DNA甲基化與高同型半胱氨酸血癥

甕佳旭，周宏宇，李子孝，3，4

高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）與動脈粥樣硬化性血管病的關(guān)聯(lián)源于McCully[1]對一名有HHcy的8歲男孩進(jìn)行尸檢時，發(fā)現(xiàn)了廣泛的動脈血栓和動脈粥樣硬化病灶形成。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，有40%被診斷為早發(fā)冠狀動脈疾病、外周血管疾病或復(fù)發(fā)性靜脈血栓形成的患者存在HHcy[2]。多項(xiàng)研究表明HHcy是心血管疾病的獨(dú)立危險因素，并可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙有關(guān)[1，3-5]。DNA甲基化作為基因表達(dá)表觀遺傳調(diào)控的重要形式之一，其水平異常在伴有HHcy的心血管疾病患者中也有報道[6-7]。由Hcy和甲硫氨酸（methionine，Met）共同參與的Met-Hcy（methionine-homocysteine，M-H）循環(huán)可為甲基化反應(yīng)提供甲基單元，其代謝關(guān)鍵酶功能缺陷或輔酶因子缺乏所導(dǎo)致的Hcy水平升高可在整體或位點(diǎn)特異性水平參與DNA甲基化的調(diào)節(jié)[8]。這可能是HHcy增加動脈粥樣硬化和心腦血管疾病風(fēng)險的潛在機(jī)制之一。

1 Hcy的來源、代謝途徑及影響因素

Hc y是人體內(nèi)一種含硫的非必需氨基酸，主要來源于食物中攝取的必需氨基酸Met（也稱為蛋氨酸）[9]。Met在甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（methionine adenosyltransferase，MAT）的催化和ATP的參與下生成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM），SAM通過甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，D N M Ts）將甲基轉(zhuǎn)移至D N A、R N A、蛋白質(zhì)等分子后，形成S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl-L-homocysteine，SAH），再被SAH水解酶（SAH hydrolase，SAHH）水解脫去腺苷后生成Hcy（圖1）。目前普遍認(rèn)為這是人體產(chǎn)生Hcy的唯一途徑[10]。

圖1 同型半胱氨酸的生成與代謝循環(huán)

Hcy在人體內(nèi)通過再甲基化和轉(zhuǎn)硫化兩個途徑完成代謝[11]。再甲基化途徑是指Hcy在酶催化下結(jié)合甲基再次生成Met的過程。根據(jù)提供甲基的化學(xué)物不同，再甲基化途徑分為由5-甲基四氫葉酸（5-methyltetrahydrofolate，5-MTHF）提供甲基的葉酸循環(huán)途徑和由三甲基甘氨酸（又名甜菜堿）提供甲基的甜菜堿循環(huán)途徑。葉酸循環(huán)途徑在甲硫氨酸合成酶（methionine synthetase，MS）的催化下，以維生素B12為輔酶完成[12]。其中，葉酸的活化形式四氫葉酸在5-MTHF生成過程中發(fā)揮重要作用，在被絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（hydroxylmethyl transferase，SHMT）轉(zhuǎn)化為5，10-亞甲基四氫葉酸后，由亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）還原生成5-MTHF，為Hcy葉酸循環(huán)途徑提供甲基。這個過程幾乎存在于所有的細(xì)胞中[13]。肝臟和腎臟中也可以發(fā)生由甜菜堿—同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（betainehomocysteine methyltransferase，BHMT）催化完成的甜菜堿循環(huán)[14-15]。轉(zhuǎn)硫途徑是指Hcy在胱硫醚β合酶（cysteine beta synthase，CBS）的催化下，以維生素B6作為輔酶因子，與絲氨酸結(jié)合生成胱硫醚，之后γ胱硫醚酶將胱硫醚水解為半胱氨酸，再由谷胱甘肽合成酶催化合成谷胱甘肽隨尿液排出[16-17]。

體內(nèi)大部分Hcy以二硫鍵與血漿蛋白結(jié)合，在正常情況下保持穩(wěn)定水平，正常值為5～15 μmol/L[18]。當(dāng)Hcy生成或代謝途徑受遺傳或非遺傳因素影響，出現(xiàn)膳食中葉酸、維生素B12和維生素B6缺乏或相關(guān)酶缺陷時，Hcy的穩(wěn)定水平被打破，在人體中發(fā)生聚積[19-21]。當(dāng)血漿中Hcy的濃度增加至15 μmol/L以上時，即為HHcy。

2 HHcy影響sDNA甲基化水平

較多研究表明，Hcy水平可影響整體的DNA甲基化水平。例如：在葉酸和維生素B12缺乏、Hcy代謝酶基因MTHFRC677T型突變的群體中可檢測到Hcy水平升高、DNA甲基化水平降低[22]。在HHcy小鼠模型和HHcy患者的動脈粥樣硬化斑塊中均可觀察到整體DNA呈低甲基化狀態(tài)[23-24]。通過檢測動脈粥樣硬化性血管病變患者和匹配后的健康對照者血漿中Hcy和白細(xì)胞中的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化性血管病變患者的Hcy水平升高、SAM/SAH比值和DNA甲基化水平降低[25]。研究結(jié)論為DNA甲基化的狀態(tài)與血漿Hcy水平顯著相關(guān)。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，Mthfr缺陷小鼠的大腦和卵巢中DNA呈低甲基化水平[26]。有研究顯示，妊娠早期葉酸缺乏與嬰兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷風(fēng)險增高有關(guān)，DNA低甲基化可能是相關(guān)機(jī)制之一[27]。Pogribny等[28]給雄性大鼠喂食葉酸缺乏飲食9周，檢測發(fā)現(xiàn)大鼠血漿中SAM濃度、SAM/SAH比值降低，肝臟整體DNA甲基化水平降低。以上研究均證明Hcy水平升高可能與DNA甲基化水平的降低有關(guān)。

Hc y水平與DNA甲基化的關(guān)系可能與M-H循環(huán)中葉酸循環(huán)途徑的代謝平衡有關(guān)。首先，在哺乳動物中，SAM是甲基化反應(yīng)的甲基供體，SAM及其反應(yīng)產(chǎn)物SAH的濃度可調(diào)節(jié)DNA甲基化反應(yīng)[29-30]。其次，SAH可以與DNMTs的催化區(qū)域高親和力結(jié)合，成為強(qiáng)有力的競爭性甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，因此SAH的快速去除對甲基化反應(yīng)效率至關(guān)重要[31]。在Hcy生成過程中，SAH水解為Hcy作為可逆反應(yīng)，趨向于SAH的合成明顯優(yōu)于水解。因此，Hcy的快速代謝對于SAH的水解也非常重要，Hcy積聚會造成SAH積聚，進(jìn)而引起甲基化反應(yīng)抑制，導(dǎo)致DNA甲基化水平降低[32]。因此，目前觀點(diǎn)認(rèn)為Hcy通過M-H循環(huán)中的SAM和SAH與DNA甲基化形成連接，占據(jù)了一碳代謝和表觀遺傳修飾之間的重要連接點(diǎn)[8]。

有研究在小鼠模型中探索了Hcy升高的情況下，SAH積聚與細(xì)胞低甲基化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Cbs基因缺陷小鼠表現(xiàn)出Hcy及SAH增加，肝臟和大腦中蛋白甲基化狀態(tài)降低，但整體DNA甲基化狀態(tài)未受影響[33-34]。研究結(jié)果提示，整體DNA低甲基化可能不參與小鼠Cbs基因突變的病理生理學(xué)過程，但并不能排除有特定位點(diǎn)DNA甲基化異常的可能性。因此，在未來的研究中分析全基因組DNA甲基化的狀態(tài)變化是有必要的。

3 HHcy相關(guān)DNA甲基化與動脈粥樣硬化

在動脈粥樣硬化患者中經(jīng)常觀察到Hcy水平升高，有研究認(rèn)為HHcy對DNA甲基化的影響可能是心血管疾病風(fēng)險增加的機(jī)制之一，這可能與動脈粥樣硬化發(fā)病過程中的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、平滑肌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、脂質(zhì)代謝等過程有關(guān)[35-37]。

3.1 內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞功能障礙 目前認(rèn)為血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞功能障礙是動脈粥樣硬化發(fā)展過程中的重要階段，并預(yù)示著不良的心血管結(jié)局[38]。

有研究認(rèn)為HHc y通過影響DNA甲基化從而在內(nèi)皮細(xì)胞的衰老過程中發(fā)揮作用。Zhang等[39]發(fā)現(xiàn)，體外HHcy條件下培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）在傳代期間出現(xiàn)p16、p21和p53等細(xì)胞衰老標(biāo)志物的加速上調(diào)，通過實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)、甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)檢測，發(fā)現(xiàn)了端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）基因啟動子區(qū)域的低甲基化。內(nèi)皮細(xì)胞在一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的催化下合成一氧化氮（nitric oxide，NO），可抑制血小板黏附、平滑肌細(xì)胞增殖和LDL-C的氧化[40]。在體外HHcy條件下培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可以檢測到NOS的抑制劑——不對稱二甲基精氨酸表達(dá)含量增加，并導(dǎo)致NO合成抑制、內(nèi)皮細(xì)胞破壞，從而激活動脈粥樣硬化過程[41]。其中的機(jī)制與HHcy條件下二甲基精氨酸二甲胺水解酶（dimethylarginine dimethyl amino hydrolase，DDAH）基因啟動子區(qū)域的甲基化水平降低有關(guān)[42]。上述研究表明，HHcy對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響可能與DNA甲基化有關(guān)。

血管平滑肌細(xì)胞的增殖和去分化參與動脈粥樣硬化形成的病理過程[43]。血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）基因是血管平滑肌細(xì)胞增殖的有效促分裂劑[44]。Han等[45]在不同梯度濃度的Hcy條件下培養(yǎng)人血管平滑肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞增殖數(shù)量、PDGF表達(dá)水平隨Hcy濃度增高而增加，PDGF啟動子甲基化的水平隨Hcy濃度增加而降低。進(jìn)一步的評估發(fā)現(xiàn)，Hcy處理組細(xì)胞內(nèi)SAH的濃度較對照組增加，SAM較對照組濃度降低，SAM/SAH比值顯著降低。這與HHcy導(dǎo)致DNA去甲基化水平降低的機(jī)制相符，表明HHcy可能影響PDGF啟動子區(qū)域的低甲基化，導(dǎo)致PDGF表達(dá)、刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)動脈粥樣硬化的加速發(fā)展。

3.2 脂質(zhì)代謝 有證據(jù)表明DNA甲基化異?？赡苁荋Hcy相關(guān)脂質(zhì)代謝異常的重要作用機(jī)制。一項(xiàng)調(diào)查了152例妊娠中期女性維生素B12和脂質(zhì)關(guān)系的隊(duì)列研究提示，維生素B12水平較低的妊娠期女性Hcy水平顯著升高，脂肪細(xì)胞中SAH濃度增加，同時血漿TC、LDL-C、TC/HDL-C水平升高。進(jìn)一步的全基因組DNA甲基化測序分析發(fā)現(xiàn)，這種變化與膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（sterol regulatory element binding transcription factor 1，SREBF1）基因，以及低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDLR）基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)甲基化水平降低同步[46]。

有動物實(shí)驗(yàn)使用高M(jìn)et飲食喂養(yǎng)載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠20周，檢測發(fā)現(xiàn)小鼠血清Hcy升高、SAH聚集和DNMT1表達(dá)水平降低，基因組分析表明，HHcy組小鼠脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acidbinding protein 4，F(xiàn)abp4）基因啟動子區(qū)域甲基化降低，F(xiàn)ABP4的表達(dá)增加[47]。FABP4作為脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中長鏈脂肪酸和視黃酸的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其表達(dá)增高可增加TC和TG的積累，在上述試驗(yàn)中測量主動脈根部動脈粥樣硬化斑塊面積時，HHcy組小鼠較對照組病灶面積明顯增大[48]。除此之外，HHcy條件下體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞72 h后，實(shí)驗(yàn)組Fabp4基因啟動子甲基化水平顯著降低，F(xiàn)abp4mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)[48]。這提示，F(xiàn)abp4啟動子區(qū)域低甲基化在HHcy介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝紊亂中可能發(fā)揮重要作用。上述HHcy動物模型實(shí)驗(yàn)的結(jié)果支持并擴(kuò)展了動脈粥樣硬化發(fā)展過程中的體內(nèi)、體外機(jī)制，證明HHcy可能對脂質(zhì)代謝過程中的DNA甲基化產(chǎn)生影響，從而加速動脈粥樣硬化的形成。

4 HHcy與DNA甲基化對心血管危險因素的影響

HHcy與DNA甲基化的關(guān)聯(lián)在糖尿病等心血管疾病的危險因素中也有體現(xiàn)。一項(xiàng)研究選取了85例糖尿病患者和30例健康受試者作為對照，分別采集單純性糖尿病組、早期糖尿病腎病組、臨床糖尿病腎病組和正常對照組外周血白細(xì)胞DNA，測定MTHFR基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)及血清中Hcy水平，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，單純性糖尿病組、早期或臨床糖尿病腎病組均具有更高的Hcy水平，且MTHFR基因啟動子區(qū)域呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)[49]。該研究顯示，HHcy與MTHFR啟動子低甲基化有明顯關(guān)聯(lián)，且此種關(guān)聯(lián)與糖尿病有關(guān)。

Hcy通過代謝循環(huán)中的SAM和SAH影響DNA甲基化狀態(tài)，是一碳代謝和表觀遺傳修飾之間的重要連接點(diǎn)。HHcy是心血管疾病的獨(dú)立危險因素，其機(jī)制可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞功能障礙、脂質(zhì)代謝異常等動脈粥樣硬化過程中DNA甲基化狀態(tài)的改變有關(guān)，未來需要更多的研究對這些機(jī)制進(jìn)行探索。

【點(diǎn)睛】HHcy可能通過影響DNA甲基化影響動脈粥樣硬化的形成，從而增加心血管疾病的風(fēng)險。