液滴微流控-表面增強(qiáng)拉曼檢測新技術(shù)及應(yīng)用

張奇 王玉峰，2 齊小花 薛強(qiáng) 鄒明強(qiáng)*

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院& 國家藥監(jiān)局體外快速診斷試劑技術(shù)轉(zhuǎn)化與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100123；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院）

0 引言

液滴微流控和表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）技術(shù)作為近年來分析化學(xué)領(lǐng)域的兩大研究熱點(diǎn)，正在引起廣泛關(guān)注和持續(xù)的研究興趣。 液滴微流控是利用微流體控制技術(shù)，在微通道中精確生成、操控和合并微小液滴，為實(shí)現(xiàn)高效、靈活和可控的微尺度流體操作提供了一種平臺[1]。 SERS 技術(shù)則通過將分析物吸附到金屬納米結(jié)構(gòu)表面以顯著增強(qiáng)其拉曼檢測信號，具有特異性、快速、靈敏檢測等特點(diǎn)，為化學(xué)物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和定量檢測提供了無可比擬的手段[2]。

目前，SERS 檢測在化學(xué)分析和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用[3]，但也存在著一些問題需要解決：（1）檢測重復(fù)性方面：由于制備納米結(jié)構(gòu)、樣品制備和分析條件的差異， 不同實(shí)驗(yàn)室的SERS 結(jié)果可能存在較大差異，導(dǎo)致重復(fù)性問題。 （2）檢測靈敏度方面：SERS技術(shù)易受樣品基質(zhì)干擾， 即易受背景信號和噪聲影響，導(dǎo)致特征SERS 信號低，即檢測靈敏度低。 此外，傳統(tǒng)SERS 對于樣品體積要求較大， 限制了其在微量分析中的應(yīng)用。液滴微流控技術(shù)的出現(xiàn)，以其獨(dú)特的優(yōu)勢改變了傳統(tǒng)微流控技術(shù)或者傳統(tǒng)分析方法所遇到的一系列限制， 可實(shí)現(xiàn)微小尺度的反應(yīng)控制和分析操作，為非破壞性、非接觸式的拉曼檢測提供了精準(zhǔn)可控、靈活、高通量的輔助分析平臺，對于微量樣品的處理和分析具有明顯的優(yōu)勢[4]。

基于液滴微流控技術(shù)的SERS 檢測具有以下優(yōu)勢：（1）避免液體蒸發(fā)和記憶效應(yīng)：液滴微流控系統(tǒng)可以防止液體蒸發(fā)， 并避免連續(xù)微流控中樣品在通道壁上的長期停留，從而降低了記憶效應(yīng)的影響[5]。（2）提高分析物擴(kuò)散和濃縮效率：通過電動(dòng)力濃縮、磁性捕獲、流體動(dòng)力聚焦或介電泳等手段[6-7]，液滴微流控系統(tǒng)可以改善分析物向增強(qiáng)基底的擴(kuò)散效率，提高了分析靈敏度。（3）高通量和高效率分析：液滴微流控系統(tǒng)能夠生成和操縱大量的離散液滴，實(shí)現(xiàn)高通量分析和高效率反應(yīng)過程， 從而提高了分析速度和效率。 （4）提高重復(fù)性和穩(wěn)定性：通過精確控制液滴的大小和分離， 液滴微流控系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)對實(shí)驗(yàn)條件的高度穩(wěn)定控制， 從而提高拉曼分析重復(fù)性和穩(wěn)定性。 通過液滴微流控-SERS 技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對微生物的單細(xì)胞分析、 藥物篩選和分子檢測等方面的研究，為生命科學(xué)、化學(xué)分析和醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域提供了廣闊的應(yīng)用前景[8-9]。

本文通過液滴微流控技術(shù)簡介， 分析其與SERS 技術(shù)結(jié)合的幾種應(yīng)用并展望二者結(jié)合所面臨的挑戰(zhàn)和未來應(yīng)用領(lǐng)域。 文中介紹了目前多種微流控平臺通道制作和液滴生成方法， 展示了兩種技術(shù)結(jié)合在化學(xué)反應(yīng)過程原位分析、 單細(xì)胞分析和拉曼活性顆粒可控合成領(lǐng)域中應(yīng)用。 探討了兩種技術(shù)結(jié)合在靈敏度、 重復(fù)性和快速檢測應(yīng)用等方面所面臨的挑戰(zhàn)，并展望了液滴微流控-SERS 技術(shù)未來發(fā)展趨勢和潛在應(yīng)用前景。

1 微流控平臺的構(gòu)建與液滴的生產(chǎn)

1.1 微流控通道制作技術(shù)

液滴微流控平臺的SERS 檢測性能和效果與微流控通道設(shè)計(jì)與制作具有密切關(guān)系， 后者是液滴微流控的首要和基本的關(guān)鍵步驟。 為了實(shí)現(xiàn)液滴的產(chǎn)生、操作和進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)特定功能，微通道制作與設(shè)計(jì)須具有高集成度、特定幾何結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)特征，尤其是表面性質(zhì)。 目前， 微流控芯片制作主要采用玻璃/硅基微加工[10-11]、聚合物復(fù)制成型[12]、商用模塊化組裝[13]及3D 打印[14]等技術(shù)和方法。 不同方法在微流控芯片制造中液滴生產(chǎn)過程中具有如下的優(yōu)缺點(diǎn)：玻璃/硅基微加工芯片具有優(yōu)秀的化學(xué)和熱學(xué)穩(wěn)定性，能夠?qū)崿F(xiàn)高精度的微加工，適用于制作復(fù)雜的微通道結(jié)構(gòu)； 然而造價(jià)較高， 對設(shè)備和工藝要求較苛刻，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、低成本生產(chǎn)。 聚合物復(fù)制成型方法造價(jià)相對較低，適合批量生產(chǎn)，可實(shí)現(xiàn)快速復(fù)制微通道結(jié)構(gòu)；其缺點(diǎn)是材料穩(wěn)定性較差，可能存在材料溶解或化學(xué)反應(yīng)問題且不適用于高溫或腐蝕性液體條件的應(yīng)用場景。商用模塊化組裝方法，可快速構(gòu)建微流控芯片，適用于原型和小規(guī)模生產(chǎn)；然而模塊化組裝的靈活性有限， 難以實(shí)現(xiàn)定制化設(shè)計(jì)并存在接口可靠性和泄漏問題。3D 打印法具有高度設(shè)計(jì)自由度，可構(gòu)建復(fù)雜的微通道結(jié)構(gòu)，快速、靈活，適用于快速原型制造；只不過該技術(shù)目前仍在發(fā)展中，打印精度指標(biāo)和可供選擇的材料均有限， 打印速度較慢且不適用于規(guī)模化生產(chǎn)。

1.2 液滴生成與操作方法

液滴的生成和操作是液滴微流控平臺的核心環(huán)節(jié)。 液滴生成方法包括被動(dòng)液滴生成法和主動(dòng)液滴生成法。其中，被動(dòng)液滴生成法是指在液滴生成期間僅存在流體的壓力作用，無其它外部能量的輸入。目前水動(dòng)力法是被動(dòng)液滴生成法中主流方法， 主要有T 型通道法、流動(dòng)聚焦法和毛細(xì)管共軸流聚焦法。通過壓力作為驅(qū)動(dòng)， 利用流動(dòng)相改變分散相液體流動(dòng)狀態(tài)，使其分割成無數(shù)個(gè)離散均一液滴。主動(dòng)控制法是通過在液滴生成過程中引入機(jī)械、磁、光、熱和電等[15-17]外部能量來控制微流體的表面能，從而精準(zhǔn)控制液滴的生成。液滴的操控主要包括液滴合并、分離和混合等。通過控制外部力場、調(diào)節(jié)流速或改變流體界面的性質(zhì)，液滴的位置、大小和形狀可被精確操控。例如，利用電場、磁、聲波或加熱等外部力場可實(shí)現(xiàn)液滴的合并和分離操作[4]。 此外，通過選擇適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┨砑痈淖円旱蔚谋砻嫘再|(zhì)， 可實(shí)現(xiàn)液滴內(nèi)部的混合和分離過程，促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)、生物分析或制備復(fù)合材料等應(yīng)用。

2 液滴微流控-SERS 技術(shù)的應(yīng)用

2.1 化學(xué)反應(yīng)的原位表征

原位表征在化學(xué)反應(yīng)理解和優(yōu)化中具有重要性，能夠揭示反應(yīng)過程中物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化、動(dòng)力學(xué)行為和催化機(jī)制[18-19]。 微流控液滴可作為獨(dú)立的反應(yīng)容器，這在化學(xué)反應(yīng)在線監(jiān)測中具有很大吸引力，因?yàn)檫@具有可精確控制反應(yīng)試劑，快速優(yōu)化反應(yīng)條件，且不受外部環(huán)境的影響等優(yōu)點(diǎn)[20]。 例如，傳統(tǒng)的Fenton反應(yīng)中SERS 監(jiān)測通常會(huì)面臨一些問題： 催化劑Fe2+的不斷損失以及Fe3+水解引起的固體污泥的形成不利于反應(yīng)的連續(xù)性， 且Fe2+引起的SERS 底物聚集不利于連續(xù)SERS 監(jiān)測[21]。 為此，YUE 等[22]首次將芯片上微液滴系統(tǒng)應(yīng)用于實(shí)現(xiàn)染料的Fenton 降解過程在線SERS 監(jiān)測。Fenton 試劑、羅丹明B 染料和SERS 基底分別引入到微流控芯片中， 在匯聚后形成微液滴， 避免了Fe2+催化劑的損失和SERS 基底的聚集，確保了相對穩(wěn)定的化學(xué)反應(yīng)環(huán)境，從而實(shí)現(xiàn)染料Fenton 降解的連續(xù)監(jiān)測。 該方法直接揭示了羅丹明染料的降解機(jī)制， 表明呫噸和羧基苯之間的化學(xué)鍵在反應(yīng)過程中不斷斷裂。此外，液滴的高界面面積有利于研究皮克林乳液催化過程。 傳統(tǒng)批量皮克林乳液是通過劇烈攪拌制備的， 因此顯示出較寬的液滴尺寸分布， 難以測量動(dòng)力學(xué)和兩相之間的低界面面積等[23]。 該過程中皮克林乳液的不透明性和緊密相混合使其在線研究變得困難，需要取樣、破乳才能進(jìn)一步分析。 VIS 等[24]首次利用液滴微流控-SERS 實(shí)現(xiàn)對皮克林乳液催化的在線原位研究，由于液滴的高界面面積， 該方法使酸催化脫縮醛反應(yīng)產(chǎn)率提高了9 倍。 通過皮克林乳液的高穩(wěn)定性限制酸和堿催化劑的相互破壞， 改善了拮抗脫縮醛-Knoevenagel 縮合串聯(lián)反應(yīng)的性能，為進(jìn)一步研究皮克林乳液催化過程提供了通用方法。 這些工作凸顯了液滴微流控-SERS 在監(jiān)測特殊反應(yīng)的獨(dú)特性和潛力，尤其在減少外界環(huán)境干擾排除記憶效應(yīng)，增大界面效應(yīng)和連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測等方面， 為原位化學(xué)反應(yīng)研究帶來了重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 單細(xì)胞的分析

單細(xì)胞分析在揭示個(gè)體細(xì)胞的異質(zhì)性、深入理解細(xì)胞功能、發(fā)育和疾病機(jī)理方面具有重要作用，同時(shí)為個(gè)性化醫(yī)學(xué)提供了基礎(chǔ)。 液滴微流控與SERS 技術(shù)的結(jié)合在單細(xì)胞分析上有著廣泛的應(yīng)用前景[25]。從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模到臨床應(yīng)用， 微流體系統(tǒng)中細(xì)胞和液滴的分類對研究人員非常有用。 相比于常見的熒光激活細(xì)胞分選和磁激活細(xì)胞分選技術(shù)， 拉曼激活細(xì)胞分選技術(shù)能夠以無標(biāo)記和非侵入的方式從同基因群體或復(fù)雜的細(xì)胞群落中識別和分離目標(biāo)類型、狀態(tài)或環(huán)境的單個(gè)細(xì)胞[26-27]，然而通量仍然是限制其更廣泛應(yīng)用的主要因素之一。 WANG 等[28]通過將細(xì)胞封裝在尺寸相當(dāng)?shù)奈⒌沃校?實(shí)現(xiàn)了對不同含量蝦青素的紅球藻活細(xì)胞進(jìn)行無標(biāo)記和高通量篩選，細(xì)胞分選率達(dá)98.3%，處理量約為260 細(xì)胞/分鐘且分選后的細(xì)胞92.7%仍然能夠存活并成功增殖。 同時(shí)液滴微流控-SERS 技術(shù)也被用于單細(xì)胞的分子分析中。WILLNER 等[29]通過在微滴中包封單個(gè)細(xì)胞和小麥胚芽凝集素功能化的SERS 探針， 檢測細(xì)胞表面分子的表達(dá)， 從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤學(xué)靶點(diǎn)開展研究和進(jìn)行細(xì)胞間異質(zhì)性觀察。此外，微滴為單細(xì)胞提供了生存空間， 可以在其中積累和分析細(xì)胞分泌的代謝物。通過巧妙的反應(yīng)設(shè)計(jì)和免疫夾心系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)對單細(xì)胞代謝物的高靈敏檢測， 并同時(shí)分析多種代謝物，進(jìn)而揭示細(xì)胞的功能狀態(tài)和代謝特征[30]。液滴微流控-SERS 技術(shù)在單細(xì)胞測序方面也具有重要意義[31]。通過精確封裝目標(biāo)細(xì)胞在微滴中，并在后續(xù)測序中精確導(dǎo)出， 可實(shí)現(xiàn)從單個(gè)細(xì)胞獲得完整基因組序列分析。 這種方法可用于分離和鑒定具有臨床意義的細(xì)胞，例如耐藥性細(xì)菌，并具有高基因組覆蓋率和高分辨率優(yōu)勢。 因此，液滴微流控-SERS 技術(shù)為單細(xì)胞分析提供了一種高通量、 高靈敏度和非侵入性的監(jiān)測手段，在研究細(xì)胞異質(zhì)性、探索細(xì)胞功能和代謝特征等方面具有重要意義， 并展示了廣闊的應(yīng)用前景。

2.3 SERS 活性顆粒可控合成用于小分子的檢測

結(jié)構(gòu)可控的SERS 活性顆粒對于拉曼檢測重復(fù)性尤為重要， 然而可控制備出均一性好的SERS 活性顆粒具有挑戰(zhàn)性。 液滴微流控系統(tǒng)制備的SERS活性微粒具有可控的均勻尺寸和形態(tài)[32]，主要包括聚合物基質(zhì)微粒和光子晶體微粒。 WANG 等[33]結(jié)合自上而下（微滴產(chǎn)生和金屬薄膜沉積） 和自下而上（納米顆粒自組裝）工藝優(yōu)點(diǎn)，提出一種快速可靠的生成等離子體微傳感器的方法。 通過微流控技術(shù)進(jìn)行高頻率和連續(xù)的液滴生成、 空間限域二氧化硅納米顆粒的自組裝來控制微球體積分?jǐn)?shù)和填充密度以及物理薄膜沉積在微球表面以精確形成等離子體納米結(jié)構(gòu)，成功制備了具有>107平均增強(qiáng)因子的高質(zhì)量SERS 活性基底，且具有良好的重現(xiàn)性。基于液滴微流控制備的微粒還具有尺寸選擇性、pH 敏感性[34]和溫度響應(yīng)性[35]等良好特性，由此展現(xiàn)出對生物小分子良好的SERS 檢測能力。 例如對于生物體液中小分子檢測，蛋白質(zhì)往往會(huì)吸附在金屬表面，形成蛋白質(zhì)電暈現(xiàn)象，從而顯著降低SERS 散射強(qiáng)度。為解決這個(gè)問題，KIM 等[36]通過將金和立方銀納米結(jié)構(gòu)封裝在聚乙二醇二丙烯酸酯微球中， 制備出具有尺寸排阻效應(yīng)的SERS 微球。 通過調(diào)節(jié)聚乙二醇二丙烯酸酯單體濃度，成功消除了蛋白質(zhì)電暈效應(yīng)。這種新型微凝膠可直接用于生物液體中待測物SERS 檢測，無需進(jìn)行任何預(yù)處理，帶電基質(zhì)微凝膠通過靜電引力可濃縮帶有相反電荷的小分子[37]。 所制備的含有金納米顆粒雙乳液微凝膠可使拉曼信號提高2 個(gè)數(shù)量級[38]，極大提升了小分子檢測靈敏度，提供了一種高效、準(zhǔn)確的生物體液中小分子檢測方法。 因此，基于液滴微流控系統(tǒng)制備的SERS 活性微粒可有效提高拉曼檢測靈敏度和重復(fù)性， 并通過靈活的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)可應(yīng)用于復(fù)雜樣品體系， 未來有望應(yīng)用于健康監(jiān)測、疾病診斷和藥物殘留檢測等領(lǐng)域。

3 技術(shù)挑戰(zhàn)與未來發(fā)展方向

3.1 提高拉曼檢測性能的方法與策略

為了提高拉曼檢測靈敏度，可通過超聲、光和熱等手段對液滴內(nèi)待測分子進(jìn)行快速無損富集和SERS 基底的空間可控聚集[35，39]，促使分子進(jìn)入更多空間熱點(diǎn)從而增強(qiáng)拉曼散射信號。此外，仍需深入開展液滴微流控系統(tǒng)中不同金屬納米結(jié)構(gòu)影響機(jī)制研究，例如，微反應(yīng)器中分布和聚集，形貌尺寸和膠體穩(wěn)定性等[40]。 為了擴(kuò)大基于液滴微流控SERS 系統(tǒng)的應(yīng)用范圍， 需要對基底制備和修飾過程進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化， 因?yàn)檫@些因素直接影響SERS 分析性能。 同時(shí)SERS 分析的選擇性也值得關(guān)注，SERS 基底除了通過抗體、適配體和多肽修飾以外，還可以利用尺寸、電荷和材料提高選擇性[41]。

3.2 發(fā)展快速、便攜化檢測設(shè)備

簡化和模塊化分析系統(tǒng)， 這包括簡化分析系統(tǒng)以提高便攜性，設(shè)計(jì)新的芯片樣品前處理功能模塊，以及能夠在惡劣條件下進(jìn)行特定反應(yīng)的模塊[41]。 將多相樣品混合，液滴生成、混合、分割、捕獲和排序等操作集成到芯片中作為前處理功能模塊， 結(jié)合便攜式拉曼光譜儀作為檢測手段， 適合于實(shí)時(shí)場景中快速檢測[42]。 通過引入磁珠、電場、溫控等模塊可豐富設(shè)備的功能，實(shí)現(xiàn)檢測和應(yīng)用領(lǐng)域的多元性。通過將人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)算法與液滴微流控結(jié)合， 可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測設(shè)備操作和數(shù)據(jù)分析， 提高檢測效率和準(zhǔn)確性[43]。

3.3 其它領(lǐng)域快速檢測應(yīng)用

液滴微流控系統(tǒng)可將農(nóng)藥、 抗生素和藥物殘留物等小分子限域在微液滴中， 使樣品與SERS 基底充分接觸，增加了待測分子的聚集程度，從而增強(qiáng)拉曼散射信號。通過在芯片上進(jìn)行高度集成，可在短時(shí)間內(nèi)完成整個(gè)分析流程，包括樣品預(yù)處理、微反應(yīng)器的高通量生成、待測分子的富集和液滴檢測，提高了分析的綜合效率[44]。 此外，液滴微流控結(jié)合SERS 技術(shù)具有樣品消耗量極低的優(yōu)勢， 減少了對食品和耗材的浪費(fèi)，節(jié)約了成本。

目前，微流控-SERS 技術(shù)已成功實(shí)現(xiàn)了對真實(shí)食物基質(zhì)中污染物的原位分析。 例如，牛奶中三聚氰胺和氨芐青霉素、 果汁中甲基對硫磷及其他復(fù)雜基質(zhì)食品中重金屬離子和食源性病原體等快速檢測[42]。隨著相關(guān)研究的不斷發(fā)展，液滴微流控-SERS技術(shù)有望在食品農(nóng)產(chǎn)品安全、臨床診斷、生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域發(fā)揮更多作用，以保障人類的健康和安全。

4 總結(jié)

液滴微流控-SERS 技術(shù)具有其獨(dú)特技術(shù)優(yōu)勢。結(jié)合采用液滴微流控技術(shù)， 有極大潛力克服傳統(tǒng)拉曼光譜檢測重現(xiàn)性、靈敏度、穩(wěn)定性等不足。 液滴微反應(yīng)器提供了均勻穩(wěn)定的微環(huán)境， 可改善拉曼檢測結(jié)果的重復(fù)性和記憶效應(yīng)。 微米級液滴的高界面面積和微反應(yīng)器中快速混合， 大大提高了化學(xué)反應(yīng)效率和SERS 檢測通量。此外，液滴微流控技術(shù)還能可控制備具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的SERS 活性微粒， 進(jìn)一步提升了檢測重復(fù)性和靈活性。 液滴微流控-SERS 技術(shù)在化學(xué)反應(yīng)過程原位監(jiān)測、 單細(xì)胞分選和分子分析和體液小分子快速檢測中的成功應(yīng)用， 已顯出其良好的技術(shù)特性。 可以預(yù)見， 基于液滴微流控-SERS技術(shù)完全能研制出更多功能模塊，從而研發(fā)出快速、便攜化檢測設(shè)備，并應(yīng)用于食品農(nóng)產(chǎn)品安全、臨床診斷、生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域快速檢測。