基于生物信息學(xué)的酒精性肝病關(guān)鍵基因篩選及驗(yàn)證

王一涵 漆光紫 李文學(xué) 岑育芳 韋俊宏 唐玉航 龐雅琴

【摘要】 目的 利用生物信息學(xué)方法探索酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）潛在的關(guān)鍵基因并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為尋找ALD潛在的生物標(biāo)志物提供依據(jù)。方法 從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的公共基因芯片數(shù)據(jù)平臺(tái)（Gene Expression Omnibus，GEO）的數(shù)據(jù)庫(kù)下載兩個(gè)基因表達(dá)譜芯片（GSE28619和GSE100901），利用GEO2R篩選出酒精性肝病實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），對(duì)DEGs進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）與京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes ，KEGG）信號(hào)通路的富集分析，進(jìn)一步應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)，用Cytoscape來(lái)篩選出關(guān)鍵基因。構(gòu)建ALD小鼠模型，通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證篩選出關(guān)鍵基因。結(jié)果 總共鑒定出173個(gè)DEGs，GO顯示DEGs生物學(xué)功能主要涉及5個(gè)KEGG通路，包括補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、膽固醇代謝、視黃醇代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、膽汁分泌相關(guān)信號(hào)通路，結(jié)合蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）和CytoHubba的結(jié)果，篩選出SERPINC1、AHSG、FGG、FGA、ITIH3、FGB、APOB、ALB和APOH 9個(gè)關(guān)鍵基因，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比，ALD小鼠肝臟ALB、APOB和FGB 的mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05），而ITIH3、FGG和SERPINC1的 mRNA表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。結(jié)論 ALB、APOB、 FGB、ITIH3、FGG、SERPINC1 有望成為ALD潛在的生物標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】 生物信息學(xué)；酒精性肝?。换?；生物標(biāo)志物

中圖分類(lèi)號(hào)：R575.5;Q811.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.05.002

【Abstract】 Objective To explore the potential key genes of alcoholic liver disease （ALD） by bioinformatics methods and to validate them through experiments， so as to provide basis for searching for potential biomarkers of ALD. Methods Two gene expression profile chips （GSE28619 and GSE100901） were downloaded from the database of the public GeneChip Data Platform（Gene Expression Omnibus， GEO） of the National Center for Biotechnology Information （NCBI） in the United States. GEO2R was used to select differentially expressed genes （DEGs） in ALD group and control group. The enrichment analysis of gene ontology （GO） and Kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG） signaling pathways in DEGs was conducted. Furthermore， STRING database was applied to construct the interaction network of proteins， and key genes were screened by Cytoscape. ALD mice models were constructed and key genes were screened by RT-qPCR validation.Results A total of 173 DEGs were identified. GO showed that the biological functions of DEGs mainly involved in five KEGG pathways， including complement and coagulation cascade， cholesterol metabolism， retinol metabolism， drug metabolism-cytochrome P450， and bile secretion-related signaling pathways. Based on the results of protein-protein interaction network （PPI） and CytoHubba， 9 key genes， namely， SERPINC1， AHSG， FGG， FGA， ITIH3， FGB， APOB， ALB， and APOH， were screened out. RT-qPCR detection found that compared with WT mice， the mRNA expressions of ALB， APOB， and FGB in the liver of ALD mice upregulated （P<0.05）， while the mRNA expressions of ITIH3， FGG， and SERPINC1 downregulated （P<0.05）.Conclusion ALB， APOB， FGB， ITIH3， FGG and SERPINC1 are expected to be potential biomarkers for ALD.

【Key words】 bioinformatics; alcoholic liver disease（ALD）; gene; biomarkers

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）俗稱(chēng)酒精肝，是全球最普遍的肝病之一［1］，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的調(diào)查，2016年全球酒精導(dǎo)致3000萬(wàn)人死亡，占全球死亡人數(shù)的5.3%，占全球疾病負(fù)擔(dān)的5.1%［2］。近年來(lái)，ALD導(dǎo)致的病死率有所增加。在美國(guó)，酒精已超過(guò)丙型肝炎病毒成為肝臟相關(guān)疾病死亡的主要病因，自2007年以來(lái)ALD年齡標(biāo)準(zhǔn)化病死率持續(xù)性增長(zhǎng)，年增長(zhǎng)率為3.1%［3］。酒精通過(guò)抑制線(xiàn)粒體β氧化和增加脂肪酸合成，導(dǎo)致甘油三酯、磷脂和膽固醇脂的積累，從而誘導(dǎo)脂肪在肝臟中沉積，形成酒精性脂肪性肝炎并伴有肝細(xì)胞損傷和氣球樣改變等病理特征［4］，大量飲酒導(dǎo)致肝臟慢性炎癥和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和纖維化，而晚期纖維化可導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)紊亂和肝實(shí)質(zhì)纖維化，進(jìn)展至肝硬化階段［5］。慢性的肝損傷、氧化應(yīng)激炎癥、纖維化和酒精代謝物的致癌作用可能導(dǎo)致DNA突變，使疾病向肝細(xì)胞癌的方向發(fā)展［6-7］。目前ALD的診斷仍需通過(guò)活檢來(lái)進(jìn)行，但由于其是一種侵入性的檢查手段，患者的接受程度普遍不高，迫切需要尋找ALD發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物用于篩查和診斷。

通量技術(shù)在潛在生物標(biāo)志物中應(yīng)用廣泛［9］，臨床生物信息學(xué)作為一種新興的研究方法，是疑難雜癥的診斷、治療和預(yù)后等方面很有前景的研究方法之一［10］。這些方法已廣泛應(yīng)用于肝癌、胃癌等癌癥的檢查［11-13］。在一些非腫瘤疾病中，通過(guò)生物信息學(xué)分析也發(fā)現(xiàn)了許多有價(jià)值的新型生物標(biāo)志物［14-16］。因此，本研究通過(guò)生物信息學(xué)初步探索ALD的生物標(biāo)志物和分子機(jī)制，預(yù)測(cè)與ALD相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因，并通過(guò)ALD小鼠模型，對(duì)其肝組織采用RT-qPCR進(jìn)行關(guān)鍵基因驗(yàn)證，為ALD新生標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用提供借鑒價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中篩選出兩個(gè)mRNAs基因芯片數(shù)據(jù)集（GSE28619和GSE100901），篩選標(biāo)準(zhǔn)是兩個(gè)數(shù)據(jù)集共同差異基因較多。GSE28619數(shù)據(jù)庫(kù)芯片平臺(tái)是GPL570［HG-U133_Plus_2］ Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array；GSE100901數(shù)據(jù)庫(kù)芯片平臺(tái)是GPL13667［HG-U219］Affymetrix Human Genome U219 Array。

1.2 差異表達(dá)基因（differentially exprsssed gense，DEGs）篩選

利用GEO2R（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）對(duì)ALD組和對(duì)照組的樣本進(jìn)行DEGs分析統(tǒng)計(jì)，以P<0.05和|log2（FC）|>1.0為標(biāo)準(zhǔn)篩選出DEGs。用“ggplot2”R語(yǔ)言包可視化繪制火山圖，用 R包（ComplexHeatmap）可視化制成熱圖，用可視化軟件Funrich（http：//funrich.org/）生成韋恩圖。

1.3 DEGs的基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析

通過(guò)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/），分析GO功能富集數(shù)據(jù)，分別通過(guò)生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞成分 （cellular component，CC）、分子功能（molecularfunction，MF）對(duì)分析的基因進(jìn)行注釋和分類(lèi)。KEGG包含生物學(xué)功能、疾病、化學(xué)物質(zhì)、藥物和生物學(xué)通路等數(shù)據(jù)集。統(tǒng)計(jì)方法為EASE Score或Fisher Exact，GO和KEGG各項(xiàng)篩選條件為P<0.05［17］。根據(jù)分析結(jié)果用“ggplot2”R語(yǔ)言包繪制氣泡圖。

1.4 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選

STRING（https：//string-db.org/）可用來(lái)呈現(xiàn)和評(píng)估PPI網(wǎng)絡(luò)［18］。將本研究篩選出的所有DEGs導(dǎo)入STRING，利用 STRING分析工具，進(jìn)一步探尋DEGs之間潛在的聯(lián)系［19］。篩選條件設(shè)置為：置信度≥0.15，互作最大值為0。然后把STRING的計(jì)算結(jié)果導(dǎo)入 Cytoscape軟件［20］，挖掘PPI網(wǎng)絡(luò)中連接最為緊密的集合［21］，應(yīng)用的是分子復(fù)合物檢測(cè)（molecular complex detection，MCODE）插件，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)篩選參數(shù)。此外應(yīng)用cytoHubba插件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中前幾個(gè)關(guān)鍵位置的基因。

1.5 構(gòu)建ALD小鼠模型，通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證篩選出關(guān)鍵基因

本研究采集了廣州疾病預(yù)防控制中心毒理科共包括3只ALD小鼠（喂常規(guī)飼料和10%酒精為唯一飲料，連續(xù)喂養(yǎng)30 d）和3只正常的WT小鼠（喂常規(guī)飼料和水）的肝組織，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（粵）2018-0002。采集肝臟樣本后立即在液氮中冷凍，并根據(jù)既定方案提取RNA。根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara）試劑盒進(jìn)行互補(bǔ)DNA（cDNA）合成，擴(kuò)增條件設(shè)置如下：95 ℃啟動(dòng)10分鐘，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，95 ℃持續(xù)15秒，60 ℃持續(xù)30秒，以小鼠的β-actin作為內(nèi)參（參照基因），使用2-ΔΔCt計(jì)算。本研究中使用的引物序列見(jiàn)表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

WT小鼠和ALD小鼠的肝組織9個(gè)關(guān)鍵基因mRNA的表達(dá)資料采用SPSS 25.0建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。mRNA的表達(dá)水平用（±s）描述，兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。同時(shí)利用GraphPad Prism 7軟件對(duì)WT小鼠和ALD小鼠的肝組織9個(gè)關(guān)鍵基因mRNA的表達(dá)進(jìn)行作圖。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs篩選結(jié)果

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出兩個(gè)數(shù)據(jù)集基因表達(dá)譜（GSE28619和GSE100901），包括健康對(duì)照樣本和ALD實(shí)驗(yàn)樣本。GSE28619包含了3個(gè)健康對(duì)照樣本和3個(gè)ALD實(shí)驗(yàn)樣本，與對(duì)照組相比，ALD組有911個(gè)上調(diào)基因，684 個(gè)下調(diào)基因（|log2（FC）|>1.0，P＜0.05）;GSE100901包含了8個(gè)健康對(duì)照樣本和8個(gè)ALD實(shí)驗(yàn)樣本，與對(duì)照組相比，ALD組有2259個(gè)上調(diào)基因，2867個(gè)下調(diào)基因（|log2（FC）|>1.0，P＜0.05），繪制可視化的火山圖和熱圖（圖1，圖2）。比較所有DEGs的基因表達(dá)譜，并繪制韋恩圖（圖3），共有173個(gè)基因?yàn)閮蓚€(gè)數(shù)據(jù)集共有的DEGs。

2.2 DEGs的GO和KEGG分析結(jié)果

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)總的DEGs進(jìn)行GO和KEGG 信號(hào)通路富集分析，結(jié)果如圖4所示，GO功能包括BP、MF、CC，GO富集分析后發(fā)現(xiàn)，DEGs主要定位在含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)、血液微粒、血漿脂蛋白顆粒、脂蛋白顆粒、高密度脂蛋白顆粒成分；分子功能主要涉及糖胺聚糖結(jié)合、肝素結(jié)合、肽酶抑制劑活性、內(nèi)肽酶抑制劑活性、硫化合物結(jié)合；生物過(guò)程主要包含細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)組織、急性炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)活化、羧酸生物合成過(guò)程、有機(jī)酸生物合成過(guò)程；KEGG分析顯示，DEGs主要與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、膽固醇代謝、視黃醇代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、膽汁分泌信號(hào)通路有關(guān)。

2.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果和關(guān)鍵基因篩選

在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Cytoscape對(duì)DEGs進(jìn)行PPI分析并進(jìn)行可視化（圖5），根據(jù)Cytoscape產(chǎn)生的節(jié)點(diǎn)度評(píng)分，將SERPINC1、AHSG、FGG、FGA、ITIH3、FGB、APOB、ALB和APOH 前9個(gè)基因作為潛在的核心基因（圖6）。

2.4 RT-qPCR驗(yàn)證WT小鼠和ALD小鼠的肝組織9個(gè)關(guān)鍵基因mRNA的表達(dá)情況

對(duì)WT小鼠和ALD小鼠肝臟的肝細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，并通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，ALD小鼠ALB、APOB和FGB的 mRNA表達(dá)均高于WT小鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ALD小鼠ITIH3、FGG和SERPINC1的mRNA表達(dá)均低于WT小鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2，圖7）。結(jié)果提示，與WT小鼠肝組織相比，ALB、APOB和FGB的mRNA在ALD小鼠肝組織表達(dá)上調(diào)，與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的測(cè)序結(jié)果差異表達(dá)趨勢(shì)一致，ITIH3、FGG和SERPINC1的mRNA在ALD小鼠肝組織表達(dá)下調(diào)，與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的測(cè)序結(jié)果差異表達(dá)趨勢(shì)一致。

3 討 論

ALD的發(fā)病機(jī)制是多因素的，包含環(huán)境、遺傳和生活習(xí)慣等［22］。在我們的研究中，總共鑒定出192個(gè)DEGs，GO功能分類(lèi)結(jié)果表明，DEGs生物學(xué)功能主要涉及5個(gè)KEGG通路，包括補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、膽固醇代謝、視黃醇代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、膽汁分泌相關(guān)信號(hào)通路，結(jié)合PPI和CytoHubba的結(jié)果，篩選出SERPINC1、AHSG、FGG、FGA、ITIH3、FGB、APOB、ALB和APOH 前9個(gè)關(guān)鍵基因，并且通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常鼠肝組織相比，ALB、APOB和FGB的mRNA在ALD組表達(dá)上調(diào)，ITIH3、FGG和SERPINC1的mRNA在ALD組表達(dá)下調(diào)。

ALB、APOB、FGB、ITIH3、FGG和SERPINC1多在肝功能和免疫反應(yīng)方面起作用。ALB的主要功能是調(diào)節(jié)血液的膠體滲透壓［23］，作為血漿中鋅、鈣和鎂主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［24］，當(dāng)肝臟損傷、血液循環(huán)不暢和水腫時(shí)，ALB升高［25］。APOB是乳糜微粒（ApoB-48）、低密度脂蛋白（ApoB-100）和VLDL （ApoB-100）的主要蛋白質(zhì)成分［26］，其作為一種識(shí)別信號(hào)，通過(guò)載脂蛋白b/E受體與細(xì)胞結(jié)合并內(nèi)化為L(zhǎng)DL顆粒［27］，可能對(duì)ALD脂肪變化進(jìn)程有推進(jìn)作用。纖維蛋白原β（FGB）被蛋白酶凝血酶切割產(chǎn)生單體，其與纖維蛋白原α（FGA）和纖維蛋白原γ（FGG）一起聚合形成不溶性纖維蛋白基質(zhì)［28］，而纖維蛋白沉積也與感染有關(guān)，它可以防止IFNG介導(dǎo)出血［29］，還可以通過(guò)先天性和T細(xì)胞介導(dǎo)的途徑促進(jìn)抗菌免疫反應(yīng)［30］，可能與ALD引起的肝臟炎癥有關(guān)。ITIH3作為血清中透明質(zhì)酸的載體，是透明質(zhì)酸與其他基質(zhì)蛋白（包括組織中細(xì)胞表面的細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)）之間的結(jié)合蛋白，可調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸的定位、合成和降解，這對(duì)于經(jīng)歷生物過(guò)程的細(xì)胞至關(guān)重要［31］，有止血、血小板活化的作用，可能與ALD引起肝功能改變有關(guān)［32］。FGG與FGA和FGB一起聚合形成不溶性纖維蛋白基質(zhì)［33］，在止血中具有主要功能［34］。SERPINC1是血漿中最重要的絲氨酸蛋白酶抑制劑，可調(diào)節(jié)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在肝素存在下其抑制活性極大增強(qiáng)［35］，可能與ALD引起肝功能改變有關(guān)。我們的研究結(jié)果將為下一步探索ALD潛在的生物標(biāo)志物、疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制和新治療的方案提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-03-15 修回日期：2023-04-06）

（編輯：黃研研）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81960595，81360438，81660549）；廣西自然科學(xué)基金（2019JJD140011）；2022年右江民族醫(yī)學(xué)院碩士研究生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（YXCXJH2022010）

作者簡(jiǎn)介：王一涵，男，住院醫(yī)師，在讀碩士研究生，研究方向：分子毒理學(xué)。E-mail：452158749@qq.com

通信作者：龐雅琴。E-mail：pangyaqin@126.com