代謝物組學(xué)和細(xì)胞因子譜學(xué)探討顱內(nèi)動脈瘤破裂的危險因素研究

劉清源，姜朋軍，王碩，吳俊

顱內(nèi)動脈瘤破裂是導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血的主要因素[1]，判斷動脈瘤是否具有較高的破裂風(fēng)險，對于制訂未破裂顱內(nèi)動脈瘤（unruptured intracranial aneurysm，UIA）的治療策略有重要意義。炎癥和顱內(nèi)動脈瘤破裂密切相關(guān)[2-3]，既往文獻顯示，相比于UIA，破裂顱內(nèi)動脈瘤（ruptured intracranial aneurysm，RIA）的瘤壁存在大量炎癥細(xì)胞浸潤和基質(zhì)降解的特點[4]。進一步研究表明，炎癥相關(guān)因素（如瘤壁增強和炎癥相關(guān)蛋白）可以用來區(qū)分RIA和UIA，并有可能作為預(yù)測顱內(nèi)動脈瘤生長破裂風(fēng)險的指標(biāo)[5]。

代謝物和細(xì)胞因子是可以影響血管壁的微環(huán)境[6]。細(xì)胞因子主要包括促炎因子、抑炎因子和趨化因子等，參與免疫反應(yīng)和細(xì)胞焦亡等病理生理過程。既往文獻顯示，IL-1β等細(xì)胞因子在動脈粥樣硬化和腦梗死等疾病的發(fā)展過程中起到了重要的作用[7-10]，同時也發(fā)現(xiàn)，代謝物參與了腦梗死、心力衰竭、腹主動脈瘤破裂等心腦血管疾病。由此可見，深入探討顱內(nèi)動脈瘤患者代謝組學(xué)和細(xì)胞因子譜學(xué)特點，有助于發(fā)掘和顱內(nèi)動脈瘤破裂有關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物。

本前瞻性研究收集了單發(fā)顱內(nèi)動脈瘤行手術(shù)治療患者的動脈瘤組織和血清樣本，利用代謝組學(xué)和細(xì)胞因子譜學(xué)的方法分析代謝物和細(xì)胞因子，并探討與顱內(nèi)動脈瘤破裂有關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究收集了2020年1月—2022年1月因單發(fā)顱內(nèi)動脈瘤在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)治療的患者。根據(jù)患者入院時顱內(nèi)動脈瘤是否破裂，將患者分為RIA組和UIA組。本研究已經(jīng)通過倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號：KY2017-076-01）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～75歲；②經(jīng)CTA或者DSA證實顱內(nèi)單發(fā)囊性動脈瘤[11]；③動脈瘤經(jīng)過開顱夾閉治療，并能獲得動脈瘤的組織樣本；④患者同意參與本研究，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腦血管畸形（如腦動靜脈畸形和海綿狀血管瘤）和腦腫瘤（如腦膜瘤、膠質(zhì)瘤或者垂體瘤）；②動脈瘤為夾層性或者血栓性；③動脈瘤為創(chuàng)傷性或者心房黏液瘤性；④動脈瘤家族病史；⑤多囊腎、結(jié)締組織疾病或者風(fēng)濕免疫性疾??；⑥既往接受過動脈瘤相關(guān)的手術(shù)治療，或為復(fù)發(fā)顱內(nèi)動脈瘤。

1.2 資料收集 收集患者的年齡、性別、合并疾病情況（原發(fā)性高血壓、血脂異常、糖尿病、TIA或腦梗死、冠心病）、吸煙史（未戒煙或戒煙時間＜1年）、飲酒史（每周喝酒至少1次）和用藥史（阿司匹林和他汀類服用情況）。

基于患者術(shù)前的CTA和DSA，本研究采用MIMICS軟件（17.0版，Mimics Research公司，比利時）對動脈瘤進行三維重建，并進一步分析以下指標(biāo)：動脈瘤位置（大腦前動脈或前交通動脈、頸內(nèi)動脈、大腦中動脈和后循環(huán)）、動脈瘤大小（從瘤頸平面中心到動脈瘤頂?shù)淖钸h(yuǎn)距離）、動脈瘤形態(tài)是否規(guī)則（動脈瘤是否有子瘤或動脈瘤呈分葉狀）。

1.3 樣本收集及代謝組學(xué)和細(xì)胞因子檢測 基于動脈瘤組織樣本和患者的血清樣本，進行代謝組學(xué)和細(xì)胞因子譜學(xué)分析。術(shù)中夾閉動脈瘤，切取動脈瘤頂部分組織，生理鹽水清洗可見的血塊，吸水紙干燥樣本，樣本保存于液氮中。進行代謝組學(xué)和細(xì)胞因子譜學(xué)分析前，將合適大小的動脈瘤組織研磨成粉，用細(xì)胞組織快速裂解液溶解組織粉末，在4 ℃條件下裂解20 min，1000轉(zhuǎn)/分鐘4 ℃離心20 min，收集上清液進行下一步檢測。

所有患者均在行術(shù)前準(zhǔn)備后（空腹8 h后）、麻醉前采集靜脈血樣。血樣采集后3 h內(nèi)，1000轉(zhuǎn)/分鐘 4 ℃離心10 min，收集血清并儲存在液氮中。基于動脈瘤組織和患者血清樣本，非靶向代謝組學(xué)的檢測方法采用液相色譜質(zhì)譜連用法，在Q-TOF質(zhì)譜平臺（Triple TOF 5600TM，Thermo公司，美國）上完成?；趧用}瘤組織和患者血清樣本，靶向代謝組的檢測采用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測法，在TRAP質(zhì)譜平臺（API 6500Q，AB SCIEX，美國）上完成。細(xì)胞因子檢測在Bio-Plex MAGPIX平臺（Bio-Rad公司，美國）上進行，運用Luminax抗體預(yù)孵育芯片（Bio-Rad公司，美國）檢測46個細(xì)胞因子。計算RIA和UIA的代謝物和細(xì)胞因子表達(dá)水平的平均值，最后計算倍數(shù)值（fold change，F(xiàn)C），公式為其中RIA和UIA之間，具備|log1.5FC|＞1且P＜0.05的代謝物和細(xì)胞因子，為具有統(tǒng)計學(xué)差異的分子。進一步用ROC檢驗動脈瘤組織中和血清中的代謝物和細(xì)胞因子表達(dá)水平是否能區(qū)分RIA和UIA，結(jié)果用AUC表示。AUC＞0.7被認(rèn)為參數(shù)能較好地區(qū)分RIA和UIA。如果代謝物和細(xì)胞因子的表達(dá)水平在組織和血清中存在相關(guān)性，且能較好地區(qū)分RIA和UIA，則被認(rèn)為是顱內(nèi)動脈瘤破裂的潛在生物標(biāo)志物。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 20.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用采用χ2檢驗、Fisher確切概率檢驗或非參數(shù)檢驗。符合正態(tài)分布的計量資料用表示，不符合正態(tài)分布的計量資料用M（P25～P75）表示，組間比較采用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。Spearman相關(guān)性檢驗分析代謝物和細(xì)胞因子在組織和血清中表達(dá)水平的相關(guān)性。以顱內(nèi)動脈瘤破裂為因變量，將單因素分析中P＜0.05且受試者曲線分析中AUC＞0.7的參數(shù)作為自變量進行多因素logistic回歸分析，從中篩選和顱內(nèi)動脈瘤破裂相關(guān)的獨立相關(guān)因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RIA組和UIA組臨床特點比較 本研究共納入25例RIA患者和31例UIA患者，其中33例為男性，納入患者的平均年齡為（55±10）歲。17例（30.4%）動脈瘤的大?。? mm，30例（53.6%）動脈瘤的大小為7～10 mm，9例（16.0%）動脈瘤的大?。?0 mm。對比RIA組和UIA組間的患者臨床、動脈瘤影像學(xué)特點，年齡、性別、原發(fā)性高血壓、血脂異常、糖尿病、TIA或者腦梗死、冠心病、吸煙史、飲酒史、阿司匹林和他汀類藥物服用情況、動脈瘤位置、動脈瘤大小和動脈瘤形態(tài)不規(guī)則等資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

表1 RIA和UIA組基線資料對比

2.2 RIA組和UIA組間的動脈瘤組織代謝物和細(xì)胞因子差異 主要成分分析顯示，RIA和UIA之間的代謝組學(xué)和細(xì)胞因子譜學(xué)特征存在分群差異（圖1A）。進一步行聚類分析發(fā)現(xiàn)，代謝物和細(xì)胞因子在RIA和UIA之間具有明顯的聚類特點（圖1B）。對比RIA和UIA之間的代謝組學(xué)和細(xì)胞因子譜學(xué)特征的差異，發(fā)現(xiàn)43個代謝物和5個細(xì)胞因子（FC的絕對值＞1，且P＜0.05）在RIA和UIA之間存在統(tǒng)計學(xué)差異（圖1C～D）。

圖1 RIA和UIA組間的代謝組學(xué)和細(xì)胞因子譜學(xué)差異

2.3 RIA組和UIA組的血清代謝物和細(xì)胞因子差異 進一步行代謝物的分類富集分析顯示，RIA和UIA組織之間的差異代謝物主要是脂質(zhì)、脂質(zhì)類似物和脂肪?；愇镔|(zhì)（圖2A）。通路富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異代謝物主要參與不飽和脂肪酸的合成，而富集于該通路的3個代謝物（油酸、花生四烯酸和α-亞麻酸）也屬于脂質(zhì)、脂質(zhì)類似物和脂肪?；愇镔|(zhì)（圖2 B）。在R I A 和U I A 組織之間的差異細(xì)胞因子中，I L-1β、單核細(xì)胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、I L-6 和TNF-α 為促炎因子，而I L-1受體拮抗劑（IL-1 receptor antagonist，I L-1ra）為抗炎因子（圖2C）。本研究進一步分析了患者血清中代謝物和細(xì)胞因子的表達(dá)情況（圖2D、表2）。其中油酸、花生四烯酸、IL-1β、MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-1ra在RIA和UIA患者之間存在統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05），而α-亞麻酸未見統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.108）。

圖2 脂質(zhì)相關(guān)分子和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子與RIA相關(guān)

表2 RIA和UIA組血清代謝物和細(xì)胞因子水平比較

2.4 組織和血清中代謝物和細(xì)胞因子表達(dá)水平的相關(guān)性 油酸（r2=0.554，P＜0.001）、花生四烯酸（r2=0.527，P＜0.001）、IL-1β（r2=0.592，P＜0.001）、IL-1ra（r2=0.160，P＜0.001）和TNF-α（r2=0.246，P＜0.001）的表達(dá)水平有正相關(guān)性（圖3A）；而α-亞麻酸、IL-6、MCP-1的表達(dá)量在組織和血清之間不具有相關(guān)性（均P＞0.05）。進一步的ROC分析顯示，不論是組織中還是血清中的油酸、花生四烯酸和IL-1β的表達(dá)水平，均能很好地區(qū)分RIA和UIA（均AUC＞0.7，圖3B）。結(jié)合動脈瘤組織中和血清中油酸、花生四烯酸和IL-1β在RIA和UIA之間存在差異這一事實，可見這些分子是RIA的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

圖3 脂質(zhì)相關(guān)分子和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子在動脈瘤組織和血清中的表達(dá)量存在相關(guān)性

2.5 顱內(nèi)動脈瘤破裂的相關(guān)危險因素 動脈瘤組織和血清分析顯示，油酸、花生四烯酸和IL-1β在RIA和UIA之間的表達(dá)水平存在統(tǒng)計學(xué)差異。且組織中和血清中油酸、花生四烯酸和IL-1β的表達(dá)水平存在正相關(guān)性。同時ROC顯示，油酸、花生四烯酸和IL-1β能較好地區(qū)分RIA和UIA。因此油酸、花生四烯酸和IL-1β是能較好區(qū)分RIA和UIA的生物學(xué)標(biāo)志物?；谶@3個生物標(biāo)志物，進一步行單因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示低血清油酸水平（OR0.74，95%CI0.64～0.85，P＜0.001）、高血清油酸水平（OR1.03，95%CI1.01～1.05，P=0.006）和高血清IL-1β水平（OR1.02，95%CI1.00～1.03，P=0.010）是動脈瘤表現(xiàn)為RIA的危險因素。進一步行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示低血清油酸水平是動脈瘤表現(xiàn)為RIA的獨立危險因素（表3）。

表3 顱內(nèi)動脈瘤破裂獨立相關(guān)因素的多因素分析結(jié)果

3 討論

代謝物和細(xì)胞因子和腦血管病代謝密切相關(guān)。本研究通過分析56例顱內(nèi)動脈瘤組織樣本和血清樣本的代謝組學(xué)和細(xì)胞因子譜學(xué)特點，發(fā)現(xiàn)RIA具有脂質(zhì)代謝異常和炎癥相關(guān)細(xì)胞因子分泌異常的特點。油酸、花生四烯酸和IL-1β在動脈瘤組織和血清中的表達(dá)水平具有相關(guān)性，且ROC顯示，油酸、花生四烯酸和IL-1β較好地區(qū)分RIA和UIA。因此，油酸、花生四烯酸和IL-1β可能是評估顱內(nèi)動脈瘤破裂風(fēng)險的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

代謝物參與了諸多心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展，并可以導(dǎo)致血管炎癥和血管粥樣硬化的發(fā)生[12]。而伴有炎癥和粥樣硬化的動脈瘤壁重構(gòu)是RIA的重要病理生理學(xué)特點[13]。本研究通過代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)RIA中存在脂質(zhì)代謝異常的特點。同時，相比于UIA，在RIA組織和血清中，存在油酸表達(dá)量降低，而花生四烯酸表達(dá)量升高的現(xiàn)象。既往研究顯示，脂質(zhì)代謝異常和粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)[14-15]?；ㄉ南┧峥梢宰鳛榄h(huán)氧化酶1的底物，促進血管壁的炎癥[16]。油酸可以作為粥樣硬化抑制因子，促進平滑肌細(xì)胞的增殖，抑制血管炎癥的發(fā)生[17]。因此，在進一步的臨床試驗中，可以考慮將油酸和花生四烯酸納入評估顱內(nèi)動脈瘤破裂風(fēng)險的生物學(xué)標(biāo)志物。

IL-1β可以被免疫細(xì)胞釋放進入循環(huán)系統(tǒng)或者組織間隙中，通過IL-1受體作用誘導(dǎo)細(xì)胞的焦亡反應(yīng)[7，18]。而焦亡反應(yīng)會進一步誘發(fā)局部的炎癥細(xì)胞聚集，從而導(dǎo)致組織的炎癥浸潤。既往研究中發(fā)現(xiàn)，IL-1β水平和血管的粥樣硬化密切相關(guān)[8]。而大面積的粥樣硬化導(dǎo)致的血管壁重塑同樣也是R IA的重要病理特點[13]。既往動物實驗也發(fā)現(xiàn)，抑制小鼠全身的IL-1β水平后，可以降低顱內(nèi)動脈瘤破裂風(fēng)險[19]。顱內(nèi)動脈瘤的生長破裂是損傷和修復(fù)失衡的結(jié)果[20]。本研究中還發(fā)現(xiàn)IL-1ra在高風(fēng)險顱內(nèi)動脈瘤患者中顯著降低。IL-1β可以促進炎癥，而IL-1ra可以通過結(jié)合IL-1受體從而起到抑制IL-1β生物學(xué)作用的效果[21]。因此，IL-1β升高而IL-1ra降低的現(xiàn)象，提示RIA中存在炎癥調(diào)節(jié)失衡的現(xiàn)象?？梢?，血清IL-1β水平可能作為評估顱內(nèi)動脈瘤破裂風(fēng)險的生物學(xué)標(biāo)志物，結(jié)合血清IL-1β和IL-1ra的情況可反映患者全身炎癥的平衡狀態(tài)。本研究還發(fā)現(xiàn)血清中MCP-1、TNF-α和IL-1ra的表達(dá)水平在RIA和UIA患者之間存在差異。但進一步分析顯示，MCP-1在動脈瘤組織和血清中的表達(dá)水平不存在相關(guān)性，同時MCP-1、TNF-α和IL-1ra在動脈瘤組織中的表達(dá)水平不能較好的區(qū)分RIA和UIA。這可能是由于MCP-1、TNF-α和IL-1ra的表達(dá)水平還受到其他合并疾病影響，且與顱內(nèi)動脈瘤的相關(guān)性較弱有關(guān)。

本研究存在局限性。第一，本研究雖然對血樣采集和檢測進行了質(zhì)量控制，但可能存在其他因素對代謝物和細(xì)胞因子水平產(chǎn)生影響。第二，本研究為斷面研究，不能很好地反映動脈瘤的自然破裂風(fēng)險。第三，多因素logistic回歸分析只顯示油酸為動脈瘤破裂的獨立危險因素，這可能是本研究為單中心的小樣本研究所致。第四，由于考慮到破裂狀態(tài)會對血清細(xì)胞因子水平產(chǎn)生影響[22]，導(dǎo)致本研究存在患者選擇偏移。盡管存在以上局限性，本研究探討了RIA的代謝組學(xué)和細(xì)胞因子譜學(xué)特點，為探討顱內(nèi)動脈瘤破裂的生物學(xué)標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)。

【點睛】本研究基于顱內(nèi)動脈瘤的組織和相應(yīng)的血清樣本，運用多組學(xué)的分析方法，發(fā)現(xiàn)油酸、花生四烯酸和IL-1β是評估顱內(nèi)動脈瘤破裂風(fēng)險的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。本研究為探討顱內(nèi)動脈瘤破裂的生物學(xué)標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)。