不同干燥方法對(duì)桑葉主要成分和蘆丁含量的影響

林偉雄，鄧?yán)罴t，鐘志奎，陳仕妍，楊贊，羅毓，張正*，吳曉英（1. 廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；2. 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

桑葉為?？浦参锷orus albaL.的干燥葉，性味甘、苦、寒，歸肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、清肝明目、清肺潤燥的功效，主要用于治療風(fēng)熱感冒、頭暈頭痛、肺熱燥咳、目赤昏花等癥[1]。桑葉資源分布廣泛，主產(chǎn)于廣東、廣西、安徽、重慶、云南等地[2]，具有降血糖、調(diào)血脂、抗病毒、抗氧化等藥理作用[3-6]，含有黃酮類、酚酸類、生物堿類等主要化學(xué)成分[2，7-9]。桑葉作為傳統(tǒng)大宗中藥材，臨床應(yīng)用十分廣泛，采收加工方法也豐富多樣[10]。歷代本草記載，民國以前桑葉加工方法以陰干、炙干為主，陰干、炙干法首次明確記載于宋《本草圖經(jīng)》[11]；民國至今桑葉加工方法則由陰干、炙干轉(zhuǎn)變?yōu)闀窀桑瑫窀煞ㄗ钤缫娪谇濉侗窘?jīng)疏證》[12]，被后續(xù)本草沿用至今。本研究在測(cè)定桑葉指標(biāo)成分蘆丁含量[1]的基礎(chǔ)上，建立桑葉藥材高效液相色譜特征圖譜，通過單因素方差分析和熵權(quán)TOPSIS法等對(duì)蘆丁含量及特征圖譜的多指標(biāo)變量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，探究陰干、曬干、烘干3種加工干燥方法對(duì)桑葉化學(xué)成分的影響，建立科學(xué)合理的桑葉加工干燥方法評(píng)價(jià)體系。

1 材料

1.1 儀器

ARC型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；ME204E型、XP26型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；MiliQ Direct 8型超純水機(jī)（德國默克有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；111B型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥

新綠原酸（批號(hào)：DSTDX001503，純度：99.58%）、隱綠原酸（批號(hào)：DST220104-035，純度：99.30%）、蘆丁（批號(hào)：DST210520-017，純度：99.19%）（成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司）；液相用水為超純水，甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑為分析純。

15批桑葉藥材（編號(hào)1～15）經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅教授鑒定為?？浦参锷orus albaL.的干燥葉，來源信息詳見表1。15批桑葉藥材，每批均分3份，分別平鋪于托盤中，一份于室內(nèi)陰涼干燥通風(fēng)處放置陰干，得桑葉陰干飲片（編號(hào)Y1～Y15）；一份于室外陽光直射處放置曬干，得桑葉曬干飲片（編號(hào)S1～S15）；一份于烘箱內(nèi)設(shè)置55℃烘干，得桑葉烘干飲片（編號(hào)H1～H15）。3種干燥方法均是以藥典標(biāo)準(zhǔn)水分不超過15%評(píng)價(jià)為干，并測(cè)定各批次藥材水分在10%～12%。干燥過程中盡可能確保每種方法不同編號(hào)的樣品處理一致。

表1 15批桑葉藥材來源信息Tab 1 Source information of 15 batches of mulberry leaf

2 特征圖譜的建立及分析

2.1 色譜條件

Waters XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～5 min，15%A；5～20 min，15%～30%A；20～40 min，30%～60%A；40～42 min，60%～15%A；42～47 min，15%A）；檢測(cè)波長358 nm；流速1.0 mL·min－1；柱溫30℃；進(jìn)樣體積10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取新綠原酸、隱綠原酸和蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含新綠原酸39.04 μg、隱綠原酸24.83 μg和蘆丁22.42 μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取陰干、曬干和烘干桑葉樣品粉末（過三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱定重量，超聲處理（功率200 W，頻率40 kHz）45 min，取出冷卻，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.2 重復(fù)性考察 取桑葉供試品粉末約0.5 g，精密稱定，平行制備6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以6號(hào)峰蘆丁為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰RRT和RPA的RSD均小于3.0%，提示該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取桑葉供試品粉末約0.5 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以6號(hào)峰蘆丁為參照峰（S），計(jì)算得到各特征峰RRT和RPA的RSD均小于3.0%，提示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 HPLC特征圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

取15批陰干、曬干及烘干桑葉樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，采集15批不同干燥方法桑葉色譜圖，將其導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件中進(jìn)行色譜圖匹配，分別以Y1、S1、H1圖譜作參照?qǐng)D譜，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1 min，經(jīng)多點(diǎn)校正、全譜峰匹配、中位數(shù)法分別生成陰干、曬干及烘干桑葉的共有特征圖譜及相應(yīng)的對(duì)照特征圖譜，詳見圖1。15批陰干、曬干及烘干桑葉共有特征圖譜中均標(biāo)定了共有峰7個(gè)，通過對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了1號(hào)峰為新綠原酸、3號(hào)峰為隱綠原酸、6號(hào)峰為蘆丁，詳見圖2。計(jì)算15批陰干、曬干及烘干桑葉樣品特征圖譜與各自生成的共有對(duì)照特征圖譜的相似度，同批次陰干、曬干及烘干樣品間的相似度，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示相同干燥方法下的不同批次桑葉樣品以及不同干燥方法下的同批次桑葉樣品間相似度均大于0.95，表明不同批次及不同干燥方法的同批次桑葉樣品間的質(zhì)量一致性較好。

圖1 不同干燥方法桑葉共有特征圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜（R）Fig 1 Common characteristic chromatogram and reference characteristic chromatogram（R）by different drying methods of mulberry leaves

圖2 混合對(duì)照品溶液的HPLC圖Fig 2 HPLC chromatogram of mixed reference substances

表2 不同干燥方法桑葉特征圖譜的相似度結(jié)果Tab 2 Similarity of the characteristic chromatogram of mulberry leaves by different drying methods

2.6 方差分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)15批陰干、曬干及烘干桑葉共有特征峰的單位峰面積進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示，共有峰1～7單位峰面積在陰干、曬干、烘干三者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明不同干燥方法對(duì)桑葉化學(xué)成分影響較小，但整體上曬干桑葉的峰面積含量?jī)?yōu)于陰干與烘干桑葉，另烘干桑葉峰1～3的峰面積含量略高于曬干桑葉，而峰4～7的峰面積含量較曬干桑葉則略有下降，提示峰4～7或?yàn)闊崦舫煞帧?5批陰干、曬干及烘干桑葉特征圖譜共有峰單位峰面積的方差分析結(jié)果見表3。

表3 不同干燥方法桑葉特征圖譜共有峰單位峰面積方差分析結(jié)果( ±s，n＝15)Tab 3 Variance analysis of common peak area of mulberry leaves by different drying methods ( ±s，n＝15)

表3 不同干燥方法桑葉特征圖譜共有峰單位峰面積方差分析結(jié)果( ±s，n＝15)Tab 3 Variance analysis of common peak area of mulberry leaves by different drying methods ( ±s，n＝15)

有峰陰干曬干烘干共1 72 501.33±20 315.8076 520.73±24 010.4880 433.20±38 269.91 2 606 934.07±267 044.42646 428.67±253 508.71704 639.40±251 904.10 3 113 813.67±36 594.97123 350.87±44 798.79137 525.93±69 814.66 4 98 114.80±36 159.27102 490.07±40 642.0889 928.13±31 809.23 5 70 214.53±44 972.9881 893.80±54 804.2659 611.60±29 304.11 6 1 015 570.33±409 264.171 180 612.73±426 067.121 116 798.53±376 830.34 7 502 579.27±279 744.76558 532.73±294 685.32495 255.93±203 671.35

2.7 熵權(quán)TOPSIS法分析

2.7.1 建立初始決策矩陣 假設(shè)樣本有m個(gè)，指標(biāo)有n個(gè)。各樣本（1，2，3…，m）在各指標(biāo)（1，2，3…，n）下的測(cè)量值為Xij，按如下公式計(jì)算初始決策矩陣V。

2.7.2 建立標(biāo)準(zhǔn)化決策矩陣 以15批不同干燥方法桑葉特征圖譜7個(gè)共有特征峰的單位峰面積為高優(yōu)指標(biāo)，按如下公式對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行高優(yōu)指標(biāo)同向化處理，計(jì)算指標(biāo)越大越優(yōu)型Rij，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理。

2.7.3 確定各指標(biāo)權(quán)重 按如下公式計(jì)算各評(píng)價(jià)指標(biāo)的熵值Ej和權(quán)重wj，得到熵值Ej＝（0.9486、0.9437、0.9201、0.9488、0.9100、0.9547、0.9289）；權(quán)重wj＝（0.1156、0.1265、0.1795、0.1150、0.2021、0.1017、0.1597）。

2.7.4 建立加權(quán)決策矩陣 加權(quán)決策矩陣計(jì)算公式如下，確定最優(yōu)向量Z＋＝（Z1＋，Z2＋，…，Zn＋），其中Zj＋＝max（Z1j，Z2j，…，Znj）；最劣向量Z－＝（Z1－，Z2－，…，Zn－），其中Zj－＝min（Z1j，Z2j，…，Znj）。得到Zj＋＝（0.1156、0.1265、0.1795、0.1150、0.2021、0.1017、0.1597）；Zj－均為0。

高校檔案館要想在學(xué)校的發(fā)展實(shí)現(xiàn)自身的價(jià)值，就要改變以前封閉的管理體系, 打破部門與部門、學(xué)校與學(xué)校之間的屏障,在校內(nèi)和校外兩個(gè)方向?qū)で蠛献? 實(shí)現(xiàn)檔案信息的流動(dòng)與共享，不僅將檔案信息資源從形成到歸檔環(huán)節(jié)進(jìn)行管理,更要向外延伸兼顧社會(huì)需求。

2.7.5 貼近度的計(jì)算及評(píng)價(jià) 按如下計(jì)算各批次不同干燥方法桑葉樣品中最優(yōu)向量Z＋和最劣向量Z－的距離D，和各批次不同干燥方法桑葉樣品與最佳方案的歐氏貼近度Ci，并進(jìn)行排名，Ci越大表明越接近最佳方案，結(jié)果見表4和圖3。

圖3 15批不同干燥方法桑葉樣品Ci值折線圖Fig 3 Ci value fold line diagram of 15 batches of different drying methods of mulberry leaves

表4 15批不同干燥方法桑葉樣品質(zhì)量評(píng)價(jià)排序Tab 4 Quality evaluation ranking of 15 batches of mulberry leaf samples by different drying methods

結(jié)果顯示除桑葉藥材編號(hào)為4、12的同批次陰干、曬干、烘干桑葉樣品Ci值幾乎重疊外（見圖3），其余同批次不同干燥方法制備的桑葉樣品Ci值存在差異，且個(gè)別批次浮動(dòng)較大，表明不同干燥方法制備的桑葉樣品多數(shù)存在一定差異。同批次樣品中，最低Ci值曬干桑葉僅占1批，烘干桑葉占6批，陰干桑葉占8批；最高Ci值曬干桑葉占7批，烘干桑葉占6批，陰干桑葉占2批；可知同批次制備的曬干桑葉Ci值整體優(yōu)于陰干和烘干桑葉，且同批次制備的烘干桑葉最高及最低Ci值浮動(dòng)較大，同批次制備的陰干桑葉樣品Ci值則整體偏低。

3 蘆丁的含量測(cè)定

3.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18 色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇為流動(dòng)相A，0.5%磷酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～5 min，30%A；5～10 min，30%～35%A；10～15 min，35%～40%A；15～18 min，40%～50%A；18～19 min，50%～30%A；19～30 min，30%A）；檢測(cè)波長358 nm；流速0.8 mL·min－1；柱溫30℃；進(jìn)樣體積10 μL。

3.2 對(duì)照品溶液的制備

取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg蘆丁的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備

取陰干、曬干、烘干桑葉樣品粉末（過三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，搖勻，密塞，稱定重量，加熱回流1.0 h，冷卻，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)重，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

3.4 專屬性考察

取上述供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照溶液（70%甲醇）各適量，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果桑葉供試品及對(duì)照品色譜圖的基線均平穩(wěn)，蘆丁色譜峰分離度、對(duì)稱性良好，供試品中蘆丁色譜峰與對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間基本相同，且陰性對(duì)照無干擾，見圖4。

圖4 桑葉專屬性考察的高效液相色譜圖Fig 4 HPLC chromatogram of the virginity exclusive investigation of mulberry leaf

3.5 線性關(guān)系考察

取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成含蘆丁199.54 μg·mL－1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別取蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.4、1、2、5、10 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得每1 mL含3.99、7.98、19.95、39.91、99.77、199.54 μg蘆丁的系列對(duì)照品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)樣品。橫坐標(biāo)為進(jìn)樣質(zhì)量濃度（μg·mL－1，X），縱坐標(biāo)為峰面積值（Y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，Y＝2.313×104X＋2.330×104，R2＝0.9992，結(jié)果表明蘆丁在質(zhì)量濃度3.99～199.54 μg·mL－1與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

3.6 精密度考察

取桑葉樣品粉末約0.5 g，精密稱定，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)檢測(cè)6次，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁峰面積的RSD為0.99%，提示儀器精密度良好。

3.7 重復(fù)性考察

取桑葉樣品粉末約0.5 g，精密稱定，平行制備6份，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁峰面積的RSD為0.64%，提示該方法重復(fù)性良好。

3.8 穩(wěn)定性考察

取桑葉樣品粉末約0.5 g，精密稱定，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，記錄峰面積。結(jié)果蘆丁峰面積的RSD為0.20%，提示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.9 加樣回收率考察

取含量已知的桑葉樣品0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按樣品中蘆丁含量的50%、100%和150%分別加入相應(yīng)的對(duì)照品，設(shè)計(jì)3組實(shí)驗(yàn)，每組平行3份。按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“3.1”項(xiàng)色譜條件下檢測(cè)樣品，計(jì)算得低、中、高濃度水平下蘆丁平均加樣回收率分別為102.88%、103.56%、100.17%，RSD分別為0.68%、0.42%、0.38%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

3.10 樣品測(cè)定

取15批陰干、曬干和烘干桑葉樣品粉末約0.5 g，精密稱定，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“3.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表5，同批次樣品中，最低蘆丁含量陰干桑葉占8批，烘干桑葉占7批；最高蘆丁含量曬干桑葉占13批，烘干與陰干桑葉各占1批；可知曬干制備的桑葉樣品蘆丁含量整體優(yōu)于陰干和烘干桑葉。

表5 15批不同干燥方法桑葉蘆丁含量結(jié)果(%)Tab 5 Rutin content of 15 batches of mulberry leaves by different drying methods (%)

4 討論

本研究通過圖譜相似度、方差分析、熵權(quán)TOPSIS法對(duì)比分析了陰干、曬干、烘干3種干燥方法對(duì)桑葉特征圖譜共有峰的影響。特征圖譜相似度結(jié)果表明3種干燥方法制備的桑葉樣品相似度均大于0.95，方差分析結(jié)果也顯示7個(gè)共有峰的單位峰面積間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明不同干燥方法桑葉樣品間一致性較好，即不同干燥方法對(duì)桑葉化學(xué)成分影響較小。熵權(quán)TOPSIS法通過數(shù)據(jù)本身的離散性進(jìn)一步確定了桑葉樣品中7個(gè)共有峰的權(quán)重，根據(jù)Ci值對(duì)不同干燥方法的桑葉樣品進(jìn)行排序[13]，結(jié)果表明不同干燥方法制備的桑葉樣品Ci值存在一定差異，曬干桑葉的Ci值整體優(yōu)于陰干和烘干桑葉，烘干桑葉的Ci值浮動(dòng)較大，陰干桑葉的Ci值則整體偏低，提示不同干燥方法制備的桑葉樣品間化學(xué)成分含量差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但曬干桑葉樣品質(zhì)量整體穩(wěn)定且優(yōu)于陰干、烘干桑葉樣品。另通過測(cè)定不同干燥方法的桑葉樣品中蘆丁含量的結(jié)果可知，曬干桑葉樣品蘆丁含量整體優(yōu)于陰干和烘干桑葉樣品，與熵權(quán)TOPSIS法分析結(jié)論一致。該方法穩(wěn)定性及重復(fù)性較好，且操作簡(jiǎn)單，可為桑葉干燥工藝參數(shù)進(jìn)一步研究提供科學(xué)合理的評(píng)價(jià)方法，也可為桑葉資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

5 展望

為保證藥食兩用桑葉藥材的質(zhì)量和品質(zhì)，可考慮進(jìn)一步加強(qiáng)桑葉干燥方法的規(guī)范化研究，同時(shí)考慮到桑葉中主要含蘆丁、綠原酸等具有熱敏、易氧化特性的有效成分[2]，在干燥方法選擇上應(yīng)盡量遵循低溫、快速原則[14]。傳統(tǒng)干燥方法中，陰干干燥方法雖遵循了低溫原則，但在長時(shí)間陰干過程中，桑葉容易腐爛、變質(zhì)，失去藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值；現(xiàn)代干燥技術(shù)烘干的干燥進(jìn)程雖快，但也會(huì)加速桑葉有效成分的氧化、水解等反應(yīng)。這可能是本次研究結(jié)果中陰干、烘干桑葉樣品質(zhì)量穩(wěn)定性不如曬干桑葉的主要原因，在桑葉大生產(chǎn)干燥應(yīng)用中其不穩(wěn)定性極可能會(huì)進(jìn)一步放大[15-16]，進(jìn)而造成市場(chǎng)上流通的桑葉質(zhì)量參差不齊，故在保證桑葉干燥品質(zhì)的基礎(chǔ)上，建議對(duì)陰干、曬干、烘干等干燥方法的工藝參數(shù)進(jìn)行更精細(xì)的研究，以確保采收加工的桑葉藥材質(zhì)量穩(wěn)定且均一，從而使桑葉得到更有效的利用。