衍生化高效液相色譜法測定醋酸西曲瑞克中10種手性氨基酸的含量

韓承剛，李明顯，姬麗芳，沙向陽，鄭楓*（1. 中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京 211198；2. 浙江省原料藥安全研究中心（工藝技術(shù)創(chuàng)新平臺），杭州 10018；. 南京銳志生物醫(yī)藥有限公司，南京 211100）

醋酸西曲瑞克（cetrorelix acetate）是一種由10個氨基酸組成的人工合成多肽（絕對構(gòu)型見圖1），是第三代促性腺激素釋放激素拮抗劑的代表，可以促排卵獲取適當(dāng)數(shù)量的高質(zhì)量成熟卵母細(xì)胞[1]。

圖1 西曲瑞克的絕對構(gòu)型（來源于SciFinder，CAS：120287-85-6）Fig 1 Absolute configuration of cetrorelix acetate（obtained from SciFinder，CAS：120287-85-6）

多肽類藥物的生物活性與其氨基酸的手性密切相關(guān)。在研究醋酸西曲瑞克一級結(jié)構(gòu)時，需要將多肽在6 mol·L－1的鹽酸和110℃條件下反應(yīng)，該過程可能會引起手性氨基酸發(fā)生外消旋化[2-3]。2023年2月藥品審評中心（CDE）發(fā)布的《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行）版中，對含有手性中心的氨基酸提出需要控制其異構(gòu)體的要求，因此有必要對多肽合成中手性氨基酸的含量進(jìn)行研究和控制。目前各國藥典未見收載醋酸西曲瑞克的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于其質(zhì)量研究的文獻(xiàn)報道也較少[4-6]。

除含芳環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸外，絕大多數(shù)氨基酸不含發(fā)色基團(tuán)，因此一般需經(jīng)衍生化反應(yīng)處理。柱前衍生化法是利用衍生試劑與氨基酸反應(yīng)形成非對映體衍生產(chǎn)物的方法。目前已有文獻(xiàn)報道了多種衍生化試劑用于氨基酸及胺類化合物的分析檢測，包括Marfey試劑、2，4-二硝基氟苯、（FDNB）、熒光胺（FA）、鄰苯二甲醛（OPA）、異硫氰酸苯酯（PITC）、丹磺酰氯等[2，7-9]。許多衍生試劑具有一定的局限性，例如不能分離手性氨基酸、衍生物性質(zhì)不穩(wěn)定、氨基酸衍生物的可檢測性差等[10]。其中Marfey試劑具有強(qiáng)紫外吸收官能團(tuán)，衍生產(chǎn)物專屬性、穩(wěn)定性強(qiáng)，衍生操作簡便等優(yōu)點[2]。因此本文開發(fā)了一種基于Marfey法，采用常規(guī)反相HPLC即可對醋酸西曲瑞克水解后10種氨基酸的構(gòu)型及含量進(jìn)行測定的方法，以期為醋酸西曲瑞克的結(jié)構(gòu)確證提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AD XR高效液相色譜儀（配有LC-20AD XR二元泵、SIL-20A XR自動進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-20A紫外檢測器，日本島津有限公司）；Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra AM質(zhì)譜儀（液相U3000 DAD檢測器，美國賽默飛世爾科技）； XS205DU/A 電子分析天平（d＝0.01 mg），S210-K pH計[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]；TGL-16B高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DHG-9070A、DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥

L-精氨酸（L-Arg，純度：99%，批號：H2113190）、D-精氨酸（D-Arg，純度：98%，批號：D2114171）、3-（3-吡啶基）-D-丙氨酸（D-Pal，純度：98%，批號：A1921075）、L-酪氨酸（L-Tyr，純度：98%，批號：E1811066）、D-酪氨酸（D-Tyr，純度：98%，批號：F2118400）、L-絲氨酸（L-Ser，純度：99%，批號：H1908018）、D-絲氨酸（D-Ser，純度＞98.5%，批號：J2123636）、L-脯氨酸（L-Pro，純度：99%，批號：J2012169）、D-脯氨酸（D-Pro，純度：99%，批號：B2108066）、L-丙氨酸（L-Ala，純度：99%，批號：G2110117）、D-丙氨酸（D-Ala，純度：98%，批號：K1906051）、L-亮氨酸（L-Leu，純度：99%，批號：K2002002）、D-亮氨酸（D-Leu，純度：99%，批號：J2111318）、L-4-氯苯丙氨酸（L-Phe，純度：98%，批號：G1809096）、D-4-氯苯丙氨酸（D-Phe，純度：95%，批號：E1529076）、L-3-（2-萘基）-丙氨酸鹽酸鹽（L-Nal，純度：95%，批號：H2205521）、D-3-（2-萘基）-丙氨酸（D-Nal，純度：98%，批號：F2117074）（阿拉?。?；D-瓜氨酸（D-Cit，純度：98%，批號：C10929512，麥克林）；3-（3-吡啶基）-L-丙氨酸鹽酸鹽（L-Pal，純度：95%，批號：H2205521，畢得醫(yī)藥）；L-瓜氨酸（L-Cit，純度：98%，批號：LI20V67，百靈威）；乙腈（色譜級，批號：21115279，TEDIA）；甲酸（色譜級，批號：J2027128，阿拉?。?；Nα-（2，4-二硝基-5-氟苯基）-L-亮氨酰胺（L-FDLA，色譜級，批號：K28OK-OQ，TCI）；DMSO（色譜級，批號：EA617-CN，Honeywell）；鹽酸（分析級，批號：220707328F，南京化試股份有限公司）；氫氧化鈉（分析級，批號：20210813）、碳酸氫鈉（分析級，批號：200523674X）（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實驗用水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；醋酸西曲瑞克供試品（南京銳志生物醫(yī)藥有限公司，批號：XQRK-210801、XQRK-210901、XQRK-210902）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hedera ODS-2 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.065%的甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL；波長：340 nm。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式采集；噴霧電壓：4000；鞘氣體壓力：35 psi；離子掃描氣體壓力：0.5 psi；輔助氣壓力：5 psi；毛細(xì)管溫度：350℃；套管透鏡補(bǔ)償電壓：44 V；源內(nèi)碰撞解析電壓：0 V；碰撞壓力：0 psi。

2.3 溶液配制

2.3.1L-FDLA溶液 取L-FDLA適量，加二甲基亞砜溶解制成約1.0 g·L－1的溶液。

2.3.2 手性氨基酸對照品溶液 精密稱取組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸對照品適量，加適宜溶劑溶解，得到濃度為1.0 mmol·L－1的儲備液。用0.1 mol·L－1的鹽酸或0.1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0左右，最終得到濃度為40μmol·L－1的溶液。

2.3.3 手性氨基酸及對映異構(gòu)體氨基酸混合對照品溶液 精密稱取各氨基酸及其對映異構(gòu)體對照品適量，加適宜溶劑溶解，得到濃度為0.5 mmol·L－1的儲備液。用0.1 mol·L－1的鹽酸或0.1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0左右，最終得到濃度為20 μmol·L－1的溶液。

2.3.4 供試品溶液 精密稱取醋酸西曲瑞克適量，用6 mol·L－1的鹽酸溶液溶解并稀釋制成濃度為1.0 mmol·L－1的溶液，充氮后密封，置110℃烘箱中水解8.0 h后取出，放冷，啟封，用2 mol·L－1的氫氧化鈉溶液和0.1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0左右，最終得到濃度為40 μmol·L－1的溶液。

2.3.5 衍生化空白溶液 精密量取調(diào)節(jié)pH至7.0左右的水溶液125 μL置1.5 mL聚丙烯管底部，加入0.1 mol·L－1的碳酸氫鈉溶液10 μL與1.0 g·L－1的L-FDLA衍生試劑100 μL，混勻，置37℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中1 h后，取出，加入0.1 mol·L－1的鹽酸溶液10 μL終止反應(yīng)；于離心機(jī)上12 000 r·min－1離心10 min，取上清液得到衍生化空白溶液。

2.3.6 衍生化操作 精密量取氨基酸對照品溶液125 μL置1.5 mL聚丙烯管底部，加入0.1 mol·L－1的碳酸氫鈉溶液10 μL與1.0 g·L－1的L-FDLA衍生試劑100 μL，混勻，置37℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中1 h后，取出，加入0.1 mol·L－1鹽酸溶液10 μL終止反應(yīng)；于離心機(jī)上12 000 r·min－1離心10 min，取上清液得到衍生化對照溶液。衍生化供試品溶液、手性氨基酸及對映異構(gòu)體氨基酸混合對照品溶液同法進(jìn)行衍生化操作。

2.4 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）鑒定與液相專屬性

10種氨基酸衍生物L(fēng)C-MS/MS鑒定結(jié)果見表2。

表2 正離子模式檢測中10種衍生化氨基酸的相關(guān)參數(shù)和LC-MS/MS特性Tab 2 Related parameters and LC-MS/MS characteristics of 10 derived amino acids in positive mode detection

分別精密量取衍生化空白溶液、衍生化對照品溶液、衍生化供試品溶液和衍生化手性氨基酸及對映異構(gòu)體氨基酸混合對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果顯示組成醋酸西曲瑞克的10種手性氨基酸及其對映異構(gòu)體不會受到空白干擾；衍生化對照品溶液中，各氨基酸衍生物峰與相鄰峰之間的最小分離度為1.19；2份衍生化對照品溶液的含量匹配應(yīng)在96%～105%；第一份衍生化對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5針，各氨基酸衍生物峰校正因子RSD均不大于0.8%，表明進(jìn)樣精密度良好；衍生化供試品溶液中，其他峰不干擾各目標(biāo)氨基酸衍生物峰的測定；該方法專屬性良好，典型色譜圖見圖2。

圖2 醋酸西曲瑞克水解后氨基酸含量測定的典型色譜圖Fig 2 Typical chromatogram for content determination of amino acid after hydrolysis of cetrorelix acetate

2.5 檢測限和定量限

精密移取“2.3.2”項下氨基酸對照品溶液，逐級稀釋合適倍數(shù)后同“2.3.6”項下進(jìn)行衍生化處理后進(jìn)樣，分別將信噪比（S/N）≥3和10的濃度作為檢測限（LOD）和定量限（LOQ）（見表3）。結(jié)果10種氨基酸衍生物的LOD和LOQ的濃度均分別為0.68 μmol·L－1和2.04 μmol·L－1。取LOQ濃度衍生化溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，氨基酸衍生物峰面積RSD＜4.2%，保留時間的RSD＜0.20%，結(jié)果表明定量限測定精密度良好。

表3 10種氨基酸衍生物的LOD與LOQ的信噪比Tab 3 LOD and LOQ of 10 amino acid

2.6 線性與范圍

精密移取“2.3.2”項下氨基酸對照品儲備液，依次制備成10.20、16.33、20.41、22.45、24.49μmol·L－1系列濃度的線性測試溶液。照“2.3.6”項下方法分別進(jìn)行衍生化處理，進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，摩爾濃度為橫坐標(biāo)，作圖并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸衍生物在10.20～24.49 μmol·L－1與峰面積線性關(guān)系良好，r值均大于0.991。

2.7 重復(fù)性與中間精密度試驗

按“2.3.5”和“2.3.6”項下方法分別配制衍生化空白溶液、衍生化對照品溶液及平行6份衍生化供試品溶液，進(jìn)行重復(fù)性考察，結(jié)果組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸衍生化后的含量RSD在0.41%～0.90%，表明重復(fù)性良好。不同分析人員在不同日期重復(fù)上述試驗，考察方法中間精密度，結(jié)果組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸衍生化后含量RSD在0.23%～1.6%。精密度試驗中組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸衍生化后含量RSD在0.46%～5.8%，表明方法中間精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

按“2.3.6”項下方法分別配制衍生化空白溶液、衍生化對照品溶液及衍生化供試品溶液，于室溫放置0、11、14、17、22、40 h后進(jìn)樣分析，記錄各氨基酸衍生化后的峰面積并計算供試品中各氨基酸衍生物的含量。結(jié)果顯示對照品溶液中組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸衍生化后的峰面積RSD均低于1.8%；水解供試品溶液中10種氨基酸衍生后產(chǎn)物的含量RSD均低于1.8%，表明在40 h內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好。

2.9 耐用性考察

改變流動相中甲酸添加量（%）、流速（mL·min－1）、柱溫（℃）以考察環(huán)境的微小變動對方法測定結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在各個色譜條件下10種氨基酸的檢測均不會受到干擾，衍生化對照品溶液中，各氨基酸校正因子RSD均低于2.7%，峰與峰之間的最小分離度均不小于1.0；各條件下供試品溶液中各氨基酸含量的RSD均低于6.9%，方法耐用性良好，具體結(jié)果見表4。

表4 耐用性結(jié)果Tab 4 Durability test

2.10 樣品檢測

分別取3批醋酸西曲瑞克樣品（批號：XQRK-210801、XQRK-210901、XQRK-210902）進(jìn)行檢測，結(jié)果各批次組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸衍生物含量均在83.5%～109.5%內(nèi)，見表5。

表5 10種氨基酸在3批醋酸西曲瑞克供試品中的檢測結(jié)果(%)Tab 5 10 amino acids in 3 batches of cetrorelix acetate (%)

3 討論

3.1 衍生條件的選擇

對影響L-FDLA與氨基酸反應(yīng)的因素進(jìn)行了考察。分別在37、50、60℃下反應(yīng)相同時間，或在相同溫度下分別反應(yīng)0.5、1.0、1.5 h，結(jié)果顯示反應(yīng)溫度越高，衍生物峰面積越大，但是溫度高于37℃后，衍生試劑產(chǎn)生的雜質(zhì)會顯著干擾樣品峰的測定，在37℃左右反應(yīng)1.0 h時沒有明顯干擾；反應(yīng)時間越長衍生物峰面積越大，考慮到試驗效率結(jié)合文獻(xiàn)[11]已報道的方法（Marfey試劑在與L型與D型氨基酸的α-氨基在40℃堿性條件下反應(yīng)1 h后，不會產(chǎn)生外消旋產(chǎn)物），決定反應(yīng)時限定為1.0 h。對10種氨基酸總摩爾之和與L-FDLA的用量摩爾比（1∶1～1∶10）進(jìn)行考察，結(jié)果顯示摩爾比在1∶5左右時即可達(dá)到最大產(chǎn)率。

3.2 水解條件摸索

取醋酸西曲瑞克的6 mol·L－1鹽酸溶液，分別在110℃加熱4、6、8、12、24 h后測定。結(jié)果選取多數(shù)氨基酸能較大程度水解且變化趨勢較平穩(wěn)的8 h作為水解終點時間。在8 h時，組成醋酸西曲瑞克的10種氨基酸外消旋化程度小，結(jié)果見圖3。

圖3 醋酸西曲瑞克水解時間與衍生化產(chǎn)物峰面積的關(guān)系Fig 3 Relationship between hydrolysis time and peak area of derivatization products

3.3 色譜條件的選擇

在C18色譜柱上考察了不同流動相系統(tǒng)對醋酸西曲瑞克水解產(chǎn)生的氨基酸衍生物的分離效果。結(jié)果以甲醇-水系統(tǒng)作為流動相時部分氨基酸有拖尾現(xiàn)象，且分離度小于1.0；改用乙腈-磷酸鹽系統(tǒng)作流動相時，調(diào)節(jié)pH、柱溫、梯度或者更換色譜柱都無法使所有氨基酸分離度均大于1.0；最終選取乙腈-甲酸水體系，甲酸添加量為0.065%左右時，能使所有氨基酸達(dá)到良好的分離效果，且峰形良好。

3.4 質(zhì)譜結(jié)果討論

瓜氨酸每種構(gòu)型都產(chǎn)生的兩個雜質(zhì)衍生產(chǎn)物峰m/z（M＋H）＝427.18，符合鳥氨酸衍生后分子量，推測反應(yīng)過程見圖4A；酪氨酸產(chǎn)生的保留時間約46.0 min的副產(chǎn)物峰m/z（M＋H）＝770.77，符合酪氨酸雙衍生物的分子量，見圖4B，該產(chǎn)物與文獻(xiàn)報道結(jié)果相符[12]。此外，衍生試劑產(chǎn)生的最大副產(chǎn)物m/z（M＋H）＝313.10，推測是L-FDLA的氟原子在堿性條件下水解為羥基形成的化合物，見圖4C。

圖4 4種鳥氨酸衍生物（A）、酪氨酸雙衍生物（B）與衍生試劑水解產(chǎn)物（C）示意圖Fig 4 Schematic diagram of 4 ornithine derivatives（A），Bis-Mar-Tyr（B），and hydrolysate of L-FDLA（C）

3.5 含量測定結(jié)果討論

D-Cit衍生物含量測定結(jié)果偏差較大，推測是D-Cit在水解條件下被破壞成了鳥氨酸而產(chǎn)生損失；D-Phe偏差較大的原因暫且未知；其他氨基酸衍生物含量在90%～110%內(nèi)，無明顯異構(gòu)體產(chǎn)生。

3.6 總結(jié)與展望

本文建立了一種能夠排除對映異構(gòu)體氨基酸的干擾從而準(zhǔn)確測定醋酸西曲瑞克產(chǎn)生的10種手性氨基酸含量的方法；該方法高效、簡便，僅用液相色譜系統(tǒng)結(jié)合普通C18色譜柱就能完成測定，可為多肽藥物的手性氨基酸含量測定提供參考。