藏藥二十五味松石丸抑制血管生成和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化改善四氯化碳-酒精誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化研究

許湘，黃丹，2，陸華冠，劉延濤，劉馨，謝新，2，雷昌，2，趙洪慶，2，劉建軍，2*（.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 科技創(chuàng)新中心，長沙 40208；2.中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，長沙 40208；.中山大學(xué)附屬醫(yī)院第三醫(yī)院超聲科，廣州 5060）

肝纖維化常見于慢性肝病，可由多種致病因子引起，造成細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）大量沉積，纖維瘢痕替代正常組織。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧和炎癥是誘導(dǎo)肝纖維化形成最重要的因素，也是導(dǎo)致血管生成和血管重塑的原因，故血管生成在肝纖維化向肝硬化和肝癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[1]。目前，抗血管生成治療已被證明可改善肝纖維化，降低門靜脈高壓，延長肝癌患者的總生存期[2-3]。在肝纖維化過程中，ECM主要由肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，而肌成纖維細(xì)胞主要來源于活化的肝星狀細(xì)胞[4]。且越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）也是肌成纖維細(xì)胞來源之一，可能會促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[5]。

二十五味松石丸（Ershiwuwei Songshi pill，ESP）是藏區(qū)治療肝臟疾病的經(jīng)典方劑，具有清熱解毒、疏肝利膽等功效，可用于治療肝中毒、肝痛、肝硬化、腹水等疾病，收載于2020年版《中國藥典》一部[6]。研究發(fā)現(xiàn)，二十五味松石丸在臨床上具有治療病毒性肝炎和肝硬化等療效[7-8]。此外，二十五味松石丸也被證明在膽汁淤積性肝損傷[9]、非酒精性脂肪性肝炎[10]和藥物性肝損傷[11]動物模型中具有肝保護(hù)作用，但較少人研究該藥的抗肝纖維化作用[12]。目前關(guān)于二十五味松石丸如何發(fā)揮抗肝纖維化作用的機(jī)制尚不清楚。因此，本課題通過構(gòu)建四氯化碳（CCl4）-酒精誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，探究二十五味松石丸防治肝纖維化的可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g [湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物公司，單位使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004]，實(shí)驗(yàn)均符合動物倫理審查，倫理批準(zhǔn)號：LL2022062803。所有動物均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，溫度（22±2）℃，濕度50%～55%，自由飲食飲水，黑暗和光照環(huán)境各12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥

大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號：2109R28）、大鼠谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號：2109R30），大鼠透明質(zhì)酸（HA，批號：2211R11）、大鼠層黏蛋白（LN，批號：2211R40）（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）；大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α，批號：KE20001，武漢三鷹有限公司）；蘇木素染液（批號：20123002）、伊紅染液（批號：19071801）、兔二步法檢測試劑盒（貨號：PV-9001）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Masson試劑盒（貨號：CR2108024，武漢塞維爾生物科技有限公司）；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA，貨號：AF1032，江蘇親科生物有限公司）；轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1，貨號：ab215715）、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（CD31，貨號：ab182981）（Abcam公司）；E-鈣黏蛋白（E-cadherin，貨號：20874-1-AP）、波形蛋白（Vimentin，貨號：10366-1-AP）（武漢三鷹公司）；BCA蛋白定量試劑盒（貨號：CW00145，康為世紀(jì)公司）。

1.3 儀器

超純水儀（法國milli-Q公司）；HistoCore PEARL型自動脫水機(jī)、HistoCore Arcadia H型自動包埋機(jī)、RM2235型石蠟切片機(jī)、正置熒光顯微鏡（德國Leica公司）；Pannoramic MIDI數(shù)字玻片掃描系統(tǒng)（匈牙利3DHISTECH公司）；MK3型多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；Mini-PROTEAN Tetra 型蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 二十五味松石丸的制備

二十五味松石丸（松石50 g、珍珠 10 g、珊瑚 40 g、朱砂 20 g等二十五味藥，批號：19061A，西藏甘露藏藥股份有限公司，規(guī)格：1 g/丸）。藥丸研磨后以0.4%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑，超聲波混勻制成混懸液，在使用前搖勻。

2.2 造模與給藥

30只動物按照隨機(jī)數(shù)字表分為正常組，模型組，二十五味松石丸低、中、高劑量組[88、176、352 mg/（kg·d）]，低劑量相當(dāng)于臨床等效量（按丸計(jì)算）[13]，每組6只。除正常組外，各組大鼠給予腹部皮下注射50%CCl4橄欖油溶液，每次注射劑量為3 mL·kg－1，每周2次，同時給予5%酒精飲料飼養(yǎng)，連續(xù)造模8周[14]。正常組給予等體積的橄欖油腹部皮下注射，以蒸餾水喂養(yǎng)。從造模開始給予藥物灌胃治療，正常組給予等量的0.4%羧甲基纖維素鈉溶液（以雙蒸水配制），一日一次，給藥體積為10 mL·kg－1。末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛麻醉，收集血清和肝臟組織。

2.3 檢測指標(biāo)及結(jié)果

2.3.1 HE和Masson染色檢測大鼠肝臟組織病理變化和膠原增生 HE染色：新鮮肝臟組織用4%多聚甲醛溶液室溫固定24 h，行梯度乙醇脫水、透明、石蠟包埋、切片（厚度4 μm），蘇木素染色5 min，然后伊紅染色5 min，光學(xué)顯微鏡下檢測大鼠肝臟組織病理變化。Masson染色方法：肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，重鉻酸鉀媒染劑室溫浸泡15 h，其余按照試劑盒操作，光學(xué)顯微鏡下檢測組織膠原增生情況。

結(jié)果顯示（見圖1及表1），正常組大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)整齊，肝小葉完整，肝索排列緊密，未見任何的膠原纖維增生；模型組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，無完整的肝小葉結(jié)構(gòu)，假小葉形成，大小不一的脂滴彌散在肝細(xì)胞周圍，大量的膠原纖維增生，纖維結(jié)構(gòu)內(nèi)可見炎性細(xì)胞堆積。與模型組相比，二十五味松石丸各劑量組大鼠肝組織病理損傷有明顯改善，膠原纖維陽性面積明顯減少（P＜0.01），高劑量組改善效果最好。

圖1 二十五味松石丸對大鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響（箭頭為壞死區(qū)域；bar＝200 μm）Fig 1 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the liver histomorphology of rats in each group（the arrow for necrosis area，bar＝200 μm）

表1 二十五味松石丸對肝纖維化大鼠模型膠原纖維增生的影響(n＝6)Tab 1 Effect of Ershiwuwei Songshi pills on collagen fiber proliferation in the rat model with hepatic fibrosis (n＝6)

2.3.2 ELISA法測定大鼠血清肝功能、TNF-α以及肝纖維化指標(biāo) 取材時，大鼠腹主動脈收集全血，室溫靜置1 h分層后，4℃、4000 r·min－1離心15 min，分離上清液，－20℃?zhèn)溆?。按ELISA試劑盒方法操作，檢測ALT、AST、TNF-α和HA、LN水平。

如表2所示，與正常組相比，模型組大鼠血清中肝功能ALT、AST指標(biāo)水平和TNF-α含量明顯上升；與模型組相比，二十五味松石丸各劑量組大鼠血清能明顯降低AST、ALT和TNF-α含量。如表3所示，與正常組相比，模型組大鼠血清中肝纖維化指標(biāo)HA和LN明顯上升；與模型組相比，二十五味松石丸各劑量組能明顯降低大鼠血清中HA和LN水平。

表2 二十五味松石丸對各組大鼠血清中AST、ALT和TNF-α水平的影響( ±s，n＝6)Tab 2 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the serum levels of AST，ALT and TNF-α in different groups ( ±s，n＝6)

表2 二十五味松石丸對各組大鼠血清中AST、ALT和TNF-α水平的影響( ±s，n＝6)Tab 2 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the serum levels of AST，ALT and TNF-α in different groups ( ±s，n＝6)

注：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01。Note：Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，##P＜0.01.

組別AST/（U·L－1）ALT/（U·L－1）TNF-α/（pg·mL－1）正常組 80.38±7.61 29.28±4.21 65.50±10.66模型組328.21±8.75**116.57±5.12** 247.5±9.17**二十五味松石丸低劑量組200.32±9.72## 81.12±4.66## 168.8±14.17##二十五味松石丸中劑量組130.24±6.32## 63.90±2.45##120.48±8.21##二十五味松石丸高劑量組 98.34±7.42## 33.90±3.52## 75.76±13.13##

表3 二十五味松石丸對大鼠血清中肝纖維化指標(biāo)HA和LN水平的影響(n＝6)Tab 3 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the HA and LN levels in the serum of rats in each group (n＝6)

2.3.3 免疫組化檢測肝組織中CD31、α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá) 取制得的肝組織石蠟切片，經(jīng)過常規(guī)脫蠟至水；配制EDTA（pH＝9.0）抗原修復(fù)液，使用高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)；3%過氧化氫孵育30 min，PBS洗3次；5%正常山羊血清37℃封閉1 h；孵育一抗CD31（1∶2000）、α-SMA（1∶500）、TGF-β1（1∶500）、E-cadherin（1∶8000）和Vimentin（1∶2500）；后續(xù)操作按照兔二步法檢測試劑盒PV-9001操作；DAB顯色，蘇木素染細(xì)胞核，中性樹脂封片。Pannoramic MIDI數(shù)字玻片掃描儀掃描全片，隨機(jī)選擇區(qū)域，Image-Pro Plus6.0軟件分析各組目的蛋白的平均積分光密度（IOD）。

結(jié)果顯示（見圖2及表4），CD31主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上。正常組大鼠肝組織中可見少量的CD31蛋白表達(dá)，模型組可見大量的CD31蛋白表達(dá)，主要分布在增生膽管、中央靜脈和肝竇周圍。與模型組相比，二十五味松石丸各劑量組CD31蛋白表達(dá)均有降低（P＜0.05或P＜0.01），其中二十五味松石丸高劑量組CD31蛋白降低更明顯。

圖2 二十五味松石丸對大鼠肝組織血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（CD31）蛋白表達(dá)的影響（×400，bar＝100 μm）Fig 2 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the platelet endothelial cell adhesion molecule-1（CD31）protein expression in the liver tissue of rats in each group（×400，bar＝100 μm）

表4 二十五味松石丸對大鼠肝組織中CD31表達(dá)的IOD的影響( ±s，n＝6)Tab 4 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the average optical density of CD31 expression in lthe iver tissue of rats in each group( ±s，n＝6)

表4 二十五味松石丸對大鼠肝組織中CD31表達(dá)的IOD的影響( ±s，n＝6)Tab 4 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the average optical density of CD31 expression in lthe iver tissue of rats in each group( ±s，n＝6)

注：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別CD31正常組0.60±0.10模型組2.13±0.46**二十五味松石丸低劑量組1.43±0.25#二十五味松石丸中劑量組1.30±0.17##二十五味松石丸高劑量組1.00±0.21##

由圖3及表5可知，α-SMA、TGF-β1和Vimentin蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)上，E-cadherin蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞膜上。正常組大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1和Vimentin蛋白表達(dá)較少，模型組大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1和Vimentin蛋白表達(dá)明顯增多（P＜0.01）；而在正常組大鼠肝組織中E-cadherin蛋白表達(dá)量多，模型組大鼠肝組織中E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）。與模型組相比，二十五味松石丸各劑量組大鼠肝組織能明顯降低α-SMA、TGF-β1和Vimentin蛋白表達(dá)（P＜0.01）；與模型組相比，二十五味松石丸各劑量組均顯著增加E-cadherin蛋白表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01）。

圖3 二十五味松石丸對大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)比較（×400，bar＝100 μm）Fig 3 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the α-SMA，TGF-β1，E-cadherin and Vimentin protein expression in the liver tissue of rats in each group（×400，bar＝100 μm）

表5 二十五味松石丸對大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin表達(dá)的IOD的影響( ±s，n＝6)Tab 5 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the the average optical density of α-SMA，TGF-β1，E-cadherin，and Vimentin in the liver tissue of each group ( ±s，n＝6)

表5 二十五味松石丸對大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin表達(dá)的IOD的影響( ±s，n＝6)Tab 5 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the the average optical density of α-SMA，TGF-β1，E-cadherin，and Vimentin in the liver tissue of each group ( ±s，n＝6)

注：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別α-SMATGF-β1E-cadherinVimentin正常組0.37±0.050.61±0.011.30±0.080.54±0.04模型組1.19±0.12**1.84±0.10**0.68±0.05**2.03±0.09**二十五味松石丸低劑量組0.83±0.04##1.51±0.06##0.70±0.15##1.56±0.15##二十五味松石丸中劑量組0.63±0.05##1.30±0.03##0.90±0.05#1.36±0.14##二十五味松石丸高劑量組0.32±0.12##0.51±0.12##1.34±0.11##0.56±0.13##

2.3.4 免疫印跡法檢測肝組織中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá) 稱取100 mg各組大鼠肝組織，加入RIPA強(qiáng)裂解液裂解蛋白，勻漿儀磨碎組織、靜置冰上繼續(xù)裂解30 min，12 000 r·min－1離心20 min，收集上清液。BCA法測定組織總蛋白濃度，加入5× loading buffer，99℃變性蛋白10 min，冰上冷卻，－20℃保存?zhèn)溆?。上樣量?0 μg，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入β-actin（1∶8000）、α-SMA（1∶500）、TGF-β1（1∶2000）、E-cadherin（1∶10 000）和Vimentin（1∶5000）抗體，4℃過夜。孵育二抗，室溫1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，按說明書等體積配制化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影。Image J分析各泳道蛋白灰度值，然后用目的蛋白的灰度值與β-actin的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

結(jié)果顯示（見圖4及表6），與正常組相比，模型組大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1和Vimentin蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）。二十五味松石丸各劑量組大鼠肝組織中的相關(guān)蛋白均有不同程度的降低或升高，與免疫組化結(jié)果相似。

圖4 二十五味松石丸對大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)比較Fig 4 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the expression of α-SMA，TGF-β1，E-cadherin and Vimentin in the liver tissue of rats in each group

表6 二十五味松石丸對大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響( ±s，n＝3)Tab 6 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the α-SMA，TGF-β1，E-cadherin，and Vimentin protein expression in the liver tissue of rats in each group ( ±s，n＝3)

表6 二十五味松石丸對大鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響( ±s，n＝3)Tab 6 Effect of Ershiwuwei Songshi pill on the α-SMA，TGF-β1，E-cadherin，and Vimentin protein expression in the liver tissue of rats in each group ( ±s，n＝3)

注：與正常組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Compared with the normal group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別α-SMA/β-actinTGF-β1/β-actinE-cadherin/β-actinVimentin/β-actin正常組0.44±0.050.59±0.070.81±0.080.41±0.08模型組1.23±0.25**1.34±0.32**0.31±0.08**1.02±0.18**二十五味松石丸低劑量組0.67±0.02##0.58±0.15##0.64±0.09##0.70±0.07二十五味松石丸中劑量組0.59±0.13##0.53±0.10##0.74±0.06#0.63±0.06#二十五味松石丸高劑量組0.35±0.07##0.42±0.09##0.83±0.08##0.45±0.06##

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以（±s）表示；采用單因素方差分析（one-way ANOVA）中Tukey’s test進(jìn)行多組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝損傷的共同病理階段，其病理特征是ECM的大量沉積。早期肝纖維化是可逆的，但晚期肝纖維化導(dǎo)致的肝硬化是不可逆的，因此，防治肝纖維化對延緩慢性肝病進(jìn)展具有重要意義[15]。全球因慢性肝病死亡人數(shù)高達(dá)200萬，且隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快呈現(xiàn)上升趨勢[16]。藏醫(yī)藥是我國民族醫(yī)藥文化寶庫的重要組成部分，理論體系完善，在治療慢性肝病方面具有獨(dú)特的療效。二十五味松石丸作為藏區(qū)治療肝膽疾病的代表方劑之一，能明顯改善病毒性肝炎患者肝脾腫大和肝功能異常等癥狀[7]。肝纖維化在藏醫(yī)“隆、赤巴、培根”三因理論中屬于“熱性”肝病的范疇[17]，二十五味松石丸方中涉及5種“藥味”：綠絨蒿、訶子、檀香等11種屬于“澀”味藥；牛黃、鴨嘴花、傘形虎耳草等7種屬于“苦”味藥；西紅花、石灰華、五靈脂屬于“甘”味藥；丁香、天竺黃、肉豆蔻屬于“辛”味藥；余甘子屬于“酸”味藥[18]。藏醫(yī)經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》中記載，“澀”“苦”“甘”味在臨床上主要治療“赤巴”為主的熱性病。此外，二十五味松石丸配伍被認(rèn)為是“西紅花-牛黃”為代表的“清熱藥”，具有清熱解毒的功效，符合藏醫(yī)治療肝病的基本原則[12]。TNF-α等炎癥細(xì)胞因子水平影響慢性肝病的進(jìn)展，對肝纖維化患者病情的減輕具有診斷價值[19]。本研究成功構(gòu)建了肝纖維化大鼠模型并同時給予二十五味松石丸灌胃治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，二十五味松石丸組大鼠的肝臟病理學(xué)狀態(tài)明顯改善，肝功能（AST和ALT）、肝纖維化指標(biāo)（HA和LN）和TNF-α水平明顯降低。前期研究顯示，與復(fù)方鱉甲軟肝片相比，該方防治效果最佳，與文獻(xiàn)類似[12]，但其發(fā)揮作用的機(jī)制尚不清楚，因此本文重點(diǎn)采用3種不同劑量的藥物進(jìn)行研究。

有證據(jù)證明，CD31與血管生成成正相關(guān)，并在血管生物學(xué)中發(fā)揮多種作用[20]。一般肝竇內(nèi)皮細(xì)胞少量表達(dá)CD31，當(dāng)肝臟受損發(fā)生肝纖維化時，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞微環(huán)境改變，發(fā)生“去分化”，高表達(dá)血管內(nèi)皮標(biāo)志物CD31蛋白[21]。以往研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成是肝纖維化一個關(guān)鍵特征，因此，抗血管生成治療可能是治療肝纖維化和門脈高壓癥的一種策略[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組肝纖維化大鼠肝組織高表達(dá)CD31蛋白，而二十五味松石丸干預(yù)組CD31蛋白有不同程度的降低，表明二十五味松石丸可能通過抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞血管生成來發(fā)揮抗纖維化作用。

肝纖維化發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞的激活，以α-SMA大量表達(dá)為標(biāo)志，肝星狀細(xì)胞的激活可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。E-cadherin是上皮細(xì)胞正常發(fā)揮功能的標(biāo)志物，N-cadherin、Vimentin等是間質(zhì)細(xì)胞的重要特征[23]。EMT是上皮細(xì)胞（肝細(xì)胞等）失去功能向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，具體表現(xiàn)為上皮細(xì)胞的標(biāo)志物E-cadherin的丟失，高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如：N-cadherin、Vimentin等。此外，在眾多細(xì)胞因子中，TGF-β1是肝纖維化中刺激肝星狀細(xì)胞激活和誘導(dǎo)EMT發(fā)生的關(guān)鍵分子[24-25]。研究表明，抑制EMT的發(fā)生可在一定程度上延緩肝纖維化、甚至肝硬化的進(jìn)展[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肝組織中TGF-β1、α-SMA、Vimentin蛋白表達(dá)增多，而E-cadherin蛋白表達(dá)降低；而二十五味松石丸干預(yù)后TGF-β1、α-SMA、Vimentin蛋白表達(dá)降低，E-cadherin蛋白表達(dá)升高，表明二十味松石丸可能通過影響TGF-β分子信號從而抑制EMT發(fā)生。

綜上所述，二十五味松石丸能夠有效改善四氯化碳-酒精誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，其機(jī)制可能與抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞血管生成和EMT有關(guān)。本研究可為該方在臨床治療肝纖維化方面提供新的理論依據(jù)。