MIR1基因影響白念珠菌對(duì)唑類藥物的敏感性

邢信昊，王欣榮，陳莉，仲華，韓蕾，王彥，3*（. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系，上海 00433；. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350；3. 軍事藥學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 00433）

白念珠菌是最常見的病原真菌之一，可引起皮膚感染、黏膜感染甚至危及生命的系統(tǒng)性感染。對(duì)膿毒癥、器官移植、惡性腫瘤等免疫功能低下的患者來(lái)說，白念珠菌引起的系統(tǒng)性感染尤為兇險(xiǎn)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，念珠菌血癥患者的歸因死亡率高達(dá)10%至47%[1-2]。

唑類藥物是現(xiàn)今臨床上常用的抗真菌藥物，然而其耐藥性問題日益凸顯，嚴(yán)重困擾了抗真菌治療的有效實(shí)施。目前臨床上多采用優(yōu)化劑量和多藥聯(lián)合療法應(yīng)對(duì)耐藥性問題，但存在毒性大、效率低、價(jià)格高等缺點(diǎn)[3]。研究白念珠菌的藥物敏感性相關(guān)基因，開發(fā)抗真菌新藥并解決耐藥性問題具有重要的臨床意義。

真菌耐藥的機(jī)制包括藥物外排功能增強(qiáng)、藥物攝入減少、生物被膜形成、靶蛋白動(dòng)態(tài)變化以及藥物代謝相關(guān)通路改變等，而白念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥的最主要機(jī)制是藥物外排能力的增強(qiáng)，尤其是能量依賴的藥物外排[3-5]。線粒體是能量代謝的核心細(xì)胞器，眾多研究表明，線粒體功能影響白念珠菌的藥物敏感性。例如，白念珠菌氧化磷酸化解偶聯(lián)突變體對(duì)氟康唑和伏立康唑的敏感性顯著降低[6]，線粒體復(fù)合體Ⅰ活性必需基因GOA1或其亞基編碼基因NDH51的缺失都會(huì)使白念珠菌對(duì)唑類藥物的敏感性顯著提高[7]，線粒體生物發(fā)生必需基因FZO1缺失使唑類藥物耐受性顯著降低[8]?？梢姡€粒體能量代謝是白念珠菌對(duì)唑類藥物的敏感性的關(guān)鍵影響因素。

前期有研究報(bào)道，小分子化合物ML316通過選擇性抑制線粒體磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Mir1發(fā)揮抗真菌作用，并在釀酒酵母中研究了其可能的機(jī)制[9]。我們推測(cè)，線粒體磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能影響線粒體有氧呼吸進(jìn)而影響能量代謝，成為新的白念珠菌抗真菌藥物靶點(diǎn)。然而，其編碼基因MIR1在白念珠菌藥物敏感性中的作用還缺乏系統(tǒng)研究。課題組前期研究了白念珠菌MIR1基因的功能，然而是基于傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記型敲除篩選策略[10]，對(duì)表型研究有一定干擾[11-12]。本研究聚焦MIR1基因?qū)Π啄钪榫鷮?duì)唑類藥物敏感性的影響，利用SAT1 flipper法對(duì)白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行敲除和重組，并探索MIR1基因在其中的作用機(jī)制。

1 材料

野生型白念珠菌SC5314（wild-typeCandida albicans，WT，由美國(guó)喬治敦大學(xué)William A Fonzi教授饋贈(zèng)）；SanPrep柱式質(zhì)粒抽提試劑盒（上海生工生物），SacⅠ內(nèi)切酶、XhoⅠ內(nèi)切酶、ApaⅠ內(nèi)切酶、SacⅡ內(nèi)切酶（New England Biolabs），酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、諾爾斯菌素（上海懋康生物），Ex Taq DNA聚合酶（TaKaRa），羅丹明6G（Sigma-Aldrich），JC-1膜電位檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物），ATP檢測(cè)試劑盒BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay（Promega），三磷酸腺苷（ATP）溶液（北京索萊寶）；蛋白胨、酵母浸膏、營(yíng)養(yǎng)肉湯（美國(guó)BD公司）；糖類、抗菌藥物、緩沖液、培養(yǎng)基、引物、DNA Marker等其他基礎(chǔ)試劑購(gòu)自上海生工生物。

2 方法

2.1 菌株培養(yǎng)

挑取凍存菌株，在YPD液體培養(yǎng)基中活化，30℃、200 r·min－1振蕩培養(yǎng)24 h后，吸取10 μL于新的1 mL YPD液體培養(yǎng)基中，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)16 h。取該菌液后接種于沙氏葡萄糖瓊脂（SDA）培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)靜置培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)時(shí)挑取單克隆菌落置于YPD液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)16 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 MIR敲除菌（mir1Δ/Δ）和回復(fù)菌（mir1Δ/MIR1）的構(gòu)建與鑒定

用引物MIR1-up-FWD和MIR1-up-RV擴(kuò)增MIR1基因5'-端的一個(gè)0.661 kb片段，經(jīng)ApaⅠ和XhoⅠ雙酶切后，克隆到pSFS2載體中MAL2p-CaFLP-CaSAT1盒的上游，得到質(zhì)粒pSFS2-MIR1up；同理，用引物MIR1-down-FWD和MIR1-down-RV擴(kuò)增MIR1基因3'-端的一個(gè)0.504 kb片段，經(jīng)SacⅡ和SacⅠ雙酶切后，克隆到pSFS2載體中MAL2p-CaFLP-CaSAT1盒的下游，得到質(zhì)粒pSFS2-MIR1updwn。用ApaⅠ和SacⅠ兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)其進(jìn)行雙酶切，酶切后的片段用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化進(jìn)白念珠菌SC5314，然后此片段會(huì)以同源重組的方式替換掉目的基因的一個(gè)等位基因。使用多個(gè)引物通過菌落PCR鑒定出對(duì)諾爾絲菌素表現(xiàn)出抗性的轉(zhuǎn)化子，將正確的轉(zhuǎn)化子刪除諾爾絲菌素抗性標(biāo)記CaSAT1后即可得到目的基因的單等位基因敲除菌。經(jīng)過兩次重組和刪除，即可得到雙等位基因敲除菌mir1Δ/Δ。

為了將MIR1基因重新整合到mir1Δ/Δ中，用引物MIR1-FWD和MIR1-RV擴(kuò)增一個(gè)2.30 kb的片段，其中包含完整的開放閱讀框，以及MIR1等位基因上游0.661 kb和下游0.504 kb的序列，用ApaⅠ和XhoⅠ雙酶切。以該酶切片段替換pSFS2-MIR1updwn中MIR1基因序列的5'-端，生成質(zhì)粒pSFS2-MIR1Rec。pSFS2-MIR1Rec質(zhì)粒用ApaⅠ和SacⅠ酶切，用該酶切片段轉(zhuǎn)化mir1Δ/Δ。由此獲得了具有諾爾斯菌素抗性的菌株，再經(jīng)刪除諾爾絲菌素抗性標(biāo)記CaSAT1后，即得回復(fù)菌mir1Δ/MIR1，以供進(jìn)一步研究。菌株構(gòu)建和鑒定所用引物如表1所示，PCR鑒定的引物設(shè)計(jì)原理如圖1所示，預(yù)測(cè)結(jié)果如表2所示。

圖1 用于PCR鑒定的引物設(shè)計(jì)示意圖Fig 1 Schematic diagram of primer design in PCR identification

表1 菌株構(gòu)建和鑒定所用引物Tab 1 Primers for strain construction and identification

表2 所構(gòu)建菌株的PCR鑒定預(yù)測(cè)結(jié)果(kb)Tab 2 Predicted results of PCR identification of the constructed strains (kb)

2.3 斑點(diǎn)法（spot assay）檢測(cè)藥物敏感性

取活化的野生型白念珠菌，敲除菌mir1Δ/Δ，回復(fù)菌mir1Δ/MIR1，用PBS洗滌后，調(diào)整野生型和回復(fù)菌菌液濃度為2×106個(gè)·mL－1，再倍比稀釋為2×105、2×104、2×103、2×102個(gè)·mL－1，敲除菌濃度分別為野生型的2倍。各濃度菌液分別取5 μL點(diǎn)于含不同抗真菌藥物[氟康唑（Fluconazole）、酮康唑（Ketoconazole）、伊曲康唑（Itraconazole）、咪康唑（Miconazole）和伏立康唑（Voriconazole）等5種唑類藥物，以及布雷非德菌素A（Brefeldin A）、特比萘芬（Terbinafine）、卡泊芬凈（Caspofungin）、氟胞嘧啶（Flucytosine）和兩性霉素（Amphotericin）等其他藥物]的YPD平板上，自然晾干。于30℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察并拍照。

結(jié)果顯示，在YPD培養(yǎng)平板以及含有特比萘芬、卡泊芬凈、氟胞嘧啶和兩性霉素的培養(yǎng)平板上，mir1Δ/Δ敲除菌的菌落生長(zhǎng)情況與野生型或回復(fù)菌沒有顯著差異；而在含有5種唑類藥物和布雷非德菌素A的平板上，與野生型或回復(fù)菌相比，mir1Δ/Δ敲除菌的菌落生長(zhǎng)明顯較少（見圖2）。該結(jié)果表明，MIR1基因敲除使白念珠菌對(duì)唑類藥物的敏感性顯著提高。

圖2 MIR1敲除菌、回復(fù)菌與野生型白念珠菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性Fig 2 Sensitivity of MIR1 knockout，revertant and wild-type Candida albicans to antifungal drugs

2.4 藥物外排能力檢測(cè)

將上述菌株在YPD中振蕩培養(yǎng)16 h，PBS洗滌后，調(diào)整菌液濃度5×107個(gè)·mL－1。用PBS重懸細(xì)胞并振蕩培養(yǎng)2 h，耗竭能量。加入羅丹明使其終濃度為10 μmol·L－1，30℃、200 r·min－1振蕩培養(yǎng)60 min。菌液離心，PBS洗滌后，計(jì)數(shù)并調(diào)整菌液濃度為5×107個(gè)·mL－1。加入葡萄糖使其終濃度為20 mmol·L－1，提供供能底物，取1 mL在30℃下、200 r·min－1振蕩培養(yǎng)2 h。3000 r·min－1離心菌液5 min，取100 μL上清液，檢測(cè)527 nm處的OD值。

結(jié)果顯示，在30℃培養(yǎng)環(huán)境下，與野生型相比，mir1Δ/Δ敲除菌泵出的羅丹明6G顯著較低（P＜0.05，見圖3）。該結(jié)果表明，MIR1基因敲除使白念珠菌的藥物外排能力缺陷。

圖3 MIR1敲除菌、回復(fù)菌與野生型白念珠菌對(duì)羅丹明6G的外排能力Fig 3 Efflux of Rhodamine 6G by MIR1 knockout，revertant and wildtype Candida albicans

2.5 線粒體膜電位檢測(cè)

活化的菌株經(jīng)200 r·min－1振蕩培養(yǎng)16 h，收集細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，使用YPD培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在30℃下振蕩培養(yǎng)30 min。收集細(xì)胞并洗滌，然后用PBS調(diào)節(jié)菌液濃度至5×106個(gè)·mL－1。將0.5 mL菌液與等體積的JC-1染色工作液混合，陽(yáng)性對(duì)照組使用線粒體電子傳遞鏈抑制劑CCCP（終濃度為10 μmol·L－1），37℃避光孵育20 min。使用JC-1染色緩沖液洗滌3次，重懸至100 μL。使用多功能酶標(biāo)儀在490 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，檢測(cè)并計(jì)算紅色/綠色熒光強(qiáng)度比（590 nm/530 nm）。

結(jié)果顯示，與野生型相比，mir1Δ/Δ敲除菌的紅綠熒光強(qiáng)度之比有降低趨勢(shì)（見圖4A），表明MIR1基因敲除使白念珠菌的線粒體膜電位有降低趨勢(shì)。

圖4 MIR1敲除菌、回復(fù)菌與野生型白念珠菌的線粒體膜電位（A）和ATP生成能力（B）Fig 4 Mitochondrial membrane potential（A）and ATP production（B）in MIR1 knockout，revertant and wild-type Candida albicans

2.6 ATP生成檢測(cè)

活化的菌株經(jīng)200 r·min－1振蕩培養(yǎng)16 h，收集細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，用YPD培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度至1×106個(gè)·mL－1，在30℃下振蕩培養(yǎng)30 min。取50 μL菌液與等體積BacTiter-Glo Reagent，在96孔板中混勻，孵育10 min后，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光信號(hào)強(qiáng)度。按說明書制備ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ATP含量。

結(jié)果顯示，mir1Δ/Δ敲除菌與野生型相比ATP濃度顯著降低（P＜0.01，見圖4B），表明MIR1基因敲除使白念珠菌的ATP生成能力缺陷。

3 討論

本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)MIR1基因的缺失顯著提高了白念珠菌的唑類藥物敏感性，而對(duì)特比萘芬、卡泊芬凈、氟胞嘧啶和兩性霉素等其他抗真菌藥物的敏感性沒有顯著改變，表現(xiàn)出一定的特異性。通過羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MIR1敲除使白念珠菌對(duì)唑類藥物敏感性的提高可能與藥物外排能力缺陷有關(guān)，MIR1敲除引起的線粒體膜電位降低和ATP生成能力缺陷可能是其作用機(jī)制。

與其他抗真菌藥物耐藥機(jī)制不同，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白依賴的藥物外排作用是白念珠菌對(duì)唑類藥物耐藥性的主要機(jī)制，特異性阻斷ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是逆轉(zhuǎn)唑類藥物耐藥性的一種可行手段，小分子抑制劑FK506、普羅帕酮以及米爾貝霉素等均可以提高對(duì)唑類藥物的敏感性[13-14]。由于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的發(fā)揮依賴于ATP，因此線粒體ATP生成障礙會(huì)抑制其轉(zhuǎn)運(yùn)功能，進(jìn)而提高白念珠菌對(duì)唑類藥物敏感性。例如，白念珠菌線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ的功能變化，可能會(huì)改變線粒體有氧呼吸及ATP生成，影響藥物外排活性，從而改變對(duì)唑類藥物的敏感性[7，15]。琥珀酸脫氫酶編碼基因SDH2缺失也會(huì)導(dǎo)致白念珠菌藥物外排能力下降，唑類藥物敏感性提高[16]?？梢?，線粒體相關(guān)基因是研究白念珠菌唑類耐藥性機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)手段的重要方向。

MIR1基因編碼線粒體磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其缺失會(huì)導(dǎo)致向線粒體基質(zhì)的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)障礙[17]。在線粒體基質(zhì)中，二磷酸腺苷（ADP）和無(wú)機(jī)磷酸鹽在ATP合酶的催化下生成ATP，無(wú)機(jī)磷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙會(huì)引起ATP合成受阻[9]，這可能是本研究中MIR1敲除提高白念珠菌對(duì)唑類藥物敏感性的主要機(jī)制。此外，線粒體功能障礙也可能通過減少藥物外排泵表達(dá)或提高活性氧（ROS）累積來(lái)提高抗真菌藥物敏感性，未來(lái)值得通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索。

課題組前期在白念珠菌MIR1基因功能的研究中，考察了MIR1基因和白念珠菌耐藥性的相關(guān)性[10]，但是存在缺陷：在構(gòu)建MIR1基因敲除菌時(shí)采用了營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記篩選策略，親本菌是URA3基因缺陷的白念珠菌CAI4株，不能在缺乏尿苷或尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這種代謝相關(guān)基因的缺陷會(huì)對(duì)白念珠菌的表型產(chǎn)生影響，繼而對(duì)表型研究造成干擾[11]。在本研究中，我們以SC5314標(biāo)準(zhǔn)株為親本菌，采用了更加先進(jìn)的SAT1 flipper技術(shù)進(jìn)行敲除菌的構(gòu)建，得到了更加可信的結(jié)果和結(jié)論。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MIR1基因缺失會(huì)導(dǎo)致白念珠菌對(duì)唑類藥物敏感性提高；MIR1基因缺失后，白念珠菌的藥物外排能力缺陷，可能是MIR1敲除對(duì)線粒體膜電位降低和ATP生成能力缺陷所導(dǎo)致的?？梢?，MIR1基因?qū)Π啄钪榫哪芰抗?yīng)和藥物敏感性至關(guān)重要，Mir1蛋白特異性抑制劑有望開發(fā)為與唑類藥物協(xié)同的新型抗真菌藥物，以MIR1為靶點(diǎn)開發(fā)抗真菌藥物可能具有較好的應(yīng)用前景。