西藏自治區(qū)入侵植物曼陀羅葉綠體基因組通用引物篩選

陳永豪

摘 要 近年來，曼陀羅在我國呈迅速蔓延之勢，已被劃分為入侵植物。入侵植物會壓制或排擠本地物種，破壞當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)多樣性。研究入侵植物的葉綠體基因組遺傳多樣性對了解入侵植物的入侵機制具有重要意義，而利用葉綠體基因組通用引物對葉綠體基因組進(jìn)行擴增是研究葉綠體基因組遺傳多樣性的有效方法。為加強曼陀羅葉綠體基因組的遺傳多樣性、單倍型分析及譜系地理學(xué)等研究，利用查找相關(guān)文獻(xiàn)得到的15對葉綠體基因組通用引物對曼陀羅葉綠體基因組非編碼區(qū)片段進(jìn)行擴增，共篩選出7對葉綠體基因組通用引物可以用于曼陀羅葉綠體基因組非編碼區(qū)片段的擴增和后續(xù)的測序工作。

關(guān)鍵詞 入侵植物；曼陀羅；葉綠體基因組；通用引物；西藏自治區(qū)

中圖分類號：S567.21 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.02.077

曼陀羅（Datura stramonium Linn.）是茄科曼陀羅屬一年生草本植物，原產(chǎn)于墨西哥，主要分布在溫帶與熱帶地區(qū)，在我國各地區(qū)均有分布[1-2]。曼陀羅常被當(dāng)作觀賞植物栽培，曾作為藥用植物引入我國，但由于長期缺乏規(guī)范性的入侵檢疫等原因，曼陀羅在我國大范圍蔓延與擴散，目前已被劃分為入侵植物[3-6]。曼陀羅具有很強的化感作用，能夠抑制黃瓜、小麥、蘿卜等作物的生長，對棉花、豆類、薯類、蔬菜和玉米等作物有不利影響，易給被入侵地的生物多樣性與生態(tài)環(huán)境帶來潛在危害。葉綠體是一種廣泛存在于高等植物和一些藻類中的半自主細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行光合作用的主要場所。葉綠體基因組作為直系同源基因，其不易受到旁系同源基因的干擾、在被子植物中遺傳方式為母系遺傳、不易發(fā)生重組、便于組裝的特點使其具有易解析的特性，被廣泛應(yīng)用于植物的系統(tǒng)發(fā)育分析、物種鑒定、葉綠體基因工程、分析演化路徑及遺傳進(jìn)化等研究。目前，有關(guān)曼陀羅的研究主要涉及曼陀羅的傳粉生物學(xué)研究、曼陀羅在重金屬污染下的種群遺傳結(jié)構(gòu)研究、曼陀羅種子萌發(fā)和幼苗生長及關(guān)于曼陀羅作為藥用植物有效成分的提取和活性成分的評價等，關(guān)于分布于西藏自治區(qū)的曼陀羅葉綠體基因組通用引物篩選的相關(guān)研究還未見報道。本文通過查找相關(guān)文獻(xiàn)，得到15對葉綠體基因組通用引物，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對分布于西藏自治區(qū)的曼陀羅葉片DNA進(jìn)行擴增，旨在篩選出能夠用于后續(xù)測序及進(jìn)一步分析曼陀羅葉綠體基因組遺傳多樣性、單倍型、譜系地理、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳分化等研究的葉綠體基因組通用引物，為進(jìn)一步揭示曼陀羅的入侵機制及防控措施的制訂提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 曼陀羅葉片

結(jié)合曼陀羅的生長環(huán)境特點，于2020—2021年夏天在西藏自治區(qū)朗縣、尼木縣、白朗縣、加查縣、南木林縣、波密縣、貢嘎縣、八宿縣、芒康縣、工布江達(dá)縣、察隅縣、仁布縣、林芝市、山南市和拉薩市等地的花壇、垃圾堆、荒地及住宅附近，采集曼陀羅新鮮的嫩葉置于預(yù)先準(zhǔn)備好的分子袋中，并將分子袋迅速放到藍(lán)色變色硅膠中對葉片進(jìn)行快速干燥，并及時更換變質(zhì)為紅色的藍(lán)色硅膠直至葉片完全干燥。

1.1.2 葉綠體基因組通用引物

通過查詢?nèi)~綠體基因組通用引物相關(guān)文獻(xiàn)，選擇其中15對通用引物（見表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 曼陀羅葉片DNA的提取

采用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒DP321進(jìn)行曼陀羅葉片DNA的提取，操作步驟如下。

1）取完全干燥的曼陀羅葉片約20 mg，與鋼珠一起加入2 mL離心管中做好標(biāo)記，放到FastPrep-24中充分研磨。

2）在離心管中加入400 μL緩沖液FP1和6 μL的

RNase A（分解RNA），在渦旋振蕩儀上振蕩1 min，然后在室溫下放置10 min。

3）在離心管中加入130 μL緩沖液FP2，充分混勻后在渦旋振蕩儀上振蕩1 min。

4）將離心管置于高速離心機中，以12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min后，用移液槍吸取200 μL上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中并做好標(biāo)記。

5）向上清液中加入140 μL異丙醇，充分混勻后在高速離心機中以12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心2 min，然后將上清液舍棄，保留沉淀。

6）加入600 μL質(zhì)量濃度為70%的乙醇，在渦旋振蕩儀上振蕩5 s后，在高速離心機中以12 000 r·min-1

的轉(zhuǎn)速離心2 min，舍棄上清液，保留沉淀。

7）重復(fù)操作步驟6。

8）打開離心管的管蓋，在室溫下倒置10 min，徹底晾干乙醇，避免對后續(xù)的PCR反應(yīng)造成影響。

9）加入200 μL洗脫緩沖液TE，在65 ℃水浴鍋中水浴10 min，期間不斷進(jìn)行顛倒混勻，以溶解DNA，最后得到DNA溶液。

1.2.2 DNA質(zhì)量檢測

曼陀羅葉片DNA提取完成后，對DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察條帶清晰度，確定DNA的質(zhì)量是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，將質(zhì)量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的DNA進(jìn)行分裝，用于后續(xù)PCR擴增反應(yīng)的DNA放置于-20 ℃冰箱中保存，其余DNA放置于-80 ℃的冰箱中進(jìn)行保存。

1.2.3 曼陀羅葉綠體基因組通用引物的篩選

在不同退火溫度（55 ℃、52 ℃、50 ℃、48 ℃、45 ℃）下，用15對引物對曼陀羅葉片DNA進(jìn)行PCR擴增，以篩選出曼陀羅葉綠體基因組通用引物。

1）PCR反應(yīng)體系的配制。PCR反應(yīng)體系共計

50 μL，分別為1 μL DNA、2 μL正向引物、2 μL反向引物、25 μL Taq PCR MasterMix、20 μL ddH2O。

2）PCR反應(yīng)程序的設(shè)定。根據(jù)生工生物工程（上海）股份有限公司提供的退火溫度將退火溫度設(shè)置為55 ℃、52 ℃、50 ℃、48 ℃、45 ℃。PCR反應(yīng)程序為：①94 ℃預(yù)變性3 min；②94 ℃變性30 s；③退火溫度下維持30 s；④72 ℃延伸1 min；⑤步驟②～④循環(huán)30次后72 ℃下保存5 min。

3）PCR擴增產(chǎn)物的檢測。吸取5 μL PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將電泳結(jié)果置于凝膠成像分析儀下進(jìn)行拍照記錄，篩選5個退火溫度下出現(xiàn)擴增條帶的通用引物。

2 結(jié)果與分析

5個退火溫度下，15對葉綠體基因組通用引物PCR擴增產(chǎn)物的檢測結(jié)果如表2所示，出現(xiàn)單清晰帶表示該引物可以擴增出單一清晰的特異性條帶，能夠用于曼陀羅葉綠體基因組的擴增和后續(xù)的測序工作；出現(xiàn)無帶、多條帶、單條帶不清晰則表示該引物擴增出來的條帶不具有單一性和特異性，不能用于曼陀羅葉綠體基因組的擴增和后續(xù)研究。

由表2可知，5個退火溫度下，從15對葉綠體基因組通用引物中共篩選出7對可擴增出單清晰帶的引物。其中在退火溫度55 ℃條件下，僅引物5可擴增出單清晰帶；退火溫度50 ℃條件下，引物1、引物2、引物3、引物4可擴增出單清晰帶；退火溫度48 ℃條件下，引物14可擴增出單清晰帶；其余引物在5個退火溫度條件下均未擴增出單清晰帶。

此外，7對引物擴增曼陀羅葉綠體基因組的區(qū)域分別為trnL-trnF、trnT-trnL、atpB-rbcL、trnS-psbC，

其中引物2、引物3、引物5、引物14分別在退火溫度50 ℃、50 ℃、55 ℃、48 ℃條件下擴增出trnL-trnF，

說明曼陀羅葉綠體基因組片段trnL-trnF在不同的引物及退火溫度下均易擴增出清晰的特異性條帶，而其他擴增區(qū)域只在特定退火溫度及特定引物下才能擴增出特異性條帶，trnL-trnF更適用于曼陀羅葉綠體基因組后續(xù)研究。

3 結(jié)論與討論

21世紀(jì)以來，入侵生態(tài)學(xué)研究成為全球熱點之一[13]。隨著生物入侵現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，由生物入侵造成的生態(tài)資源破壞和經(jīng)濟(jì)損失也越來越大，嚴(yán)重影響著被入侵地的生態(tài)安全、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類健康等[14]。曼陀羅作為一種入侵植物，研究其葉綠體基因組的遺傳多樣性對了解曼陀羅的入侵機制進(jìn)而制定科學(xué)的防控措施具有重要意義，而對曼陀羅葉綠體基因組部分片段進(jìn)行測序是進(jìn)行曼陀羅葉綠體基因組遺傳多樣性等研究的有效方法，其中篩選曼陀羅葉綠體基因組通用引物可為后續(xù)測序和曼陀羅葉綠體基因組遺傳多樣性等方面的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本文通過查詢相關(guān)文獻(xiàn)獲得15對葉綠體基因組通用引物，對曼陀羅葉綠體基因組非編碼區(qū)進(jìn)行PCR擴增，對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，發(fā)現(xiàn)有7對引物在相應(yīng)的退火溫度下能夠擴增出單一清晰的特異性條帶，其中曼陀羅葉綠體基因組片段

trnL-trnF在不同引物和退火溫度下均易擴增出特異性條帶，更適合用于曼陀羅葉綠體基因組非編碼區(qū)的擴增和后續(xù)的測序工作，對后續(xù)研究入侵植物曼陀羅葉綠體基因組的遺傳多樣性、單倍型分析及譜系地理學(xué)分析具有重要意義。

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（責(zé)任編輯：劉寧寧）