川西獐牙菜藥物代謝動力學和質(zhì)量控制研究進展

杜茜，張珍源，陳西敬，趙娣（中國藥科大學基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床藥學學院，南京 211199）

川西獐牙菜又稱藏茵陳，是龍膽科獐牙菜屬干燥全草，為一年生矮小草本植物[1]。川西獐牙菜始最早收錄在《四部醫(yī)書》，被稱為藏藥中的奇葩，是清熱利膽的良藥[2]，常用于治療肝膽疾病如慢性肝炎、肝硬化、膽囊疾病等[3]。近年來發(fā)現(xiàn)川西獐牙菜有抗腫瘤[4]、抗微生物[5]、抗突變[6]等作用。川西獐牙菜中主要化合物分為三類：一是環(huán)烯醚萜類，如獐芽菜苷、獐芽菜苦苷和龍膽苦苷等；二是三萜類化合物，如齊墩果酸等；三是呫噸酮類，如芒果苷、當藥醇苷等[7-10]?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)式見圖1。以往報道對該藥的藥理作用和化學成分綜述較多，本文主要從川西獐牙菜的藥物代謝動力學和質(zhì)量控制方面進行綜述，分析藥物開發(fā)可能的挑戰(zhàn)和困難，為進一步利用或開發(fā)川西獐牙菜提供參考。

圖1 川西獐牙菜主要成分化學結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structural formula of the main ingredients of Swertia mussotii

1 川西獐牙菜的藥物代謝動力學研究

中藥是化合物組成的復(fù)雜體系，具有多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點的特征，尤其是各種成分之間由于結(jié)構(gòu)相近可能存在相互轉(zhuǎn)化、相互影響，使得中藥進入體內(nèi)后的吸收、分布、代謝以及排泄等一系列過程的作用機制變得極為復(fù)雜。目前川西獐牙菜提取物的藥物代謝動力學研究報道非常少。Ye等[11]通過UPLC-MS/MS的方法對獐牙菜提取物在大鼠體內(nèi)的藥物代謝動力學行為進行了研究，結(jié)果如表1所示，目標分析物分別為環(huán)烯醚萜類成分中的龍膽苦苷、獐芽菜苷和獐芽菜苦苷，3種成分都是在1.09～2.67 h達峰，半衰期在3.03～6.35 h，從藥物濃度-時間曲線峰面積來看呈現(xiàn)出非線性吸收的特點。Suryawanshi等[12]發(fā)現(xiàn)，家兔耳緣靜脈注射獐牙菜的提取物1 mg·kg－1時，芒果苷的半衰期為0.73～1.05 h，與單體芒果苷相比無顯著差異。川西獐牙菜提取物所含的主要單體比如龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷、芒果苷的藥物代謝動力學研究相對較多[13-15]，故接下來分別從吸收、分布、代謝和排泄的角度對上述4種主要成分進行藥物代謝動力學描述。

表1 川西獐芽菜提取物以及主要單體的藥代動力學參數(shù)Tab 1 Pharmacokinetic parameters of Swertia mussotii extract and main monomer

1.1 吸收

龍膽苦苷、獐芽菜苦苷、獐芽菜苷作為川西獐牙菜藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的一部分[16-17]，均屬于環(huán)烯醚萜類成分，存在吸收較快，生物利用度相對低的情況。龍膽苦苷是川西獐牙菜中含量最多的化合物[14]。Wang等[18-19]先后研究了小鼠和大鼠體內(nèi)龍膽苦苷的吸收特征。小鼠分為兩組，一組灌胃150 mg·kg－1龍膽苦苷，另一組靜脈注射50 mg·kg－1龍膽苦苷，龍膽苦苷符合開放性二房室模型，生物利用度約為39.6%；大鼠分別靜脈注射30 mg·kg－1或灌胃150 mg·kg－1龍膽苦苷，結(jié)果表明龍膽苦苷生物利用度僅為4.71%，推測兩者差異可能是由于種屬不同，腸道壁或肝臟的首過代謝，細菌菌群在腸道中的代謝不同導(dǎo)致的[20]。Shi等[21]將24只大鼠分為了4組，分別尾靜脈注射2 mg·kg－1，灌胃50、100和150 mg·kg－1的獐芽菜苦苷，結(jié)果表明獐芽菜苦苷的生物利用度較低（≤8.0%），且達峰時間（tmax）在1 h左右，說明獐芽菜苦苷在體內(nèi)吸收較快。Li等[22]將大鼠分為兩組，一組尾靜脈注射4 mg·kg－1的獐芽菜苦苷，另一組灌胃25 mg·kg－1的獐芽菜苦苷，采用DAS軟件計算其絕對生物利用度，結(jié)果其生物利用度較低，僅為10.3%，推測可能是獐芽菜苦苷腸道滲透性較差或者肝臟的首過效應(yīng)造成的。Luo等[23]使用HPLC-UV測定靜脈注射1 mg·kg－1以及灌胃500 mg·kg－1獐芽菜苷的大鼠血漿、糞便和膽汁樣品，結(jié)果表明其生物利用度約為0.31%，而糞便和膽汁的排泄率分別為（43.38±3.2）%和（31.2±7.2）%，說明獐芽菜苷大部分會隨著糞便被排出體外，這也可能是其生物利用度低的原因之一。

而呫噸酮類成分芒果苷在大鼠體內(nèi)的絕對生物利用度較低，只有0.31%～1.2%，且研究發(fā)現(xiàn)其存在非線性吸收的現(xiàn)象。Han等[24]將大鼠分為兩組，一組灌胃25 mg·kg－1的芒果苷，另外一組尾靜脈注射10 mg·kg－1芒果苷，使用DAS計算得出其生物利用度約為1.2%。這可能與芒果苷極性較大，滲透性較差有關(guān)。Ma等[25]通過磷脂絡(luò)合技術(shù)，采用大鼠原位腸灌注模型研究絡(luò)合物的腸吸收，發(fā)現(xiàn)大鼠分別灌胃芒果苷和絡(luò)合物后，絡(luò)合物的生物利用度約為單體的2.3倍，這也說明腸通透性能影響芒果苷的吸收。Qiu等[26]對靜脈注射3.0 mg·kg－1芒果苷的大鼠進行藥物代謝動力學研究，發(fā)現(xiàn)半衰期較短，為1 h左右。Liu等[27]開展了芒果苷在大鼠體內(nèi)的多劑量研究，灌胃給予不同劑量（17.5、35、70 mg·kg－1）的芒果苷后計算其藥物代謝動力學參數(shù)，發(fā)現(xiàn)芒果苷在體內(nèi)能夠快速吸收，達峰時間在0.25～1 h，同時達峰濃度Cmax和曲線下面積（AUC）會隨著芒果苷劑量的增高而增大，但并未成比例增加，這也暗示了其在體內(nèi)可能以非線性的方式進行吸收。Cai等[28]也發(fā)現(xiàn)灌胃給藥后芒果苷在大鼠體內(nèi)的吸收是非線性過程。同時，Hou等[29]研究了21名男性中國志愿者，分別口服0.1 g、0.3 g和0.9 g芒果苷，采用HPLC-MS測定血漿濃度，使用非房室模型計算其藥物代謝動力學參數(shù)，當芒果苷劑量從0.1 g增加到0.3 g，從0.3 g增加到0.9 g時AUC0～t并沒有隨著劑量增加而成比例增加，且Log（濃度/劑量）-時間關(guān)系曲線沒有重疊，以上均說明芒果苷是非線性吸收。

1.2 分布

組織分布研究結(jié)果表明，川西獐牙菜提取物所含的主要的環(huán)烯醚萜類成分如龍膽苦苷、獐芽菜苦苷等可以在機體內(nèi)廣泛分布，而呫噸酮類物質(zhì)如芒果苷則在胃腸道出現(xiàn)一定的蓄積。郜盡[30]將大鼠以120 mg·kg－1肌內(nèi)注射龍膽苦苷后發(fā)現(xiàn)，在3.5 min時肺、肝、心、脾等龍膽苦苷有較高的濃度，但腦中未檢測到，說明該藥可能不通過血腦屏障。同時王長虹等[31]將小鼠靜脈注射50 mg·kg－1龍膽苦苷后，發(fā)現(xiàn)在1～3 h腎、肝、肺、脾、胃、心等濃度較高，在8 h左右基本消除完畢。兩者消除時間可能是種屬差異導(dǎo)致結(jié)果有較大差異。Li等[22]對灌胃50 mg·kg－1獐芽菜苦苷的大鼠進行了組織分布實驗，實驗結(jié)果表明在1 h左右會在各個器官（肝，心，脾，肺，腎和腦）產(chǎn)生廣泛分布，獐芽菜苦苷的濃度達到峰值，另外在腎臟和肝中有很高的濃度，說明獐芽菜苦苷可能被肝臟大量攝取且主要隨著尿液排出體外。Lin等[32]對服用35 mg·kg－1芒果苷的大鼠進行組織分布實驗，單體組的結(jié)果表明，芒果苷在血漿和組織中的分布迅速且廣泛，在胃和腸中濃度最高，且在給藥6 h后其濃度仍高于其他組織，提示可能在胃腸道中存在積累，導(dǎo)致血漿濃度和生物利用度降低。

1.3 代謝

環(huán)烯醚萜類化合物的母核含有環(huán)戊烷結(jié)構(gòu)，是五元碳環(huán)并六元氧雜環(huán)單萜類化合物。裂環(huán)環(huán)烯醚萜則是環(huán)戊烷C7-C8共價鍵斷裂形成，龍膽苦苷、獐芽菜苦苷與獐芽菜苷均為裂環(huán)環(huán)烯醚萜類。該類化合物進入體內(nèi)后容易被腸道的β-葡萄糖苷酶水解，生成對應(yīng)的苷元，但由于所生成的苷元為半縮醛結(jié)構(gòu)，故容易形成更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，例如雙醛或含氮雜環(huán)化合物等[33]。

早在1989年，El-Sedawy 等[20]將龍膽苦苷與人腸道的厭氧細菌進行溫孵，發(fā)現(xiàn)能夠代謝為紅白金花內(nèi)酯、龍膽醛等。Zeng等[34]和Han等[35]分別使用UPLC/ESI-Q-TOF-MS和UHPLC/Q-TOF-MS研究龍膽苦苷的代謝過程，發(fā)現(xiàn)龍膽苦苷與β-葡萄糖苷酶孵育后形成半縮醛苷元，易于轉(zhuǎn)化為雙醛形式：一是雙醛結(jié)構(gòu)雙醛與氮原子反應(yīng)生成席夫堿，經(jīng)分子內(nèi)環(huán)化得到代謝產(chǎn)物如紅白金花內(nèi)酯、龍膽醛等；二是雙醛結(jié)構(gòu)在體內(nèi)進行葡萄糖醛酸化，例如在人尿液和大鼠尿液中[36]中代謝為葡萄糖醛酸綴合物。

Shi等[21]使用UPLC-Q/TOF-MS/MS鑒定獐芽菜苦苷的大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物，推斷存在3種代謝途徑：一是6-羥基斷裂后，吡喃環(huán)被保留，然后發(fā)生C＝O反應(yīng)；二是半縮醛的開環(huán)反應(yīng)，半縮醛異構(gòu)成雙醛；三是RDA裂解反應(yīng)，由于六元環(huán)烯烴的存在，吡喃環(huán)被分離（見圖2）；由此可見去羥基化、去羰基化和裂解環(huán)是獐芽菜苦苷裂解的特征步驟，整體來講糖苷化過程在下一次代謝前先形成苷元，得到中間配基，但是其苷元不穩(wěn)定，是形成半縮醛。此時暴露的兩個羰基碳原子容易受到氮原子的親核攻擊。當?shù)庸羝渲幸粋€羰基碳時，原來位置上的氧原子就會脫落，氮原子也可以攻擊另一個羰基碳原子，最終環(huán)化形成吡啶結(jié)構(gòu)，形成龍膽寧堿。同時，半縮醛結(jié)構(gòu)也會以另一種方式打開，然后異構(gòu)化、重排得到紅白金花內(nèi)酯[37]。Wu等[38]使用衍生化的方法也得到了同樣的結(jié)論。Ma等[39]對獐芽菜苦苷的代謝物鑒定研究也發(fā)現(xiàn)了多種不同的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，包括還原、脫水、脫氫、羥化、氫化、磺化、甲基化、甲氧基化、N-雜環(huán)化，確定了龍膽寧堿是其主要代謝產(chǎn)物。Han等[40]使用UHPLC/Q-TOF-MS鑒定了大鼠灌胃100 mg·kg－1獐芽菜苷的尿液代謝產(chǎn)物，約有11種代謝物包含Ⅰ相代謝產(chǎn)物、Ⅱ相代謝產(chǎn)物和苷元，苷元及其葡萄糖綴合物是主要的代謝產(chǎn)物。

圖2 獐芽菜苦苷裂解機制[21，37]Fig 2 Cleavage mechanism of pyroside sprouts[21，37]

除了裂環(huán)環(huán)烯醚萜類，粗提物還含有呫噸酮類化合物，比如芒果苷。芒果苷在體內(nèi)主要以Ⅱ相代謝為主，會被體內(nèi)的β-葡萄糖苷酶水解糖苷鍵形成苷元，繼而進行葡萄糖醛酸化、硫酸化等Ⅱ相反應(yīng)[41]。Liu等[42]對灌胃200 mg·kg－1芒果苷的大鼠進行代謝產(chǎn)物鑒定，發(fā)現(xiàn)尿液中的代謝產(chǎn)物約有32種，同時發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)分布廣泛但是差異較大，如在心臟和脾臟檢測到1種代謝產(chǎn)物，在肺組織中可見芒果苷及2種代謝產(chǎn)物，在肝臟中除芒果苷外，還鑒定出6種代謝產(chǎn)物，在腎臟則出現(xiàn)5種代謝產(chǎn)物。目前已經(jīng)明確了芒果苷在體內(nèi)先經(jīng)過去糖基化再進行去羥基化、甲基化、糖基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化等反應(yīng)。對部分代謝產(chǎn)物進行腸道體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)腸道細菌參與甲基化和去糖基化代謝產(chǎn)物的形成，但代謝產(chǎn)物是否有活性尚未確定。

1.4 排泄

川西獐牙菜提取物及相應(yīng)單體在機體內(nèi)的排泄研究相對較少。馮怡等[43]將健康受試者分別靜脈滴注80、240、400 mg龍膽苦苷，發(fā)現(xiàn)3個劑量25.5 h時平均累計尿排泄率為76.1%，說明龍膽苦苷在人體內(nèi)主要是以原形從尿液中排出。徐貴麗[44]發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃20 mg·kg－1獐芽菜苦苷后從尿中排泄量約占給藥量的1.0%，而糞便僅為0.05%。Wang等[45]研究表明大鼠灌胃120 mg·kg－1的芒果苷后，其尿液的累計排泄率為（6.52±0.12）%，推測排泄率低可能是因為芒果苷在腸道中被代謝或者首過效應(yīng)的影響，也有可能是其他原因造成的。

2 川西獐牙菜的質(zhì)量控制

根據(jù)現(xiàn)有的青海省藏藥炮制規(guī)范規(guī)定[46]，川西獐牙菜粉末呈黃綠色，加75%的乙醇，濾過濃縮，點于濾紙上，置紫外光燈（365 nm）下觀察，顯淡橙黃色熒光，滴加1%乙酸鎂甲酸液，熒光明顯加強，呈亮金黃色，另取濾液，點濾紙上，烘干后，滴加1%三氯化鐵乙醇液，呈淺墨綠色；且按干燥品計算獐芽菜苦苷和龍膽苦苷總計不得少于1.3%。川西獐牙菜所含主要成分龍膽苦苷、獐芽菜苷、獐芽菜苦苷、當藥醇苷、芒果苷和齊墩果酸，可以使用薄層色譜或超高效液相色譜方法進行鑒別[47-48]。近年來尚未在藥典中錄入川西獐牙菜提取物的質(zhì)量標準，需對主要成分制定質(zhì)量標準，防止市場上出現(xiàn)以次充好的局面。

有學者對同一地區(qū)的川西獐牙菜進行指紋圖譜分析，發(fā)現(xiàn)四川境內(nèi)的藥材質(zhì)量穩(wěn)定[49]。另外，川西獐牙菜和印度獐牙菜在磨碎后肉眼無法辨別，F(xiàn)an等[50]使用核磁共振氫譜發(fā)現(xiàn)與印度獐牙菜相比，川西獐牙菜含有的龍膽苦苷、異葒草素、葡萄糖、馬錢苷酸含量會更高。保怡等[51]測定時發(fā)現(xiàn)川西獐牙菜的采摘日期或地域的不同會導(dǎo)致化學成分差異較大，例如四川產(chǎn)出的獐牙菜含有當藥醇苷，而青海玉樹產(chǎn)出的不含該類化合物。這也意味著產(chǎn)地不同，提取物所含的成分也會有所差異，這可能會對其體內(nèi)藥效、毒性以及藥代動力學行為產(chǎn)生差異化影響。

3 討論及展望

川西獐牙菜因分布廣、療效好，受藏醫(yī)的喜愛，許多藏藥書籍記載了川西獐牙菜廣泛的臨床運用，有些療效已經(jīng)被證實，有些仍舊在探索之中。

龍膽苦苷、獐芽菜苷、獐芽菜苦苷和芒果苷均是川西獐牙菜的主要成分。目前的研究表明，主要單體在體內(nèi)都可以較快地吸收達峰，除龍膽苦苷外，其余單體以原形的暴露及排泄都較少，說明其生物利用度低可能存在廣泛代謝并以代謝物的形式排出。但是對于其可能的機制比如是否存在腸道代謝、肝臟首過效應(yīng)，是否有轉(zhuǎn)運體參與其吸收等都有待進一步的研究。同時，環(huán)烯醚萜類化合物（龍膽苦苷、獐芽菜苷、獐芽菜苦苷）均是以Ⅱ相代謝為主，在體內(nèi)先經(jīng)過β-葡萄糖水解為苷元，呈半縮醛形式，易于轉(zhuǎn)化為雙醛形式且二醛與氮原子反應(yīng)生成席夫堿，經(jīng)分子內(nèi)環(huán)化得到含氮代謝產(chǎn)物；芒果苷也以Ⅱ相代謝為主，糖苷鍵發(fā)生斷裂后形成苷元，在苷元的基礎(chǔ)上再進行去羥基化、甲基化、糖基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化反應(yīng)。但是缺少相關(guān)代謝酶亞型的鑒定以及酶動力學研究。另外雖然鑒定出的代謝產(chǎn)物較多，但關(guān)于活性代謝物的評估較少，希望后續(xù)能對代謝產(chǎn)物進行篩選，再對活性化合物進行評估，從而擴展藥物的使用范疇。再者，上述研究大多是以單體的形式在正常動物體內(nèi)開展的，川西獐牙菜提取物中所含的不同單體之間是否有相互作用，在病理情況下其藥物處置過程是否會發(fā)生改變尚未見報道。最后，川西獐牙菜目前缺乏有效的質(zhì)量控制標準，這在限制其國際化的同時，也可能會對其體內(nèi)藥效、毒性以及藥代行為產(chǎn)生差異化的影響。