豬肉中三種β-受體激動(dòng)劑殘留物表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)研究

裴佳歡 盛萬里 鄒明強(qiáng) 齊小花*

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院& 國家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品質(zhì)量與安全） 北京 100176；2.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部；3.呼和浩特海關(guān)技術(shù)中心）

0 引言

β-受體激動(dòng)劑類物質(zhì)（別名瘦肉精）是一類具有腎上腺素功能的化合物， 對(duì)動(dòng)物體內(nèi)營養(yǎng)再分配具有促進(jìn)作用，可促進(jìn)蛋白質(zhì)合成[1]。 這類物質(zhì)通常按結(jié)構(gòu)可分為苯胺型、苯酚型和苯二酚型等三大類，在臨床上主要用于治療哮喘、 慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）等呼吸系統(tǒng)疾病， 在動(dòng)物飼養(yǎng)中， 由于具有減少脂肪積累、促進(jìn)蛋白質(zhì)生成和提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用，曾被添加到動(dòng)物飼料中以提高牲畜瘦肉率[2]。

常見的β-受體激動(dòng)劑類物質(zhì)有萊克多巴胺、沙丁胺醇、克倫特羅、西馬特羅等[3]。 該類物質(zhì)被錯(cuò)誤地應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖中，引發(fā)一系列因食用含β-受體激動(dòng)劑的食物而中毒的事件， 導(dǎo)致人體心血管和神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)，嚴(yán)重危害健康[4]。 豬肉中的瘦肉精在豬體內(nèi)的使用已被大多數(shù)國家和地區(qū)（如美國、日本和歐盟）禁止。為了確保動(dòng)物源性食品安全，我國農(nóng)村農(nóng)業(yè)部在2020 年頒布的《食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》 中明令禁止使用該類藥物，規(guī)定在動(dòng)物源性食品中不得檢出。但是，仍有一些不法商家受利益驅(qū)動(dòng)，在養(yǎng)殖過程中違法添加。 2021 年的“央視3·15 晚會(huì)”再次曝光了某省黑心養(yǎng)殖戶為提高出肉率， 增加利潤而在飼養(yǎng)過程中添加“瘦肉精”的違法行為。該類事件屢次發(fā)生，引起了公眾的廣泛關(guān)注。因此，有必要盡快建立動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑類物質(zhì)的檢測(cè)方法，為食品安全檢測(cè)提供技術(shù)支持。

目前，β-受體激動(dòng)劑常見的檢測(cè)方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6]、高效液相色譜法[7]、酶聯(lián)免疫法[8]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[9]和電化學(xué)法[10]等。常用的色譜法存在一定的缺陷，如操作復(fù)雜、成本較高、前處理繁瑣、實(shí)驗(yàn)儀器復(fù)雜等。 因此，建立一種簡單高效、 靈敏度高且適用于現(xiàn)場(chǎng)快檢的獸藥殘留方法尤為重要[11]。

表面增強(qiáng)拉曼光譜作為一種快速檢測(cè)化學(xué)危害物的工具，能夠提供豐富的目標(biāo)物分子指紋圖譜，并且靈敏度高， 已用于肉類中獸藥殘留的檢測(cè)[12]。SERS 技術(shù)是指待測(cè)分子處于貴金屬表面， 在電磁場(chǎng)和化學(xué)增強(qiáng)的作用下， 產(chǎn)生拉曼散射信號(hào)顯著增強(qiáng)的現(xiàn)象[13]。 SERS 技術(shù)因其靈敏度高、簡單快捷的優(yōu)點(diǎn)， 被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)農(nóng)獸藥殘留和非法添加劑等領(lǐng)域[14]。 從理論上講，SERS 檢測(cè)技術(shù)與其他檢測(cè)方法相比具有極大優(yōu)勢(shì)， 特別是在復(fù)雜的環(huán)境基質(zhì)中， 納米結(jié)構(gòu)SERS 襯底和便攜式設(shè)備的進(jìn)展將推動(dòng)拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)在快速現(xiàn)場(chǎng)分析中發(fā)揮重要作用[15-18]。 本研究以膠體金溶液為SERS 基底，使用便攜式拉曼光譜儀對(duì)豬肉中的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇進(jìn)行檢測(cè)，建立β-受體激動(dòng)劑與SERS 強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

氯金酸（HAuCl4，99%）、檸檬酸三鈉（99.8%）（Sigma 公司）；克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品（BIOFOUNT 范德（北京）生物科技有限責(zé)任公司）；甲醇、乙酸乙酯（色譜純，北京化工廠）；鹽酸、碳酸鈉（分析純， 麥克林）。 所有溶液配制使用超純水（18.3 MΩ）。

1.2 儀器

便攜式拉曼光譜儀（奧譜天成（廈門）科技有限公司）；Renishaw invia 共聚焦拉曼光譜儀（Renishaw公司）；XH-100A 微波合成萃取儀（北京祥鵠科技有限公司）；JEM-2100 透射電子顯微鏡（JEOL 公司）；U-3310 雙光束紫外分光光度計(jì)（Hitachi Limited 公司）。

本研究采用的便攜式拉曼光譜儀參數(shù)設(shè)置為激光功率500 mW，積分時(shí)間為10 s。 雙光束紫外分光光度計(jì)采集膠體金的光譜范圍為400～850 nm。

1.3 膠體金的合成

AuNPs 的合成如FRENS[19]所描述，利用改良的檸檬酸三鈉還原法制備膠體金（AuNPs）。將1%的氯金酸溶液1 mL 加入99 mL 去離子水中，在微波合成萃取儀中加熱攪拌；溫度上升至98℃時(shí)，穩(wěn)定溫度5 min， 隨后迅速加入1%檸檬酸三鈉溶液1.4 mL，繼續(xù)保持溫度，加熱攪拌5 min；顏色呈酒紅色后取出，冷卻至室溫，存放在4℃冰箱內(nèi)備用。

1.4 樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取0.01 g 的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的標(biāo)準(zhǔn)品于3 支10 mL 的離心管中，用甲醇溶劑[20]分別配制成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密閉保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)過程中，再用超純水稀釋成所需濃度使用液。

1.5 光譜采集

在采集樣品光譜時(shí)，先將200 μL 的標(biāo)準(zhǔn)品水溶液和pH 值為4 濃度為1%的NaCl 水溶液混合均勻，再將800 μL 的膠體金加入到混合液中進(jìn)行檢測(cè)。加入NaCl 溶液可使膠體金顆粒發(fā)生聚沉。 每種β-受體激動(dòng)劑選取5 個(gè)樣品的不同濃度梯度進(jìn)行拉曼光譜采集，每個(gè)樣品采集5 次。

1.6 樣品前處理

基于液-液萃取[21]方法進(jìn)行，并簡化步驟。 稱取從市場(chǎng)選購的新鮮生豬肉 （不取白色脂肪組織）2.00 g 樣品，充分剪碎后放入15 mL 離心管中；加入2 mL 10%的碳酸鈉溶液， 將混合物渦旋混合2 min；加入2 mL 乙酸乙酯溶劑， 混合1 min； 將萃取液以10 000 r/min 離心2 min， 取上清液1 mL 于2 mL 離心管中；加入1mL 0.05mol/L 的鹽酸，渦旋混合1 min；自然靜置分層，棄去上層液，取下層液體為待測(cè)液，冷凝至干燥。 在使用時(shí)， 加入2 mL 超純水重新溶解，存放于4℃冰箱內(nèi)備用。

用超純水將1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成2、4、6、8、10 μg/mL 4 個(gè)不同濃度。 取200 μL 4 個(gè)不同濃度的標(biāo)品溶液加入到處理后的樣品中，制備含有2、4、6、8、10 μg/mL β-受體激動(dòng)劑的豬肉樣品，用實(shí)際添加的β-受體激動(dòng)劑與豬肉質(zhì)量的質(zhì)量比計(jì)算制備豬肉樣品中的β-受體激動(dòng)劑含量。每種濃度制備3 個(gè)平行豬肉樣品，并取其平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 膠體金的表征

膠體金的光學(xué)性質(zhì)可以用紫外/可見吸收光譜進(jìn)行表征，如圖1 所示，紫外可見吸收峰的出峰位置在520 nm 處。 利用峰的位置和峰寬可以估計(jì)膠體金的粒徑和分散性，隨著顆粒尺寸的增大，膠體金的吸收峰逐漸紅移，吸收峰也越來越小[22]，尺寸和分散性隨之增加。膠體金的TEM 圖像如圖2 所示，可見膠體金的大小和形狀是均勻的，同時(shí)也具備較好的分散性。

圖1 膠體金的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV-VIS absorption spectrum of colloidal gold

圖2 Au NPs 的TEM 圖像Fig.2 TEM images of Au NPs

2.2 固體β-受體激動(dòng)劑SERS 光譜

當(dāng)目標(biāo)物被吸附或者靠近金屬納米的表面時(shí)，拉曼信號(hào)強(qiáng)度會(huì)明顯放大[23]。3 種β-受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)品拉曼光譜如圖3 所示，從圖3 可以看出，原始光譜出現(xiàn)了漂移現(xiàn)象， 表明固體標(biāo)準(zhǔn)品粉末分散在硅片上進(jìn)行檢測(cè)時(shí)易受到多種因素的干擾而出現(xiàn)漂移現(xiàn)象，會(huì)對(duì)后續(xù)建立定量分析方法造成誤差，故選用液相基質(zhì)的檢測(cè)環(huán)境，以更好地實(shí)現(xiàn)定性定量檢測(cè)。

圖3 3 種β-受體激動(dòng)劑固體拉曼光譜圖Fig.3 Solid Raman spectra of three beta-agonists

2.3 β-受體激動(dòng)劑SERS 光譜分析

克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇都屬于傳統(tǒng)的瘦肉精[24]，這3 種β-受體激動(dòng)劑在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有一定的相似度， 在SERS 檢測(cè)中也存在相似的信號(hào)特征峰， 在強(qiáng)度上各有不同。 由于苯環(huán)上取代基不同，3 種β-受體激動(dòng)劑有不同的SERS 特征峰?？藗愄亓_特征峰有382、787、1 260、1 478、1 602 cm-1等波段，382cm-1處的峰由苯環(huán)耦合C-C-Cl 彎曲振動(dòng)引起，787 cm-1處的峰由C-Cl 伸縮振動(dòng)引起，1 260 cm-1處的峰由C-N 伸縮引起，1 478 cm-1處的峰由-CH3彎曲振動(dòng)引起，1 602 cm-1處的峰由苯環(huán)上C=C 拉伸。萊克多巴胺的特征峰有831、1 170、1 265、1 502、1 592 等波段，831 cm-1處的峰由苯環(huán)中C-H 非平面彎曲振動(dòng)引起。 沙丁胺醇特征峰有621、814、1 253、1 489、1 609 cm-1等波段，621 cm-1處的峰由脂肪族的扭動(dòng)引起，1 253 cm-1處的峰由C-C3伸縮振動(dòng)、C-N 伸縮振動(dòng)以及O-H 彎曲振動(dòng)引起。由特征峰數(shù)據(jù)對(duì)比可得，β-受體激動(dòng)劑結(jié)合膠體金的拉曼光譜與固體標(biāo)準(zhǔn)品粉末光譜曲線相比， 拉曼位置存在偏移，這可能是由于某些化學(xué)鍵的水解所致。而膠體金在400～2 500 cm-1范圍內(nèi)無明顯特征峰， 故不會(huì)影響目標(biāo)物的檢測(cè)。 β-受體激動(dòng)劑吸附于膠體金表面形成“熱點(diǎn)”，結(jié)合后產(chǎn)生表面增強(qiáng)現(xiàn)象。

拉曼光譜強(qiáng)度受膠體金與樣品體積比和活性劑濃度的影響。 首先， 對(duì)膠體金與樣品體積比進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3∶1 的體積比為最優(yōu)條件，此時(shí)各波段的拉曼強(qiáng)度最大，增強(qiáng)效果呈現(xiàn)先增后減的情況，這是因?yàn)殡S著待測(cè)樣品體積的增加， 金納米顆粒會(huì)逐漸被稀釋，不利于“熱點(diǎn)”的形成。 另外，隨著總體積的增大，散射光會(huì)被納米球表面反射，穿透樣品后造成一定程度的丟失，致使拉曼光譜強(qiáng)度降低。

NaCl 可以改變金納米顆粒與待測(cè)物之間的電荷平衡，促進(jìn)顆粒之間的聚集。 一定量的NaCl 溶液可以增強(qiáng)拉曼光譜信號(hào)，當(dāng)濃度超過某一臨界點(diǎn)時(shí)，高濃度的NaCl 溶液會(huì)使金納米顆粒開始積聚沉淀，無法實(shí)現(xiàn)信號(hào)增強(qiáng)的效果。因此，金納米、待測(cè)樣品、NaCl 三者的體積比為3∶1∶1， 此時(shí)3 種β-受體激動(dòng)劑的信號(hào)增強(qiáng)效果最好。

在最優(yōu)條件下， 配置了濃度為1～105ng/mL 的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液，均選用便攜式光譜儀進(jìn)行檢測(cè)?？藗愄亓_不同濃度的拉曼光譜如圖4 可見， 峰強(qiáng)隨濃度降低而降低，以1 260 cm-1處特征峰峰面積（y）對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.014 28+0.390 21lgx，R2=0.994 65。

圖4 克倫特羅拉曼光譜圖Fig.4 Kraent Rohmann spectrogram

圖5 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Kraent standard curve

沙丁胺醇不同濃度的拉曼光譜如圖6 可見，峰強(qiáng)隨濃度降低而降低，以1 609 cm-1處特征峰峰面積（y）對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖7 所示， 標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.005 99+0.009 681lgx，R2=0.991 46。

圖6 沙丁胺醇拉曼光譜圖Fig.6 Salbutamol Raman spectra

圖7 沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Salbutamol standard curve

萊克多巴胺不同濃度的拉曼光譜如圖8 可見，以831 cm-1處特征峰峰面積（y）對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖9 所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.003 87+0.006 863 1lgx，R2=0.996 61。

圖8 萊克多巴胺拉曼光譜圖Fig.8 Ractopamine Raman spectra

圖9 萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Ractopamine standard curve

2.4 豬肉中β-受體激動(dòng)劑定量分析

豬肉作為一類復(fù)雜的食品類別，含有的蛋白質(zhì)、脂肪多種成分易對(duì)拉曼信號(hào)造成嚴(yán)重影響，導(dǎo)致目標(biāo)物分子與金溶膠無法完全結(jié)合，將目標(biāo)物拉曼特征峰信號(hào)減弱或者掩蓋。 因此，樣品前處理是很關(guān)鍵的一步。我們分別制備了3 種β-受體激動(dòng)劑的不同濃度（2、4、6、8、10 μg/g）豬肉樣品進(jìn)行分析，經(jīng)過方法優(yōu)化，最終選用乙酸乙酯和10%碳酸鈉溶液作為萃取劑，以金溶膠為增強(qiáng)底物，1% NaCl 溶液為聚集物，采集SERS 光譜，計(jì)算回收率。乙酸乙酯可以去除豬肉組織中多余的脂肪，在較短的時(shí)間里，去除雜質(zhì)，并且其本身具有揮發(fā)性，與金溶膠混合后，迅速揮發(fā)。 選取乙酸乙酯作為提取劑，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)造成影響和干擾。 以3 種β-受體激動(dòng)劑在1 260 cm-1、1 609 cm-1、831 cm-1的峰進(jìn)行定性定量， 計(jì)算各自的平均回收率，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)量5 次。結(jié)果如表1 所示。 回收率均在80.3%～98.9%，RSD 在1.12%～3.26%，豬肉中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的檢出限為1 ng/mL。

表1 3 種β-受體激動(dòng)劑檢出限、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 1 Detection limits，recovery rates and relative standard deviations of three beta-agonists （n=5）

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測(cè)豬肉中3 種β-受體激動(dòng)劑殘留物的方法。該方法利用檸檬酸三鈉還原氯金酸制備膠體金顆粒，結(jié)合快速前處理技術(shù)，操作步驟簡單，分析速度快。在最優(yōu)條件下，建立了3 種β-受體激動(dòng)劑殘留物特征峰拉曼強(qiáng)度與濃度（1～105ng/mL）的良好線性關(guān)系（R2值均在0.99 以上），開發(fā)了一種簡便、靈敏的快速檢測(cè)方法，可用于市場(chǎng)上精豬肉的快速篩查，對(duì)提升動(dòng)物源性食品的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)能力發(fā)揮支撐作用。