,抗氧化酶SOD降低,并激活NF-κB信號(hào)通路下游炎癥因子蛋白和mRNA的表達(dá)。其作用機(jī)理可能與NF-κB信號(hào)通路的靶向調(diào)節(jié)有關(guān),結(jié)果可為進(jìn)一步研究其氧化應(yīng)激和慢性炎癥反應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。