DNA甲基化與非大動(dòng)脈粥樣硬化型卒中相關(guān)性研究進(jìn)展

姜曉晴，甕佳旭，周宏宇，李子孝，3，4，王擁軍，3，4

缺血性卒中是一種復(fù)雜且具有很強(qiáng)異質(zhì)性的疾病，由多種環(huán)境因素和遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素共同決定[1]。目前臨床多使用TOAST分型將缺血性卒中分為大動(dòng)脈粥樣硬化（largeartery atherosclerosis，LAA）、心源性栓塞（cardioembolism，CE）、小動(dòng)脈閉塞（smallvessel occlusion，SVO）、其他明確病因（other determined etiology，ODE）和不明原因（undetermined etiology，UE）5種類(lèi)型[2]。卒中的遺傳背景相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)為37.9%，而迄今發(fā)現(xiàn)的變異相關(guān)遺傳風(fēng)險(xiǎn)僅占總遺傳背景相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的5%～10%[3-4]。有更多卒中相關(guān)基因和可遺傳危險(xiǎn)因素尚未被發(fā)現(xiàn)，其中，部分可遺傳危險(xiǎn)因素可能與表觀遺傳學(xué)修飾有關(guān)。

表觀遺傳學(xué)修飾是環(huán)境因素與基因組的動(dòng)態(tài)相互作用，在不改變DNA序列的基礎(chǔ)上影響基因的表達(dá)或細(xì)胞表型[5]。DNA甲基化指發(fā)生在胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤（cytosinephosphate-guanine，CpG）二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化，是與基因組穩(wěn)定性、基因表達(dá)和調(diào)控相關(guān)的最重要的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。CpG島為GC含量＞55%且至少含500個(gè)堿基對(duì)的DNA片段，位于基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島甲基化可通過(guò)阻止轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等機(jī)制抑制基因表達(dá)[6]。卒中表觀遺傳學(xué)研究表明，缺血性卒中患者全基因組具有低甲基化的趨勢(shì)，提示相關(guān)基因啟動(dòng)子可發(fā)生低甲基化，導(dǎo)致相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平增加[7]。一項(xiàng)旨在檢測(cè)與缺血性卒中發(fā)生和卒中亞型相關(guān)差異甲基化位點(diǎn)（differentially methylated positions，DMPs）的研究發(fā)現(xiàn)，不同卒中亞型存在不同程度的DNA甲基化差異[8]。DNA甲基化可能作為缺血性卒中及其亞型的潛在生物標(biāo)志物。本文主要聚焦除LAA外其他類(lèi)型卒中（CE、SVO、ODE）DNA甲基化相關(guān)的研究，探究特定候選基因的DNA甲基化水平對(duì)這些類(lèi)型卒中病理生理的潛在影響，為缺血性卒中的診斷和治療提供新思路。

1 DNA甲基化與心源性栓塞型卒中

1.1 心源性栓塞型卒中與雌激素受體α基因甲基化 既往有動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，在永久大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型小鼠和大鼠中，雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）基因呈低甲基化[9]。Lin等[10]定量測(cè)量了201例缺血性卒中患者和217例健康對(duì)照的ERα啟動(dòng)子區(qū)域14個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)LAA和CE亞型卒中有5個(gè)CpG位點(diǎn)呈現(xiàn)低甲基化水平。

ERα是雌激素發(fā)揮生物效應(yīng)的主要核受體之一。多項(xiàng)研究提示，當(dāng)卒中模型動(dòng)物發(fā)生腦缺血損傷后，雌激素具有減輕神經(jīng)毒性、抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)等潛在作用，而雌激素發(fā)揮作用主要與局部區(qū)域ERα的表達(dá)增加有關(guān)[9,11-13]。Westberry等[14]的研究進(jìn)一步提示，ERα基因甲基化是腦缺血損傷后ERα上調(diào)的主要機(jī)制之一。CE型卒中后特異性ERα低甲基化水平改變可能通過(guò)增加ERα的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)雌激素的神經(jīng)保護(hù)作用[10]。

1.2 心源性栓塞型卒中與ZFHX3基因甲基化Cullell等[15]研究發(fā)現(xiàn)，缺血性卒中患者與健康對(duì)照存在957個(gè)DMPs，其中鋅指同源框3（zinc finger homeobox 3，ZFHX3）基因低甲基化與CE型卒中相關(guān)。研究者進(jìn)一步通過(guò)孟德?tīng)栯S機(jī)化分析發(fā)現(xiàn)，ZFHX3基因cg07786668與CE型卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有因果關(guān)系[15]。ZFHX3基因編碼轉(zhuǎn)錄因子AT模序結(jié)合因子1（AT-motif binding factor 1，Atbf1），而Atbf1可調(diào)節(jié)肌源性和神經(jīng)元分化[16]。既往全基因組關(guān)聯(lián)研究在基因水平上發(fā)現(xiàn)ZFHX3基因遺傳變異與CE型卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[17-18]。Cullell等[15]的研究結(jié)果從表觀遺傳學(xué)水平為探究ZFHX3基因與CE型卒中的相關(guān)性提供了新的證據(jù)。

2 DNA甲基化與小動(dòng)脈閉塞型卒中

2.1 小動(dòng)脈閉塞型卒中與MMP-2基因甲基化 在缺血性卒中亞型中，僅在SVO型中發(fā)現(xiàn)MMP-2活性升高，且MMP-2基因單核苷酸多態(tài)性是SVO型卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[19]。Lin等[20]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照相比，SVO患者M(jìn)MP-2啟動(dòng)子甲基化水平降低。MMP-2主要介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解重塑，在卒中早期損傷中可通過(guò)降解基膜干擾血-腦脊液屏障功能，進(jìn)一步參與卒中后出血轉(zhuǎn)化和神經(jīng)元凋亡的過(guò)程[21]。Arba等[22]研究發(fā)現(xiàn)血-腦脊液屏障功能失調(diào)是SVO型卒中的潛在發(fā)病機(jī)制之一，推測(cè)MMP-2啟動(dòng)子低甲基化導(dǎo)致MMP-2表達(dá)增加，過(guò)表達(dá)的MMP-2通過(guò)破壞血-腦脊液屏障，參與SVO型卒中的病理生理學(xué)過(guò)程。

2.2 小動(dòng)脈閉塞型卒中與CYP26C1基因甲基化 Lee等[23]研究發(fā)現(xiàn)SVO型卒中患者細(xì)胞色素P450 26C1（cytochrome P450 family 26 subfamily C member 1，CYP26C1）啟動(dòng)子甲基化水平明顯降低。CYP26C1是細(xì)胞色素P450家族成員，參與視黃酸的分解代謝，可催化視黃酸分解為羥基視黃酸[24]。目前相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，在小鼠和大鼠MCAO模型中應(yīng)用視黃酸具有減輕神經(jīng)炎癥、促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用[25-26]。臨床研究表明，在卒中患者中可觀察到9-順式視黃酸水平顯著降低，而高血漿視黃酸水平可以延緩高血壓患者首次缺血性卒中的發(fā)生[27-28]。CYP26C1可能通過(guò)視黃酸代謝與卒中發(fā)病建立潛在聯(lián)系。此外，既往研究發(fā)現(xiàn)視黃酸可以降低血漿Hcy水平[29]，而高同型半胱氨酸血癥為SVO型卒中的重要危險(xiǎn)因素之一[30]，推測(cè)CYP26C1低甲基化后自身表達(dá)增加，可能通過(guò)促進(jìn)視黃酸分解，降低血視黃酸水平，進(jìn)而影響Hcy水平，從而參與SVO的發(fā)生。

3 DNA甲基化與其他明確病因型卒中

ODE型卒中主要涉及血管因素和血液因素兩方面的疾病。血管因素包括各種原因引起的血管炎、血管畸形（如動(dòng)-靜脈畸形、煙霧病）等。血液因素包括骨髓增殖性腫瘤（紅細(xì)胞增多癥、血小板增高）、鐮狀細(xì)胞病、高凝狀態(tài)（如抗磷脂抗體綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等導(dǎo)致）等[31]。

3.1 DNA甲基化與系統(tǒng)性血管炎

3.1.1 抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)性血管炎 抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)性血管炎（antineutrophil cytoplasmic antibodyassociated vasculitis，AAV）表現(xiàn)為全身小血管壞死性炎癥，主要發(fā)病機(jī)制為機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)自身中性粒細(xì)胞胞質(zhì)蛋白的抗體，即抗髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和抗蛋白酶3（proteinase 3，PRTN3）抗體，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞過(guò)度激活，產(chǎn)生活性氧及中性粒細(xì)胞胞外陷阱[32]。正常中性粒細(xì)胞主要在細(xì)胞發(fā)育的早期表達(dá)MPO和PRTN3，但AAV患者的中性粒細(xì)胞從早期至成熟均持續(xù)表達(dá)這兩種蛋白，提示MPO和PRTN3兩種基因沉默發(fā)生異常，介導(dǎo)基因沉默的DNA甲基化可能在其中發(fā)揮作用[33]。

Jones等[34]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照及非活動(dòng)期AAV患者相比，活動(dòng)期AAV患者的白細(xì)胞MPO（外顯子5-6的CpG島）和PRTN3（啟動(dòng)子）基因呈低甲基化狀態(tài)。縱向收集AAV患者樣本，發(fā)現(xiàn)疾病緩解期PRTN3啟動(dòng)子甲基化水平存在升高和降低兩種變化，PRTN3啟動(dòng)子甲基化水平降低的患者卒中復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)是升高患者的4.55倍，提示PRTN3啟動(dòng)子甲基化水平的變化可能具有預(yù)測(cè)AAV復(fù)發(fā)的價(jià)值。

在AAV 患者中，除觀察到MPO和PRTN3甲基化水平改變，Ciavatta等[35]還發(fā)現(xiàn)AAV患者粒性白細(xì)胞中人類(lèi)runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3（runt-related transcription factor 3，RUNX3）基因啟動(dòng)子呈高甲基化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)組蛋白H3第27位賴(lài)氨酸的三甲基化修飾（histone-3 lysine-27 trimethylation，H3K27me3）標(biāo)記缺失。H3K27me3是一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄抑制性翻譯后修飾，參與組蛋白H2A泛素化修飾等機(jī)制，促進(jìn)染色質(zhì)凝集，介導(dǎo)基因沉默[36]。RUNX3與多梳抑制復(fù)合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）亞單位相互作用，參與催化并維持H3K27me3[35]?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，Ciavatta等[35]提出了調(diào)控模型理論：RUNX3高甲基化引起自身表達(dá)降低，導(dǎo)致H3K27me3來(lái)源缺失，同時(shí)組蛋白H3K27me3去甲基化酶（jumonji domaincontaining protein 3，JMJD3）不斷動(dòng)態(tài)去除H3K27me3標(biāo)記，使MPO和PRTN3基因沉默異常，增加染色質(zhì)可及性，提高兩種基因的轉(zhuǎn)錄水平。

3.1.2 巨細(xì)胞動(dòng)脈炎 巨細(xì)胞動(dòng)脈炎（giantcell arteritis，GCA）主要累及大動(dòng)脈和中動(dòng)脈，以形成肉芽腫為主要特征，可導(dǎo)致血管閉塞從而引發(fā)卒中[37]。Coit等[38]發(fā)現(xiàn)GCA患者顳動(dòng)脈樣本中T細(xì)胞相關(guān)基因特異性甲基化水平改變，包括蛋白磷酸酶3催化亞基γ同工酶（protein phosphatase 3，catalytic subunit，gamma isozyme，PPP3CC）、活化T細(xì)胞核因子2（nuclear factor of activated T cell 2，NFATC2）、活化T細(xì)胞核因子1（nuclear factor of activated T cell 1，NFATC1）基因相關(guān)位點(diǎn)呈低甲基化。上述3個(gè)基因主要參與T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）/CD28信號(hào)和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）/T細(xì)胞活化核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）通路。NFAT是調(diào)節(jié)干擾素γ（interferon-gamma，IFNG）、TNF及CD40配體（CD40LG）等細(xì)胞因子表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其基因低甲基化可導(dǎo)致T細(xì)胞激活和分化活動(dòng)增強(qiáng)。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)IFNG、IL-6、IL-21、TNF、趨化因子受體7（chemokine receptor 7，CCR7）、趨化因子配體18（chemokine ligand 18，CCL18）等多種促炎因子基因呈低甲基化，可導(dǎo)致血管壁細(xì)胞因子的炎性浸潤(rùn)，產(chǎn)生疾病促炎環(huán)境。T細(xì)胞激活和分化、細(xì)胞因子炎性浸潤(rùn)是GCA發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，上述基因低甲基化水平改變?cè)贕CA發(fā)病中具有潛在作用。

除局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)形成肉芽腫所致組織損傷外，IL-6驅(qū)動(dòng)下的系統(tǒng)性炎癥同樣為GCA發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。單核細(xì)胞是系統(tǒng)性炎癥的主要參與因素[39]。Estupi?án-Moreno等[40]對(duì)82例GCA患者和31例健康對(duì)照者的CD14+單核細(xì)胞進(jìn)行了全表觀基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照相比，GCA患者CD14+單核細(xì)胞在1190個(gè)基因上存在1371個(gè)DMPs，其中85%以上的DMPs呈高甲基化水平改變。基因本體學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，上述DMPs呈現(xiàn)免疫反應(yīng)功能通路（如調(diào)節(jié)白細(xì)胞趨化性、IFNG和整合素生成）及單核細(xì)胞生物學(xué)通路（如巨噬細(xì)胞分化和增殖、巨噬細(xì)胞集落刺激因子等細(xì)胞因子產(chǎn)生）的顯著富集。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與經(jīng)糖皮質(zhì)激素治療后疾病緩解的GCA患者相比，疾病活動(dòng)期GCA患者的CD14+單核細(xì)胞存在688個(gè)DMPs，其中85%以上的DMPs呈低甲基化水平改變，主要呈現(xiàn)GCA免疫致病過(guò)程相關(guān)通路的富集（如對(duì)IL-6、IL-11的細(xì)胞應(yīng)答）。上述研究結(jié)果提示，DNA甲基化在GCA發(fā)病、疾病活動(dòng)性和激素治療反應(yīng)方面發(fā)揮潛在作用，可能作為可識(shí)別的生物標(biāo)志物，有助于GCA疾病的早期診斷、分類(lèi)和治療。

3.1.3 川崎病 川崎?。↘awasaki disease，KD）是一種高熱性血管炎疾病，累及多個(gè)系統(tǒng)臟器和組織，尤其是中小動(dòng)脈[41]。Fcγ受體Ⅱa（FcγRⅡa，F(xiàn)CGR2A）基因存在的特殊遺傳變異位點(diǎn)，可作為川崎病的潛在風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志[42]。Kuo等[43]研究發(fā)現(xiàn)KD患者全血細(xì)胞FCGR2A啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生低甲基化。Li等[44]的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)靜脈注射免疫球蛋白治療后，KD患者的FCGR2A甲基化水平可恢復(fù)正常。FCGR2A蛋白在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞表面表達(dá)，可增加吞噬作用和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生[45]。另外，Huang等[46]研究發(fā)現(xiàn)在KD患者全血細(xì)胞中，Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）基因同樣發(fā)生低甲基化，并且同樣經(jīng)治療后可恢復(fù)至正常甲基化水平。TLR可與FCGR2A相互作用，誘導(dǎo)TNF-α等炎性介質(zhì)產(chǎn)生[47]。上述研究提示FCGR2A與TLR基因發(fā)生低甲基化可能導(dǎo)致促炎反應(yīng)增強(qiáng)，參與KD的發(fā)生發(fā)展。

3.1.4 白塞病 白塞?。˙ehcet’s disease，BD）血管炎多侵犯小動(dòng)脈、小靜脈，以侵犯全身極微小的微血管為主，可導(dǎo)致血管壞死或破裂、管腔狹窄、血栓形成及血管動(dòng)脈瘤樣改變，從而造成器官或組織的損害[48]。Hughes等[49]發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照相比，BD患者外周血CD4+T細(xì)胞和單核細(xì)胞中與細(xì)胞骨架重塑相關(guān)的基因呈現(xiàn)甲基化水平改變：肌球蛋白基因如肌球蛋白重鏈15（myosin heavy chain 15，MYH15）、肌球蛋白1D（myosin 1D，MYO1D）、肌球蛋白磷酸酶Rho相互作用蛋白（myosin phosphatase Rho interacting protein，MPRIP）基因呈高甲基化，肌球蛋白1C（myosin 1C，MYO1C）基因呈低甲基化；肌動(dòng)蛋白相關(guān)基因如腦特異性血管生成抑制因子1相關(guān)蛋白2樣蛋白1（brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2-Like protein 1，BAIAP2L1）、錨蛋白1（ankyrin 1，ANK1）基因呈高甲基化；Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1（ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1）、肌動(dòng)蛋白束蛋白2（fascin-2，F(xiàn)SCN2）、丫叉同源物1（slingshot homolog 1，SSH1）基因呈低甲基化。經(jīng)秋水仙堿治療后，BD患者特定基因甲基化水平可恢復(fù)正常。經(jīng)治療后的BD患者與治療前相比，介導(dǎo)微管形成與組織的驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員2A（kinesin family member 2A，KIF2A）呈高甲基化改變，促微管聚合蛋白（tubulin polymerization promoting protein，TPPP）呈低甲基化改變。這些參與細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞遷移的基因甲基化水平變化有作為BD潛在生物標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)的可能。

3.2 DNA甲基化與血管畸形

3.2.1 動(dòng)靜脈畸形 在腦動(dòng)靜脈畸形（brain arteriovenous malformations，BAVM）患者中，磷脂酶A2 Ⅶ型（phospholipase A2 group Ⅶ，PLA2G7）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)的激酶抑制劑2A（cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）、一氧化氮合成酶1接頭蛋白（nitric oxide synthase 1 adaptor protein，NOS1AP）、血小板衍生生長(zhǎng)因子D（platelet derived growth factor D，PDGFD）基因特定CpG島區(qū)域呈現(xiàn)高甲基化水平[50-53]。上述基因甲基化水平改變可作為BAVM的預(yù)測(cè)因素，其具體機(jī)制可能涉及脂質(zhì)代謝、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管發(fā)育、血管損傷修復(fù)等途徑。上述研究為探究BAVM發(fā)病機(jī)制提供了新思路，其結(jié)果提示應(yīng)關(guān)注參與以上過(guò)程的重要基因甲基化水平改變。

3.2.2 煙霧病 Sung等[54]研究發(fā)現(xiàn)煙霧?。╩oyamoya disease，MMD）患者內(nèi)皮集落形成細(xì)胞中分揀蛋白1（sortilin 1，SORT1）基因啟動(dòng)子呈低甲基化，且對(duì)MMD具有一定的診斷價(jià)值。SORT1作為VPS10P結(jié)構(gòu)域受體家族的一員，參與胞內(nèi)蛋白向細(xì)胞膜或膜性細(xì)胞器的運(yùn)輸，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞和溶酶體降解作用[55]。SORT1基因低甲基化可使SORT1過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致促血管生成因子及MMP-9表達(dá)增加，血管生成抑制因子血小板反應(yīng)蛋白2（thrombospondin 2，THBS2）表達(dá)下降。由于血管生成本身是促進(jìn)和抑制生成兩種因素的動(dòng)態(tài)相互作用，推測(cè)SORT1基因低甲基化水平改變是通過(guò)調(diào)節(jié)生成、抑制因子的表達(dá)水平，破壞血管生成過(guò)程的動(dòng)態(tài)平衡，從而對(duì)MMD發(fā)病產(chǎn)生影響。

3.3 DNA甲基化與骨髓增殖性腫瘤 骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）包括真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發(fā)性血小板增多癥（essential thromboc y themia，E T）、骨髓纖維化（myelofibrosis，MF）3種類(lèi)型[56]，目前已開(kāi)展的研究集中在PV和ET這兩種疾病類(lèi)型與DNA甲基化的相關(guān)性方面。

3.3.1 骨髓增殖性腫瘤體細(xì)胞突變 MPN存在Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）基因的特異性驅(qū)動(dòng)突變，是驅(qū)動(dòng)疾病發(fā)生的主要原因之一[57]。JAK2的主要突變形式為JAK2V617F，可在95%的PV和50%～60%的ET患者中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)[58]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，參與DNA甲基化過(guò)程的4種基因發(fā)生體細(xì)胞突變，在MPN發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮作用，這4種基因分別為T(mén)ET甲基胞嘧啶雙加氧酶2（TET methylcytosine dioxygenase 2，TET2）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNA methyltransferase 3A，DNMT3A）、異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）和異檸檬酸脫氫酶2（isocitrate dehydrogenase 2，IDH2）基因[59-61]。

TET2突變?yōu)楣δ苋笔?，在MPN中占12%～17%[62]。TET2蛋白催化DNA中5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶，介導(dǎo)DNA去甲基化。TET2突變多與JAK2V617F突變同時(shí)發(fā)生，且兩種突變順序可影響疾病表型，先發(fā)生JAK2突變?cè)赑V患者中多見(jiàn)，先發(fā)生TET2突變?cè)贓T患者中多見(jiàn)[59]。

DNMT3A作為DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族的一員，參與DNA從頭甲基化過(guò)程。DNMT3A基因發(fā)生移碼突變或無(wú)義突變，導(dǎo)致甲基轉(zhuǎn)移酶活性降低。與TET2基因類(lèi)似，PV患者先發(fā)生JAK2突變可能性大，而ET患者先發(fā)生DNMT3A突變可能性大[60]。

IDH1和IDH2基因編碼兩種表觀遺傳調(diào)控因子，參與DNA甲基化和組蛋白修飾過(guò)程。IDH1和IDH2蛋白催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸。IDH1和IDH2殘基發(fā)生點(diǎn)突變，將α-酮戊二酸轉(zhuǎn)化為2-羥基戊二酸，通過(guò)表觀遺傳調(diào)控相關(guān)基因，從而促進(jìn)白血病發(fā)生，在介導(dǎo)MPN轉(zhuǎn)化為急性白血病的過(guò)程中發(fā)揮潛在作用[61]。

3.3.2 骨髓增殖性腫瘤與核因子-κB信號(hào)通路基因甲基化 有研究在PV和ET患者的骨髓和外周血中發(fā)現(xiàn)特定基因呈低甲基化，分別為C型凝集素域家族7成員A（C-type lectindomain family 7,member A，CLEC7A）和外異蛋白A受體（ectodysplasin A receptor，EDAR）關(guān)聯(lián)死亡域（EDARassociated death domain，EDARADD）基因，這兩種基因主要參與核因子-κB（nuclear factor kappa binding，NF-κB）信號(hào)通路[63]。NF-κB介導(dǎo)炎癥誘發(fā)的癌變和骨髓增殖性疾病的進(jìn)展[64]，因此推測(cè)上述低甲基化水平基因?qū)PN發(fā)病機(jī)制具有潛在影響。

3.4 DNA甲基化與高凝狀態(tài) 高凝狀態(tài)指遺傳性或后天獲得性血栓好發(fā)傾向，分為原發(fā)性與繼發(fā)性高凝狀態(tài)。抗磷脂抗體綜合征和系統(tǒng)性紅斑狼瘡作為自身免疫性疾病，是導(dǎo)致繼發(fā)性高凝狀態(tài)的重要病因。

3.4.1 抗磷脂抗體綜合征 抗磷脂抗體綜合征（antiphospholipid syndrome，APS）以反復(fù)血栓形成、妊娠并發(fā)癥為臨床特征，伴血清自身抗體的升高[65]。

Weeding等[66]研究發(fā)現(xiàn)APS患者中性粒細(xì)胞中V-Ets骨髓成紅細(xì)胞增多癥病毒E26 癌基因同源物1（V-Ets erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1，ETS1）、表皮膜蛋白2（epithelial membrane protein 2，EMP2）、催產(chǎn)素（oxytocin，OXT）基因呈低甲基化，這些基因主要與妊娠相關(guān)。ETS1編碼轉(zhuǎn)錄因子參與干細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞衰老，為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的易感基因[67]。研究者同時(shí)發(fā)現(xiàn)蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型2（protein tyrosine phosphatase,non-receptor type 2，PTPN2）基因呈低甲基化。PTPN2負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞激活，PTPN2基因變異與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病等自身免疫性疾病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[68-69]。

Patsouras等[70]研究發(fā)現(xiàn)在APS患者全血細(xì)胞中，IL-8啟動(dòng)子甲基化水平降低，組織因子（tissue factor，F(xiàn)3）基因體甲基化水平升高。有研究者體外使用抗磷脂抗體復(fù)合物刺激健康對(duì)照組單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-8啟動(dòng)子和F3基因體甲基化水平先升高后降低，最終導(dǎo)致基因過(guò)度表達(dá)。這一過(guò)程伴隨甲基化CpG結(jié)合蛋白-2（methyl-CpG-binding protein 2，MECP2）、DNMT3B、TET1、組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 9，HDAC9）、AT相互作用功能域5B（AT-rich interactive domain 5B，ARID5B）等表觀遺傳修飾酶表達(dá)增加。提示在表觀遺傳修飾酶作用下，IL-8與F3甲基化水平變化可能參與APS的發(fā)病過(guò)程。

3.4.2 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種影響多個(gè)器官的全身性自身免疫性疾病，其特征是針對(duì)細(xì)胞和組織產(chǎn)生異常免疫反應(yīng)，形成自身抗體和免疫復(fù)合物沉積，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥和器官損傷[71]。

Richardson等[72]研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)期SLE患者的CD4+T細(xì)胞中全基因組DNA甲基化水平降低，且與T細(xì)胞自身反應(yīng)性相關(guān)，提示DNA甲基化水平異常與SLE的發(fā)生有關(guān)。Corvetta等[73]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷與SLE患者的疾病活動(dòng)性有關(guān)，使用DNA甲基化抑制劑處理健康對(duì)照組的CD4+T細(xì)胞可誘導(dǎo)狼瘡樣綜合征[74-75]。

目前研究發(fā)現(xiàn)多種IL基因甲基化水平改變與SLE相關(guān)。Lin等[76]發(fā)現(xiàn)SLE患者白細(xì)胞中IL-10和白細(xì)胞介素1受體2（type 2 IL-1 receptor，IL-1R2）基因啟動(dòng)子甲基化水平降低，且這兩種基因低甲基化程度與SLE活動(dòng)性呈正相關(guān)。Mi等[77]研究發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL-6基因啟動(dòng)子呈低甲基化，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)IL-6啟動(dòng)子低甲基化程度與SLE患者的腎臟損害程度呈正相關(guān)，與血漿補(bǔ)體C3、C4水平呈負(fù)相關(guān)[78]。IL在免疫反應(yīng)中具有傳遞信息，以及激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的作用，IL-10、IL-1R2、IL-6啟動(dòng)子低甲基化水平可作為臨床診斷SLE的新型生物標(biāo)志物。

Zhao等[79]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組和其他免疫性疾病患者相比，SLE患者外周單個(gè)核細(xì)胞干擾素誘導(dǎo)蛋白44樣蛋白（interferoninduced protein 44-like，IFI44L）基因啟動(dòng)子甲基化水平顯著降低。IFI44L啟動(dòng)子甲基化在鑒別SLE方面的特異性和敏感性均優(yōu)于現(xiàn)有的檢測(cè)方法，且在區(qū)分SLE與其他自身免疫性疾病方面也具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

人類(lèi)基因組由可變的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（long terminal repeat，LTR）組成，人類(lèi)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（human endogenous retroviruses，HERVs）為L(zhǎng)TR的組成部分，占基因組DNA的8%～9%。Okada等[80-81]研究發(fā)現(xiàn)SLE患者T細(xì)胞HERV-E和HERV-K基因甲基化水平降低，且其低甲基化程度與SLE活動(dòng)性、抗U1-核糖核蛋白（U1-ribonucleoprotein，U1-RNP）與抗Sm抗體及補(bǔ)體水平呈正相關(guān)，可導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少癥的發(fā)生。HERV-E和HERV-K基因低甲基化可作為區(qū)分SLE活動(dòng)期和靜止期的預(yù)測(cè)性指標(biāo)。

3.5 DNA甲基化與鐮狀細(xì)胞病 鐮狀細(xì)胞病（sickle cell disease，SCD）為突變基因產(chǎn)生的脫氧鐮狀血紅蛋白（hemoglobin sickle，HbS）在紅細(xì)胞內(nèi)聚合所致，可影響紅細(xì)胞的活性、流變性和黏附性，促進(jìn)溶血、內(nèi)皮損傷、小血管閉塞和大血管血栓形成[82-83]。

有研究證明，HbS的細(xì)胞內(nèi)濃度是聚合動(dòng)力學(xué)的主要決定因素，采用胎兒血紅蛋白（fetal hemoglobin，HbF）替代可降低HbS濃度，提示HbF可能阻斷SCD的病理生理過(guò)程[84]，這為藥理學(xué)誘導(dǎo)HbF來(lái)治療SCD提供了理論基礎(chǔ)。

HbF中的γ-亞基由γ-珠蛋白（hemoglobin subunit gamma，HBG）基因編碼，DNMT1維持DNA甲基化，參與介導(dǎo)HBG基因表觀遺傳沉默[85]。為誘導(dǎo)HbF表達(dá)，需抑制DNMT1對(duì)HBG基因的沉默作用。脫氧胞苷類(lèi)似物地西他濱可與DNMT1共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致DNMT1降解[86]。目前口服地西他濱聯(lián)合四氫尿苷（抑制地西他濱降解）治療SCD處于臨床研究Ⅰ期或Ⅱ期階段。有Ⅰ期臨床研究應(yīng)用0.16 mg/kg地西他濱治療SCD，持續(xù)8周，發(fā)現(xiàn)患者外周血單核細(xì)胞DNMT1下降＞75%，HbF增加4%～9%，且治療期間患者耐受良好，提示地西他濱的安全性較高[87]。該研究結(jié)果提示，地西他濱等DNMT抑制劑可作為治療SCD新的有前景的治療藥物。

通過(guò)上面對(duì)CE、SVO、ODE型卒中與DNA甲基化關(guān)系的相關(guān)研究總結(jié)可以看出，缺血性卒中不同病因亞型具有特異性候選基因甲基化水平改變（表1）。研究候選基因DNA甲基化與非大動(dòng)脈粥樣硬化型卒中的關(guān)系，有助于從分子水平揭示缺血性卒中的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。目前該領(lǐng)域的研究進(jìn)展已用于發(fā)現(xiàn)非大動(dòng)脈粥樣硬化型卒中相關(guān)疾病的新型生物標(biāo)志物（如IFI44L甲基化用于SLE的診斷）以及發(fā)掘疾病的新型治療靶點(diǎn)（如地西他濱用于SCD的治療）。未來(lái)需要更多研究關(guān)注非大動(dòng)脈粥樣硬化型卒中發(fā)病的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，從分子生物學(xué)角度為缺血性卒中的診斷與治療探尋新方向。

表1 非大動(dòng)脈粥樣硬化型卒中相關(guān)候選基因甲基化水平變化

【點(diǎn)睛】本文全面介紹了與心源性栓塞型、小動(dòng)脈閉塞型、其他明確病因型卒中相關(guān)的DNA甲基化改變，分析其可能的機(jī)制及可能有助于臨床診斷和治療的靶點(diǎn)和思路。