噴昔洛韋乳膏體外釋放一致性研究

信長穎，趙龍山，多凱，于新穎，尋延濱，劉利群*（. 黑龍江省藥品檢驗研究院，哈爾濱 50088；.沈陽藥科大學，沈陽 006）

噴昔洛韋是抗病毒藥物，對水痘、帶狀皰疹病毒有很強的抑制作用[1]。噴昔洛韋乳膏劑屬于半固體制劑，發(fā)揮治療作用主要取決于遞藥的3個過程[2]：① 活性成分從基質(zhì)中釋放到第一層生物屏障-角質(zhì)層，即體外釋放（in vitro release，IVR）；② 滲透擴散于角質(zhì)層或其他皮膚層，即體外滲透（in vitro permeation test，IVP）；③ 在作用部位產(chǎn)生期望的藥理作用。2021年3月我國國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心發(fā)布了《皮膚外用化學仿制藥研究技術指導原則（試行）》[3]，該指導原則明確指出在對皮膚外用仿制藥一致性評價時，應對關鍵質(zhì)量屬性（CQAs）體外釋放試驗（IVRT）和體外滲透試驗（IVPT）進行研究。國外對阿昔洛韋乳膏的IVRT進行了詳盡的研究[4-5]，但國內(nèi)多集中于在制劑研發(fā)初期采用IVRT和IVPT進行處方篩選[6-9]及綜述[10]，仍未見關于半固體制劑IVRT全面驗證及等效性評價的實例分析。因此本文以2021年國家抽檢的7個廠家的噴昔洛韋乳膏為例，采用Franz擴散池及與噴昔洛韋具有惰性的商品膜，研究該乳膏劑的體外釋放，建立科學完善的方法學驗證過程，評價國內(nèi)市售噴昔洛韋乳膏與參比制劑體外釋放速率的差異，為噴昔洛韋乳膏等半固體制劑開展質(zhì)量一致性評價奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

XS205DU型電子天平（十萬分之一，梅特勒公司）；精控型體外經(jīng)皮滲透試驗系統(tǒng)KX-V/HDP（大連科翔科技開發(fā)有限公司，帶有12個豎式擴散池）；UltiMate 3000高效液相色譜儀（賽默飛世爾公司）。混合纖維素微孔濾膜（0.45 μm，江蘇綠盟科學儀器有限公司）；尼龍微孔濾膜（0.45 μm，江蘇綠盟科學儀器有限公司）；Strat-M膜（直徑25 mm，厚度300 μm，編號：SKBM02560，默克密理博）。

1.2 試驗

對照品噴昔洛韋（批號：100769-201502，純度：99.8%，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，美國霍尼韋爾公司）；磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；生理鹽水（蘭西哈三聯(lián)制藥有限公司）。

噴昔洛韋乳膏原研制劑（美國Perrigo，批號：I9210411，規(guī)格：10 g/支），作為參比制劑（R）；2021年國家評價性抽檢中涉及到的7個生產(chǎn)企業(yè)各1批樣品作為仿制制劑（T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7）。

2 方法與結果

2.1 接收液的選擇

將過量的噴昔洛韋對照品溶解在生理鹽水中，制備噴昔洛韋飽和溶液；將配制好的噴昔洛韋飽和溶液在（32.0±0.5）℃下恒溫振蕩24 h，實驗平行3組，然后將飽和溶液取出離心，并用恒溫至（32.0±0.5）℃的混合纖維素微孔濾膜過濾，將過濾好的溶液用生理鹽水稀釋并用HPLC分析，計算噴昔洛韋的飽和溶解度。結果噴昔洛韋在32℃生理鹽水中的飽和濃度為1.975（SD：0.05）mg·mL－1，接收池體積為10 mL，接收液理論上可溶解約20 mg的噴昔洛韋；當噴昔洛韋乳膏的給藥量約為0.2 g時，噴昔洛韋乳膏的規(guī)格為1%，樣品中噴昔洛韋的給藥量約為2 mg，用10 mL的生理鹽水作為接收液進行體外釋放試驗可滿足漏槽條件。

2.2 膜的選擇

2.2.1 膜的惰性研究 在（32±0.5）℃條件下，分別將纖維素微孔濾膜、尼龍微孔濾膜、Strat-M膜浸入10 mL約為0.2 mg·mL－1的噴昔洛韋生理鹽水溶液（上樣0.2 g時，若噴昔洛韋全部釋放，接收液中噴昔洛韋質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL－1）中保溫24 h，平行3組。作為對照，制備沒有膜的相同濃度的噴昔洛韋生理鹽水溶液，同時保溫24 h，平行3組。隨后用HPLC測定各測試溶液的濃度，通過將放有浸漬膜的溶液的平均濃度除以對照品溶液的平均濃度，計算相對于對照的回收率，回收率應在（100.0±5.0）%，說明膜對噴昔洛韋無吸收[5]。結果混合纖維素微孔濾膜回收率為（98.5±0.9）%，尼龍微孔濾膜的回收率為（97.4±0.5）%，Strat-M膜的回收率為（97.8±0.8）%，3種膜對噴昔洛韋均無明顯吸收。

2.2.2 膜的阻滯性研究 分別將混合纖維素微孔濾膜、尼龍微孔濾膜、Strat-M膜（各膜均預先在接收液中浸泡30 min以消除氣泡）固定于Franz擴散池的一端，接收池接收液總體積為10 mL，擴散池上精密加入0.2 mg·mL－1的噴昔洛韋生理鹽水溶液0.2 mL，在600 r·min－1和（32±0.5）℃條件下恒速恒溫攪拌，并于0.5、1、2 h取接收液0.2 mL，每次取樣完成后立即補加0.2 mL（32±0.5）℃的接收液，根據(jù)測定每一取樣點噴昔洛韋的濃度，計算藥物溶液累積釋放率。以累積釋放百分率對時間t作圖，結果見圖1，噴昔洛韋溶液在混合纖維素微孔濾膜上的釋放速率最大，無阻滯作用，因此選擇混合纖維素微孔濾膜進行研究。

圖1 昔洛韋溶液在不同商品膜上的釋放情況Fig 1 Release of penciclovir solution on different commercial films

2.3 體外釋放的測定方法

2.3.1 方法 采用Franz擴散池[11]（《美國藥典》USP43中的C型立式擴散池）進行體外釋放試驗，裝置示意圖見圖2。將混合纖維素微孔濾膜（預先在接收液中浸泡30 min以消除氣泡）固定于擴散池的一端，精密稱取約0.2 g噴昔洛韋乳膏，在釋藥面積1.77 cm2的膜上通過定量環(huán)均勻涂抹上樣，接收池接收液總體積為10 mL，在600 r·min－1和（32±0.5）℃條件下恒速恒溫攪拌，并于0.5、1、2、4、6 h取接收液0.2 mL[每次取樣完成后立即補加0.2 mL（32±0.5）℃的接收液]，分別作為體外釋放測定用供試品溶液，采用HPLC法進行定量分析。每個樣品運行6次，每次在不同的擴散池上運行，并與參比制劑進行對比，以消除不同擴散池帶來的差異。

圖2 C 型立式擴散池[11]Fig 2 Vertical diffusion cell model C[11]

2.3.2 方法學驗證[14]按FDA的阿昔洛韋乳膏指南草案方法學驗證方法對本IVRT方法進行方法學驗證。

①日內(nèi)精密度和日間精密度：精密稱取參比制劑6份，分別置于6個擴散池，計算每個擴散池的釋放速率，6個釋放速率的變異系數(shù)（CV）應小于15%，即為日內(nèi)精密度。次日，再次精密稱取參比制劑6份，分別置于6個擴散池，計算每個擴散池的釋放速率，計算3 d共18個釋放速率的CV，即為日間精密度。結果日內(nèi)精密度的CV為4.6%，日間精密度的CV為9.2%，均小于15%。符合檢測重現(xiàn)性的要求。

② 線性：“①”項下18個釋放曲線方程，每個方程的r2均大于0.99，滿足指南草案中要求的r2大于0.90的要求，說明本IVRT方法可采用Higuchi方程進行線性擬合計算。

③ 靈敏性：按某一已知企業(yè)的噴昔洛韋乳膏的制備方法制備0.5%、1.0%、1.5% 3種不同規(guī)格的噴昔洛韋乳膏，每個濃度測定6份，計算平均釋放速率，0.5%乳膏的釋放速率為143.8 μg·cm－2·h1/2，1%乳膏的釋放速率為241.3 μg·cm－2·h1/2，1.5%乳膏的釋放速率為352.1 μg·cm－2·h1/2。說明該方法是靈敏的。

④ 特異性：以“①”項下0.5%、1.0%、1.5%制劑的釋放速率為縱坐標，以標示百分含量為橫坐標，線性回歸方程為Y＝2.07×104X＋35.87，r2為0.9989?？梢姳痉椒ň哂刑禺愋?，能準確監(jiān)測制劑中釋放速率隨藥物濃度變化的比例關系。

⑤ 選擇性：取“①”項下噴昔洛韋乳膏，分別計算0.5%、1.0%、1.5%與1.0%乳膏的90%置信區(qū)間，1.0%乳膏與1.0%乳膏相比，90%置信區(qū)間均在75.00%～133.33%內(nèi)，但新制備的0.5%、1.5%的噴昔洛韋乳膏的釋放速率與1.0%乳膏相比，在75.00%～133.33%外，可見本方法具備足夠的選擇能力，可以識別處方中主藥濃度的變化。

⑥ 耐用性：測定溫度為（34±0.5）℃、（30±0.5）℃時，轉(zhuǎn)速為540、660 r·min－1時的釋放速率，與原條件相比，平均釋放速率的CV分別為10.2%、11.5%、12.0%、14.0%，均小于15%，說明本方法的耐用性良好。

2.4 高效液相色譜法測定噴昔洛韋的含量[12]

2.4.1 方法 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為0.02 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液-甲醇（9∶1）；流速1.0 mL·min－1；檢測波長254 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL。

2.4.2 方法學驗證

① 專屬性：精密稱取噴昔洛韋對照品12.91 mg置100 mL量瓶中，用生理鹽水超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。精密量取“2.3.1”項下的供試品溶液、對照品溶液及空白溶劑10 μL進樣分析，典型色譜圖見圖3?？瞻兹軇y定無干擾，本方法專屬性好。

圖3 噴昔洛韋的高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of penciclovir

② 線性：精密稱取噴昔洛韋對照品12.91 mg置100 mL量瓶中，用生理鹽水超聲使溶解并定容至刻度，搖勻，作為噴昔洛韋對照品儲備液。精密量取噴昔洛韋對照品儲備液0.1、1、5、7.5、10 mL置10 mL量瓶中，用生理鹽水稀釋至刻度，搖勻，即得標準系列溶液，精密量取各溶液10 μL進樣分析，繪制標準曲線。以質(zhì)量濃度（μg·mL－1）為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），線性回歸方程為Y＝505.7X－0.001 81（r＝1.000），噴昔洛韋在0.0013～0.1288 mg·mL－1與峰面積呈良好的線性關系。

③ 精密度：分別精密量取對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣5次，5次峰面積RSD為0.20%，符合測定要求。

④ 準確度：取6份參比制劑R約0.2 g，置于20 mL量瓶中，各分別精密加入約2 mg噴昔洛韋對照品，超聲使溶解，用生理鹽水稀釋至刻度。精密量取各溶液10 μL進樣分析，結果得回收率平均值為95.5%，RSD為3.5%，滿足測定要求。

⑤ 重復性：取6份參比制劑R，置于10 mL量瓶中，用生理鹽水溶解并稀釋刻度，搖勻，精密量取各溶液10 μL進樣分析，結果得峰面積RSD為3.3%。可認為本方法重復性好。

⑥ 穩(wěn)定性：取“⑤”重復性項下供試品溶液分別放置0、4、8、12、24 h測定，結果得峰面積的RSD為0.50%，穩(wěn)定性符合測定要求。

⑦ 檢測限和定量限：精密量取專屬性項下的對照品溶液，反復稀釋，以噴昔洛韋色譜峰信噪比為3∶1時為檢測限，檢測限為0.32 ng，以信噪比為10∶1時為定量限，定量限為0.64 ng。

2.5 體外釋放速率和累積釋放率的計算及統(tǒng)計分析方法[13]

實驗過程中每次取樣測得的接收介質(zhì)中的藥物濃度，按以下公式計算單位面積的累積釋放量：

Qn＝每單位面積在時間（n）釋放的量（μg·cm－2）；Cn＝不同采樣時間（n）下接收介質(zhì)中的藥物濃度（μg·cm－3）；Vs＝樣品體積（cm3）；Vc＝接收室容積（cm3）；Ac＝有效擴散面積（cm2）。

半固體制劑中的藥物釋放一般遵循Higuchi方程，釋放達穩(wěn)態(tài)后單位面積累積釋放量與時間的平方根呈線性關系，其相關系數(shù)r2應大于0.90，直線部分的斜率為藥物釋放速率。

將各取樣點的累積釋放量，除以加入擴散池中的藥物的實際量，計算各時間點的累積釋放率。體外釋放參比制劑（R）和仿制制劑（T）各產(chǎn)生6個斜率（體外釋放速率）。計算仿制制劑的體外釋放速率與參比制劑的體外釋放速率比值的90%置信區(qū)間，用百分比表示?；赟UPAC-SS指南中描述的Mann-Whitney U檢驗，來判斷兩組數(shù)據(jù)的中位數(shù)有無差別。Mann-Whitney U檢驗是將兩組樣本的數(shù)值統(tǒng)一由小到大編秩，由Mann-Whitney U檢驗求出90%置信區(qū)間的上下界值的范圍。如上下限均落在75.00%～133.33%，則表示仿制制劑與參比制劑的釋放速率的中位數(shù)差異在允許范圍內(nèi)，仿制制劑與參比制劑的釋放速率是等效的，如置信區(qū)間的值仍落在75.00%～133.33%外，則判斷為兩制劑的釋放速率不等值。

2.6 仿制制劑與參比制劑的釋放結果比較

以不同時間累積釋放量（μg ·cm－2）為縱坐標Y，以時間的平方根為橫坐標X，對其進行線性回歸，參比制劑與7個仿制制劑的釋放速率方程見表1，方程的斜率為釋放速率。各仿制制劑與參比制劑釋放速率的比較見圖4。7家仿制制劑與參比制劑（T/R）釋放速率比值的90%置信區(qū)間上下限及一致性判定見表2?？芍?，7家仿制制劑中，僅一家企業(yè)的制劑（T4）與參比制劑的釋放速率一致，其他6家仿制制劑均不一致。其中T1、T2、T5、T6、T7釋放速率高于R，而T3釋放速率低于R。

表1 釋放速率方程Tab 1 Release rate equation

表2 7家仿制制劑與參比制劑釋放速率比值的90%置信區(qū)間及一致性判定Tab 2 Confidence interval and consistency of release rate of generic preparation from 7 manufacturers and reference preparation

圖4 7家仿制制劑與參比制劑釋放速率的比較Fig 4 Release rate of generic preparation from 7 manufacturers and reference preparation

3 討論

FDA 在其頒布的SUPAC-SS 指導原則“非無菌半固體制劑擴大規(guī)模和上市后變更：體外釋放試驗和體內(nèi)生物等效性要求”中指出，半固體局部用制劑在生產(chǎn)放大和產(chǎn)品批生產(chǎn)發(fā)生變更時須進行體外釋放試驗，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的一致性和等效性[13]。FDA已發(fā)布了多個外用半固體仿制藥的指南草案，如阿昔洛韋乳膏、磷酸克林霉素凝膠、甲硝唑陰道用凝膠、維甲酸凝膠、貝沙羅汀凝膠和二十二烷醇乳膏等，完成IVRT或IVRT和體外滲透試驗后可申請生物等效性豁免[14-19]。

本文以噴昔洛韋乳膏作為模型藥物，建立了乳膏體外釋放測定方法，在方法建立之初，考察了20%丙二醇的生理鹽水溶液、5%吐溫80溶液以及生理鹽水3種接收液，發(fā)現(xiàn)因3種接收液均達到漏槽條件，參比制劑在3種接收液釋放速率無差異，從一定程度說明IVRT作為半固體制劑的一種物理性質(zhì)，接收介質(zhì)不影響制劑的形態(tài)，即接收介質(zhì)不影響藥物的釋放，合適的接收介質(zhì)可以是多種，在選擇接收介質(zhì)時，只要保證溶解度要求及接收介質(zhì)的穩(wěn)定性即可。

IVRT試驗選擇膜時主要取決于三點：膜的惰性（與API和接收液無反應）、無擴散、無阻滯。因此本文設計了膜惰性試驗，所選擇的3種膜與噴昔洛韋均沒有結合情況。但在膜的阻滯性研究中，3種膜在2 h后均對噴昔洛韋無阻滯，但在纖維素微孔濾膜上速度快，阻滯作用小，因此本文選擇纖維素微孔濾膜進行IVRT研究。噴昔洛韋溶液2 h在Strat-M膜中基本無透過，此外本次還監(jiān)測了參比制劑與各仿制制劑在Strat-M膜24 h的釋放情況，參比制劑和各仿制制劑在該膜上的釋放量均低于檢測限，Strat-M膜與人體皮膚相似，適用于IVPT研究[20]，不適用于藥物釋放的考察，同時證明各制劑均不透過皮膚，與說明書標注“本品在血液中無法檢測到”一致，證明了各制劑的安全性[21]。

體外釋放速率可能不能完全反映藥物透皮遞送的速率，但可參考檢測到的釋放速率的變化來推測某些物理化學性質(zhì)（如原料藥粒度、物理狀態(tài)）及工藝參數(shù)等變化帶來的制劑內(nèi)在質(zhì)量差異，此類差異可能會最終影響制劑的療效。并且有國外學者提出，如果仿制藥與參比制劑輔料的種類（Q1）、用量（Q2）不同，即使輔料存在差異，但輔料是惰性的，對藥物的透皮沒有影響，如果反映物理性能與微觀結構（Q3）的體外釋放率相同，也可以申請生物等效豁免，這一理論是由提出生物藥劑學分類系統(tǒng)（BCS）理論的研究小組成員提出，在FDA網(wǎng)站可以查到多次關于這一分類系統(tǒng)局部給藥分類系統(tǒng)（TCS）的研討，可見體外釋放試驗對于半固體制劑研究的重要性[22]。

本文首次建立了IVRT的方法學驗證，采用偽無限上樣量（取樣最后時間點的累積釋放率小于30%），不同濃度的噴昔洛韋乳膏釋放速率不同，驗證了方法的靈敏性，釋放速率與濃度的變化呈線性關系驗證了方法的特異性，該方法可區(qū)分不同濃度的噴昔洛韋乳膏，說明建立的方法具有選擇性，進一步證明了所選用的膜惰性無阻滯。此外本試驗還控制環(huán)境溫度（21±2）℃，濕度（50±20）%，并在試驗前對擴散池的體積、孔口直徑、轉(zhuǎn)速、工作臺的傾斜度進行了全面的驗證。經(jīng)驗證的IVRT方法可準確評價產(chǎn)品的質(zhì)量，但同時建議采用氫化可的松校正軟膏對擴散池儀器進行更為全面的驗證（類似于溶出度中的水楊酸校正片）[23]。

4 結論

本研究采用IVRT方法測定了噴昔洛韋乳膏國內(nèi)7家仿制企業(yè)的各1批樣品與參比制劑的釋放速率，并按照FDA的SUPAC-SS指導原則中的等效性判定方法對各試驗制劑與參比制劑的等效性進行判定，結果僅1家企業(yè)制劑的釋放速率與參比制劑在等效性范圍75.00%～133.33%內(nèi)，其他6家企業(yè)制劑的釋放速率與參比制劑均不等效。雖然在IVRT研究中測定的特定釋放速率并不與藥物在體內(nèi)從產(chǎn)品中釋放的速率相關，但經(jīng)過驗證的IVRT方法可以對試驗制劑和參比制劑之間的釋放速率差異敏感[24]。如果在IVRT研究中觀察到這種差異，則增加了產(chǎn)品性能可能在體內(nèi)存在的潛在差異。相反，與參比制劑相比，試驗制劑具有相同的藥物釋放率，則降低了生物等效性失敗模式的風險，因此支持生物等效性的論證。本研究為進一步擴大建立乳膏體外釋放測定方法及質(zhì)量一致性評價奠定基礎。