假單胞菌Pseudomonas promysalinigenes RW10S1次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

陳滸良，韓立峰，王羅醫(yī)（.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院 組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 3067；2.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 中國(guó)科學(xué)院微生物生理與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 000）

假單胞菌（Pseudomonas）是一類廣泛存在于土壤、水、動(dòng)植物及人體中的革蘭氏陰性細(xì)菌[1]，可產(chǎn)生多種的次級(jí)代謝產(chǎn)物[2]，如莫匹羅星（mupirocin）[3-4]、硝吡咯菌素（pyrrolnitrin）[5]、藤黃綠菌素（pyoluteorin）[6]、safracins[7]等，在醫(yī)藥研發(fā)、生物防治和工業(yè)微生物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。

Pseudomonas promysalinigenes（原名Pseudomonas putida）RW10S1于1990年分離自斯里蘭卡的水稻根際[8]，2011年Li等[9]報(bào)道了該假單胞菌中次級(jí)代謝產(chǎn)物promysalin的化學(xué)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖1）、抗菌活性及其生物合成途徑。該化合物由脯氨酸（proline）、十四酸（myristic acid）及水楊酸（salicylic acid）3個(gè)結(jié)構(gòu)單元組成，其名稱promysalin即由此而來(lái)。Promysalin可選擇性抑制多重耐藥的銅綠假單胞菌生長(zhǎng)，是具有重要開(kāi)發(fā)價(jià)值的抗菌先導(dǎo)化合物[10-15]。然而，該化合物在酸性條件下不穩(wěn)定，可發(fā)生分子內(nèi)重排得到化合物1a（見(jiàn)圖1）而喪失活性[15]，限制了其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

圖1 Promysalin的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其重排產(chǎn)物Fig 1 Structures of promysalin and its rearrangement products

微生物培養(yǎng)基作為微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的重要一環(huán)，其成分含量的不同，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的結(jié)果具有重要影響，有研究通過(guò)探究菌種培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件，成功提升了次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量與豐富度[16-18]。為進(jìn)一步挖掘假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1來(lái)源的天然產(chǎn)物，本研究對(duì)該菌株發(fā)酵條件進(jìn)行改變和優(yōu)化，從其LB培養(yǎng)基發(fā)酵液的乙酸乙酯萃取部位分離鑒定了3個(gè)化合物（見(jiàn)圖2），其中2個(gè)為新的promysalin結(jié)構(gòu)類似物（見(jiàn)圖3），由煙酸（nicotinic acid）取代了promysalin中的水楊酸部分，穩(wěn)定性優(yōu)于promysalin。本文不僅探究了不同培養(yǎng)條件對(duì)假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1發(fā)酵產(chǎn)物的影響，也對(duì)該菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分進(jìn)行了研究。

圖2 假單胞菌Pseudomonas promysalinigenes RW10S1在不同發(fā)酵條件下的HPLC圖Fig 2 HPLC chromatogram of Pseudomonas promysalinigenes RW10S1 under different fermentation conditions

圖3 化合物2和3的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 3 Structures of compounds 2 and 3

1 材料

Bruker Avance Ⅲ-600核磁共振波譜儀（德國(guó)Bruker公司）；Q-Exactive Orbitrap MS高分辨質(zhì)譜質(zhì)譜、Nicolet IS5紅外光譜儀（美國(guó)Thermo公司）；Chirascan圓二色光譜儀（英國(guó)應(yīng)用光物理公司）；Anton Paar MCP 200高精度智能旋光儀（奧地利Anton Paar公司）；LC-20A分析型高效液相色譜儀（日本SHIMADZU公司）；Waters 2695半制備型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；綠百草色譜柱GH0525046C18AQ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；綠百草色譜柱GH0525010C18AQ（250 mm×10 mm，5 μm）；SBC MCI GEL 反相色譜填料 F型50～70 μm（成都科譜生物有限公司）；MQD-S3R振蕩器（上海旻泉儀器有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；AIRTECH超凈臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；色譜級(jí)乙腈（美國(guó)Thermo公司）；分析級(jí)甲醇、乙酸乙酯（天津康科德公司）；LB培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)公司）；葡萄糖（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

實(shí)驗(yàn)菌株假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1由比利時(shí)魯汶大學(xué)René De Mot教授提供，現(xiàn)保存于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

2 菌株的發(fā)酵、萃取及其代謝產(chǎn)物的分離

將生長(zhǎng)在LB瓊脂培養(yǎng)基上的假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1單克隆接種到LB培養(yǎng)基中，30℃、200 r·min－1在搖床中培養(yǎng)1 d作為種子液備用。然后以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入含4%葡萄糖的LB發(fā)酵培養(yǎng)基中（5個(gè)2000 mL三角瓶分別裝有500 mL培養(yǎng)基），22℃、200 r·min－1振蕩培養(yǎng)2 d。

發(fā)酵液用等量乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮干燥，得到浸膏1.1 g。浸膏經(jīng)SBC MCI GEL柱色譜用甲醇-水（56∶44、92∶8、100∶0）梯度洗脫得到3個(gè)組分（Fr.1～Fr.3），采用HPLC法檢測(cè)分析，組分Fr.2含主要目標(biāo)成分，經(jīng)半制備高效液相色譜分離，乙腈-水梯度洗脫（體積比45∶55→ 50∶50，40 min程序）分別得到化合物1（tR＝29.5 min，2.6 mg）、化合物2（tR＝16.0 min，2.6 mg）、化合物3（tR＝22.0 min，2.4 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無(wú)色黏稠固體，易溶于甲醇。[α]－15.55（c0.09，MeOH）；UV（MeOH）λmax（logε）：282.4（0.038）nm；IR（KBr）vmax3342，2929，2857，1738，1669，1614，1197，757 cm－1；CD（c0.18，MeOH）λ（Δε）：208.0（－20.42）。HR-ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰m/z475.2792 [M＋H]＋（C26H39N2O6，計(jì)算值為475.2802），結(jié)合NMR數(shù)據(jù)，推測(cè)分子式為C26H38N2O6。1H-NMR（600 MHz，chloroform-d）δH9.53（1H，s，-OH）為低場(chǎng)區(qū)羥基信號(hào)；δH7.41～7.34（2H，m，H-26，24）、6.99（1H，d，J＝8.2 Hz，H-23）、6.91（1H，t，J＝7.5 Hz，H-25）為芳香氫質(zhì)子信號(hào)；δH6.64（1H，s，-NH）、5.46（1H，s，-NH）為一組氨基氫信號(hào)；6.72（1H，br s，H-19）、5.29（1H，dd，J＝4.5，2.4 Hz，H-18）為一組烯烴氫信號(hào)；δH5.02（1H，m，H-16）為脯氨酸酮基的α氫信號(hào)；δH5.00（1H，m，H-8）為一個(gè)與脯氨酸末端氧相連的次甲基氫信號(hào)；δH4.10（1H，d，J＝7.6 Hz，H-2）為一個(gè)與乙酰氨基相連的亞甲基氫信號(hào)；δH3.15（1H，m，H-17）、2.70（1H，d，J＝17.1 Hz，H-17'）、1.80（1H，m，H-3）、1.65（1H，m，H-3'）、1.59（4H，m，H-7，9）、1.44（4H，m，H-4，6，10）、1.28（10H，m，H-5，6'，10'，11，12，13）為一組亞甲基氫信號(hào)；δH0.87（3H，t，J＝7.0 Hz，H-14）為甲基氫信號(hào)；13C-NMR（150 MHz，chloroform-d）δC：177.2（C-1）、171.3（C-15）、166.5（C-20）、157.6（C-22）、133.4（C-24）、130.9（C-19）、119.4（C-25）、118.8（C-23）、118.0（C-21）、111.0（C-18）、76.0（C-8）、71.4（C-2）、59.3（C-16）、34.5（C-9）、34.3（C-7）、33.4（C-17）、34.1（C-3）、31.8（C-12）、29.9（C-11）、28.4（C-5）、25.5（C-10）、24.9（C-6）、24.6（C-4）、22.7（C-13）、14.2（C-14）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的promysalin的數(shù)據(jù)基本一致[9-10]。

化合物2：無(wú)色黏稠固體，易溶于甲醇。[α]－21.21（c0.06，MeOH）；UV（MeOH）λmax（logε）：254.2（0.021）nm；IR（KBr）vmax3342，2929，2857，1738，1667，1619，1468，1433，1408，1197 cm－1；CD（c0.13，MeOH）λ（Δε）：208.0（－11.50），228.0（－5.02）。HRESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰m/z460.2798 [M＋H]＋（C25H38N3O5，計(jì)算值為460.2806），結(jié)合1H-NMR與13C-NMR數(shù)據(jù)（見(jiàn)表1），可推定其分子式為C25H37N3O5。比較化合物2與promysalin（1）的核磁數(shù)據(jù)可知，化合物2中含有與化合物1中同樣的脯氨酸及2-羥基十四酰胺結(jié)構(gòu)單元，兩者的主要差別在于芳香區(qū)域的信號(hào)，表現(xiàn)為化合物2中芳香區(qū)域信號(hào)進(jìn)一步向低場(chǎng)位移δH8.79（1H，d，J＝1.7 Hz，H-22）、8.72（1H，dd，J＝5.0，1.6 Hz，H-23）、7.89（1H，dt，J＝7.9，2.0 Hz，H-25）、7.40（1H，m，H-24）；在化合物2的13C-NMR譜中，碳原子的信號(hào)也由26個(gè)變?yōu)?5個(gè)，除芳香區(qū)碳信號(hào)發(fā)生變化外，其他碳信號(hào)與化合物1基本一致。結(jié)合化合物的分子式可知，該結(jié)構(gòu)單元含有一個(gè)額外氮原子，通過(guò)進(jìn)一步對(duì)化合物2的1H-1H-COSY、HSQC和HMBC譜相關(guān)信號(hào)進(jìn)行分析（見(jiàn)圖4），可確定該結(jié)構(gòu)單元為煙酸；同時(shí)，該煙酸基團(tuán)與文獻(xiàn)中化合物pyridin-3-yl（pyrrolidin-1-yl）methanone的煙酸基團(tuán)核磁數(shù)據(jù)基本一致[19]。Promysalin的手性區(qū)域存在于C-2、C-8、C-16位置，其構(gòu)型已有化學(xué)全合成研究進(jìn)行確認(rèn)[10]，在化合物2中δH5.02（1H，dd，J＝11.6，5.6 Hz，H-16）、5.02（1H，m，H-8）、4.10（1H，m，H-2）；δC58.7（C-16）、75.6（C-8）、70.9（C-2）手性碳區(qū)域核磁數(shù)據(jù)與promysalin的數(shù)據(jù)基本一致。圓二色譜（CD）測(cè)定結(jié)果（見(jiàn)圖5）顯示，promysalin與promynicotin在210 nm波長(zhǎng)處均表現(xiàn)為負(fù)的Cotton效應(yīng)，且峰形接近。通過(guò)對(duì)化合物1和化合物2的比旋光度、波譜和CD數(shù)據(jù)結(jié)果分析，推測(cè)化合物2手性中心的構(gòu)型與promysalin一致，即C-16為S構(gòu)型，C-2、C-8為R構(gòu)型。同時(shí)，生物合成的代謝產(chǎn)物立體選擇性較高，產(chǎn)物的構(gòu)型會(huì)相對(duì)保持一致，也能為化合物2的構(gòu)型維持提供一定參考。綜合以上分析，最終確定化合物2的結(jié)構(gòu)，并命名為promynicotin。

表1 化合物2和3的1H-NMR (600 MHz)和13C-NMR (150 MHz)數(shù)據(jù)(in CDCl3)Tab 1 1H-NMR (600 MHz) and 13C-NMR (150 MHz) data of compounds 2 and 3 in CDCl3

圖4 化合物2和3關(guān)鍵二維相關(guān)信號(hào)1 H-1 H-COSY（紅色線條）和HMBC（藍(lán)色箭頭）Fig 4 Key 1 H-1 H-COSY（red lines）and HMBC（blue arrows）correlations of compounds 2 and 3

圖5 化合物1～3在甲醇中的CD譜Fig 5 CD spectra of compounds 1～3 in methanol

化合物3：無(wú)色黏稠固體，易溶于甲醇。[α]－33.99（c0.1，MeOH）；UV（MeOH）λmax（logε）：259.0（0.021）nm；IR（KBr）vmax3342，2929，2857，1737，1668，1632，1434，1407，1190 cm－1；CD（c0.13，MeOH）λ（Δε）：205.0（－2.06），232.0（－9.25），270.0（－3.89）。HRESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰m/z446.3004 [M＋H]＋（C25H40N3O4，計(jì)算值為446.3013），結(jié)合1H-NMR與13C-NMR數(shù)據(jù)（見(jiàn)表1），可推定其分子式為C25H39N3O4。化合物3與化合物2相比，少了一個(gè)羥基信號(hào)，化學(xué)位移向高場(chǎng)移動(dòng)δH2.20（2H，t，J＝7.7 Hz，H-2），另外18位和19位雙鍵信號(hào)消失，在高場(chǎng)區(qū)顯示信號(hào)為δH2.04（1H，m，H-18），1.93（1H，m，H-18'）、3.67（1H，q，J＝8.3，7.4 Hz，H-19），3.54（1H，q，J＝9.5，7.7 Hz，H-19'），δC50.1（C-19）和25.2（C-18）特征烯碳信號(hào)也相應(yīng)消失，其他位置信號(hào)與化合物2基本一致?；衔?的手性區(qū)域?yàn)镃-8、C-16位置，該手性碳區(qū)域核磁數(shù)據(jù)與化合物2的數(shù)據(jù)基本一致，由于C-2位置少了羥基的一個(gè)手性中心，與化合物2相比，CD譜呈現(xiàn)的吸收峰發(fā)生紅移，但總體峰形基本一致（見(jiàn)圖5），因此，其構(gòu)型同化合物2，即C-8為R構(gòu)型，C-16為S構(gòu)型。通過(guò)對(duì)化合物3的比旋光度、波譜和CD數(shù)據(jù)分析，最終確定了結(jié)構(gòu)，并命名為dihydrodeoxypromynicotin。

4 討論

前期研究?jī)H對(duì)假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1在TSA或TSB培養(yǎng)基中進(jìn)行了發(fā)酵和代謝產(chǎn)物研究，在此條件下只獲得了化合物promysalin[9]。本研究通過(guò)對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基的改變和優(yōu)化，在LB培養(yǎng)基中加入4%葡萄糖，22℃、200 r·min－1振蕩培養(yǎng)，提升了假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1代謝產(chǎn)物的豐富度，并從中分離鑒定了2個(gè)新的、結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定的promysalin類似物（化合物2和3），其獲得可能與LB培養(yǎng)基中酵母提取物含有的煙酸成分有關(guān)[20]，該成分的加入為菌株發(fā)酵提供不同底物，進(jìn)而豐富了該菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的類型。另外，由于培養(yǎng)溫度的降低，菌種的生長(zhǎng)速度和酶的催化效率也相應(yīng)下降，通過(guò)檢測(cè)能發(fā)現(xiàn)中間代謝產(chǎn)物，化合物3即為中間代謝產(chǎn)物?？傊狙芯控S富了假單胞菌屬次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分多樣性，也為假單胞菌Pseudomonas promysalinigenesRW10S1次級(jí)代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用提供更多研究基礎(chǔ)。后期將通過(guò)前體喂養(yǎng)、組合生物合成等方法獲得更多的promysalin結(jié)構(gòu)類似物，并對(duì)這些衍生物進(jìn)行生物活性測(cè)試。