基于數(shù)字微流控芯片平臺(tái)進(jìn)行動(dòng)物源性成分快速初篩的應(yīng)用研究

汪菊 王維霞 姜永莉 陳天藍(lán) 梁譽(yù)斌 楊丁一 王苗苗 鄒明強(qiáng)

（1．綿陽(yáng)市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所 四川綿陽(yáng) 621050；2．中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；3．吉林國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心；4.珠海市迪奇孚瑞生物科技有限公司）

0 引言

隨著涮肉、燒烤、火鍋的興起，牛肉、羊肉、鴨血市場(chǎng)消費(fèi)群體在快速擴(kuò)大，但目前其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到市場(chǎng)需求，肉制品、鴨血成為在食品生產(chǎn)、加工、流通及餐飲領(lǐng)域中造假摻假的主要目標(biāo)[1-2]。 部分不法企業(yè)和商販用低價(jià)肉或非肉成分冒充高價(jià)肉，在牛肉、羊肉、鹿肉等高價(jià)肉制品中摻雜雞肉、鴨肉等低價(jià)肉及采用廉價(jià)的雞血、牛血、豬血等動(dòng)物血冒充鴨血，這些造假摻假的欺詐違法行為對(duì)人民健康、消費(fèi)者權(quán)益、 市場(chǎng)公平交易機(jī)制及宗教信仰等造成巨大威脅[3-4]，已成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。

近年來(lái)，以蛋白質(zhì)和核酸為基礎(chǔ)的肉類摻假檢測(cè)技術(shù)逐漸興起，研究表明，利用免疫學(xué)方法可以定量地測(cè)定出動(dòng)物源成分[5-8]。 其中微孔板ELISA 在定量靶標(biāo)表征上有較高的精確度[9-10]。 Macedo-Silva 等[11]采用ELISA 檢測(cè)法制作牛、馬、豬、雞蛋白的抗血清來(lái)鑒別漢堡中可能摻入的廉價(jià)肉類成分， 靈敏度為0.6%。 胡連霞等[12]研究發(fā)現(xiàn)，GNM C7-8 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)法能夠?qū)ν瑫r(shí)添加4 類假肉的成分進(jìn)行檢測(cè)，使檢測(cè)速率得到進(jìn)一步提高。但這些傳統(tǒng)的動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法仍存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、效率低、成本高等問(wèn)題，難以滿足批量大、操作簡(jiǎn)便、現(xiàn)場(chǎng)快速的檢測(cè)要求?；谝陨显?，建立一種快速、即時(shí)、高效、成本低且適于大批量樣本的檢測(cè)方法迫在眉睫。本文運(yùn)用數(shù)字微流控芯片平臺(tái)并結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR）對(duì)牛肉、羊肉、鴨血樣品進(jìn)行源性成分初篩檢測(cè)，并與GB/T 38164—2019 和SN/T 2051—2008標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比對(duì)。

1 數(shù)字微流控芯片平臺(tái)原理

1.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)LAMP （loop-mediated isothermal amplification）原理

為克服傳統(tǒng)PCR 技術(shù)的反復(fù)升降溫過(guò)程，數(shù)字微流控芯片平臺(tái)應(yīng)用了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)LAMP（loop-mediated isothermal amplification）技術(shù)，使實(shí)驗(yàn)過(guò)程快速、簡(jiǎn)便，儀器便攜，檢測(cè)結(jié)果特異性強(qiáng)、靈敏度高。

LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系主要包括核苷酸、Bst DNA聚合酶、 引物組和含有鎂離子的反應(yīng)緩沖液。 Bst DNA 聚合酶由嗜硬脂芽孢桿菌中分離得到，具有鏈置換活性和5′-3′聚合酶活性的耐熱DNA 聚合酶，但缺乏任何3′-5′外切酶活性，因此不會(huì)水解先前合成的DNA 鏈[13]。 LAMP 擴(kuò)增一般需要4～6 個(gè)特異性引物， 靶向DNA 上有6 個(gè)不同區(qū)域（F3c、F1c、F2c、B2c、B1c 和B3c）。 該組引物包括2 個(gè)內(nèi)部引物，稱為正向內(nèi)部引物（FIP）和反向內(nèi)部引物（BIP），而F3和B3 是2 個(gè)外部引物，也稱為“置換引物”（圖1，擴(kuò)增過(guò)程使用恒溫60～65°C 進(jìn)行快速連續(xù)擴(kuò)增，無(wú)需變性或退火）[14]。

圖1 靶向DNA 的6 個(gè)不同區(qū)域（F3c、F1c、F2c、B2c、B1c 和B3c）；正向內(nèi)部引物（FIP），反向內(nèi)部引物（BIP）；正向外部引物F3 和反向外部引B3Fig.1 Targeting six different regions on the DNA（F3c、F1c、F2c、B2c、B1c and B3c），F(xiàn)orward inner primer（FIP），Reverse internal primers（BIP），F(xiàn)orward external primer F3 andReverse external reference B3

LAMP 反應(yīng)分3 步完成， 即起初反應(yīng)物模板合成、循環(huán)擴(kuò)增及延伸和再循環(huán)。

1.1.1 反應(yīng)模板合成階段

內(nèi)部引物FIP 和模板DNA 的F2c 區(qū)段結(jié)合，啟動(dòng)互補(bǔ)鏈的合成；F3 與模板鏈上F3c 區(qū)段結(jié)合，通過(guò)Bst 酶引發(fā)鏈置換反應(yīng)，與模板DNA 形成雙鏈結(jié)構(gòu)，并釋放內(nèi)部引物FIP 置換合成的互補(bǔ)鏈；FIP 延伸單鏈5′端F1 序列以與F1c 序列堿基互補(bǔ)，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

內(nèi)部引物BIP 以與模板DNA 互補(bǔ)的FIP 延伸單鏈為模板，啟動(dòng)互補(bǔ)鏈的合成，形成雙鏈DNA；B3插入雙鏈DNA 中，與FIP 延伸鏈的B3c 區(qū)段結(jié)合，引發(fā)鏈置換反應(yīng)， 釋放出兩端具有互補(bǔ)區(qū)域的DNA，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的起始反應(yīng)模板[15]。

1.1.2 循環(huán)擴(kuò)增階段

啞鈴型結(jié)構(gòu)中，以F1 片段的3′端為起點(diǎn)，以自身為模板進(jìn)行DNA 合成延伸。 同時(shí)，F(xiàn)IP 引物的F2與啞鈴環(huán)上的單鏈F2c 雜交， 開始新一輪的鏈置換反應(yīng)。 解離由F1 片段合成的雙鏈核酸，解離出的單鏈核酸上會(huì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)[15]。

1.1.3 延伸和再循環(huán)階段

環(huán)狀結(jié)構(gòu)上有單鏈形式的B2c，BIP 引物上的B2 與其雜交，開始新一輪擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)一系列放大，形成新的產(chǎn)物鏈和雙鏈長(zhǎng)度延伸的錘狀結(jié)構(gòu)， 并將以同樣方式進(jìn)一步延伸。隨后的循環(huán)反應(yīng)，莖的長(zhǎng)度和環(huán)的數(shù)量逐漸增加， 最終產(chǎn)物是莖環(huán)DNA 的混合物， 即含有數(shù)個(gè)莖長(zhǎng)度和椰菜花狀結(jié)構(gòu)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖2）[16-17]。

圖2 反應(yīng)物模板合成；循環(huán)擴(kuò)增階段以及延伸和再循環(huán)Fig.2 Reactant template synthesis；Cyclic amplification stages as well as elongation and recirculation

1.2 數(shù)字型微流控芯片結(jié)構(gòu)及運(yùn)行

本研究采用數(shù)字微流控Virus Hunter 檢測(cè)設(shè)備及動(dòng)物源性6 項(xiàng)成分核酸檢測(cè)芯片試劑盒。

動(dòng)物源性6 項(xiàng)成分核酸檢測(cè)芯片的工作原理是： 當(dāng)一個(gè)液滴覆蓋2 個(gè)電極時(shí)， 其中一個(gè)電極通電，EWOD 力將液滴從未帶電的電極拖到帶電的電極上。 檢測(cè)芯片結(jié)構(gòu)如圖3 所示，分為加樣區(qū)、移液區(qū)、分液區(qū)和反應(yīng)區(qū)。

圖3 數(shù)字型微流控恒溫?cái)U(kuò)增芯片結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Structure diagram of digital microfluidic thermostatic amplification chip

待測(cè)樣本核酸與擴(kuò)增反應(yīng)試劑的混合液從加樣區(qū)通過(guò)電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)力移動(dòng)至分液區(qū)， 再通過(guò)特殊的電極將液滴平均分成5 μL 體積，并移動(dòng)至芯片反應(yīng)區(qū)的反應(yīng)點(diǎn)上與預(yù)存的檢測(cè)試劑融合進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。芯片的反應(yīng)點(diǎn)上存儲(chǔ)了檢測(cè)目標(biāo)動(dòng)物源性引物檢測(cè)試劑，不同反應(yīng)點(diǎn)分別檢測(cè)不同目標(biāo)動(dòng)物源性基因，因此能夠同時(shí)對(duì)不同目標(biāo)動(dòng)物源性基因進(jìn)行多靶點(diǎn)檢測(cè)。 檢測(cè)芯片的反應(yīng)點(diǎn)通過(guò)發(fā)熱絲加熱給反應(yīng)區(qū)提供熱量至恒溫?cái)U(kuò)增所需溫度， 通過(guò)熒光讀取檢測(cè)信號(hào)，用于結(jié)果判斷。

1.3 數(shù)字微流控芯片平臺(tái)快速篩查檢測(cè)原理

數(shù)字微流控芯片平臺(tái)快速篩查檢測(cè)是運(yùn)用數(shù)字微流控介電潤(rùn)濕型液滴操縱技術(shù)，利用液滴在疏水化表面介電潤(rùn)濕現(xiàn)象，通過(guò)控制微電極陣列上液滴接觸角變化，實(shí)現(xiàn)離散液滴精確控制。 該快速檢測(cè)技術(shù)既有樣品消耗量少、熱轉(zhuǎn)換快速的特點(diǎn)，又有高平行性和自動(dòng)化功能，同時(shí)不依賴微泵、微閥或微混合器等元件，無(wú)需復(fù)雜的三維流體體通道，具有構(gòu)建簡(jiǎn)單、可動(dòng)態(tài)配置的優(yōu)點(diǎn)。因此特別適用于高集成度、高性能、操作復(fù)雜的生物、化學(xué)微全分析體系，見(jiàn)圖4。

圖4 數(shù)字微流控芯片平臺(tái)檢測(cè)多種動(dòng)物源性成分示意圖Fig.4 Digital microfluidic chip platform for the detection of various animal-derived components process diagram

當(dāng)檢測(cè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的曲線為S 型擴(kuò)增曲線時(shí)， 則表示該檢測(cè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的待測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性； 當(dāng)檢測(cè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的曲線無(wú)S 型擴(kuò)增曲線時(shí)， 則表示該檢測(cè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的待測(cè)結(jié)果為陰性。 如圖5 所示，該結(jié)果表明，豬動(dòng)物源性成分、牛動(dòng)物源性成分均為陽(yáng)性，雞、鴨、鵝及羊動(dòng)物源性成分均為陰性。

圖5 微流控芯片平臺(tái)檢測(cè)多種動(dòng)物源性成分結(jié)果圖Fig.5 Results of various animal-derived components detected by microfluidic chip platform

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器設(shè)備與材料

熒光定量PCR 儀（德國(guó)耶拿公司）；Virus Hunter檢測(cè)設(shè)備（中檢國(guó)研（北京）科技有限公司）；動(dòng)物源性6 項(xiàng)成分核酸檢測(cè)芯片試劑盒（雞、鴨、鵝、豬、牛、羊恒溫?zé)晒夥?，械檢科技（北京）有限公司）；動(dòng)物組織基因組DNA 快速提取試劑盒（含Buffer A、Buffer B 等，械檢科技（北京）有限公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品準(zhǔn)備

隨機(jī)采購(gòu)市售牛肉、 羊肉、 鴨血樣品共100 批次，其中牛肉49 批次，羊肉20 批次，鴨血31 批次。

2.2.2 樣品預(yù)處理

取樣要求：對(duì)于整塊組織樣品，剪取樣品的中心組織成分5～10 g；對(duì)于小切塊的混合樣品，選取若干小塊樣品，各切塊分別剪取其中心組織1～2 g，混合各組分對(duì)于加工樣品如肉卷、肉片、肉丸等樣品，選取若干片/個(gè)組分，混合各組分；對(duì)于粉碎加工的肉沫樣品，在樣品5 個(gè)不同部位分別稱取1～2 g，混合各組分。

均質(zhì)處理： 使用均質(zhì)機(jī)對(duì)上述樣品進(jìn)行破碎處理，轉(zhuǎn)移破碎后的樣品5 g 至無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入10 mL 生理鹽水進(jìn)行均質(zhì)混勻。

2.2.3 基因組DNA 提取及檢測(cè)

取均質(zhì)處理后的均質(zhì)組織20～30 mg，轉(zhuǎn)移至離心管A 中，加入500 μL Buffer A，震蕩混勻，80℃下熱浴10～15 min。 熱浴完成后，取10 μL 上清液至離心管B 中，加入90 μL Buffer B 進(jìn)行中和混勻，中和后的液體即為DNA 溶液。按照動(dòng)物源性6 項(xiàng)成分核酸檢測(cè)芯片試劑盒（雞、鴨、鵝、豬、牛、羊恒溫?zé)晒夥ǎ┦褂谜f(shuō)明書進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)（于潔凈環(huán)境下操作）。

3 結(jié)果與分析

3.1 數(shù)字微流控芯片平臺(tái)快速篩查檢測(cè)法

本實(shí)驗(yàn)共采購(gòu)樣品100 批次， 采用2.2 方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，14 批次明示肉源結(jié)果的樣品（牛肉3 批次，羊肉4 批次，鴨血7 批次）中，鴨血的陽(yáng)性檢出率為22.5%， 牛肉、 羊肉的陽(yáng)性檢出率分別為6.1%和20.0%， 且所有樣品均未檢測(cè)出雞源性成分及鵝源性成分，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 14 批與明示肉源不符合的樣品檢測(cè)結(jié)果Table 1 Test results of 14 batches of samples that do not match the stated meat source

3.2 與實(shí)時(shí)熒光PCR 法對(duì)比

根據(jù)3.1 可知， 本次檢測(cè)出的肉源性成分只有牛動(dòng)物源性成分、羊動(dòng)物源性成分、鴨動(dòng)物源性成分及豬動(dòng)物源性成分。因此，本文按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 38164—2019 《常見(jiàn)畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR 法》[18]和SN/T 2051—2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)PCR法》[19]只對(duì)牛、羊、鴨、豬等4 種動(dòng)物源性成分進(jìn)行了確證檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。 其中，按照GB/T 38164—2019 方法對(duì)鴨、豬動(dòng)物源性成分進(jìn)行檢測(cè)，按照SN/T 2051—2008 方法對(duì)牛、羊動(dòng)物源性成分進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。 結(jié)果顯示，其中有3 組樣品檢測(cè)結(jié)果有所差異，采用數(shù)字微流控芯片平臺(tái)快速篩查檢測(cè)法未在羊肉、羊肉串、羔羊肉片中檢測(cè)出羊動(dòng)物源性成分，而采用PCR 法檢測(cè)羊動(dòng)物源性成分結(jié)果為陽(yáng)性。

表2 數(shù)字微流控芯片平臺(tái)-快速檢測(cè)法及實(shí)時(shí)熒光PCR 法的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Table 2 Comparison of detection results by digital microfluidic chip platform-rapid detection method and real-time fluorescent PCR method

由表2 可知，數(shù)字微流控芯片平臺(tái)快速篩查檢測(cè)法經(jīng)與實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，出現(xiàn)3 組結(jié)果偏差。 引起偏差的原因可能是數(shù)字微流控芯片平臺(tái)快速篩查檢測(cè)法與SN/T 2051—2008 檢測(cè)方法的檢出限有差異，快速篩查檢測(cè)法與實(shí)驗(yàn)室確證檢測(cè)法相比不夠靈敏（見(jiàn)表3），具體原因有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。 從總的對(duì)比數(shù)據(jù)來(lái)看，數(shù)字微流控芯片平臺(tái)快速篩查檢測(cè)法的大部分檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光PCR 法吻合度較好，可用于樣品中動(dòng)物源性成分的快速篩查檢測(cè)。

表3 不同檢測(cè)方法的檢出限Table 3 Detection limits of different detection methods

4 討論

目前，牛肉、羊肉和鴨血的摻假問(wèn)題仍很嚴(yán)重，隨著人們對(duì)食品安全重視程度的提高， 確保動(dòng)物源性成分真實(shí)屬性的摻假檢測(cè)越來(lái)越重要。 盡管已有多種各具特點(diǎn)的核酸分析新技術(shù)用于動(dòng)物源性成分摻假檢測(cè)，但建立一種低成本、快速篩查檢測(cè)方法對(duì)市場(chǎng)摻假檢測(cè)監(jiān)管尤為重要。

數(shù)字微流控芯片平臺(tái)快速篩查檢測(cè)可同時(shí)對(duì)樣品的雞、鴨、鵝、豬、牛、羊6 項(xiàng)成分進(jìn)行檢測(cè)，全程用時(shí)僅需45～60 min，具有成本低、自動(dòng)化、便攜性好、快速靈活、多靶標(biāo)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。

為了驗(yàn)證數(shù)字微流控芯片平臺(tái)快速篩查檢測(cè)法的準(zhǔn)確性和高效性，本文通過(guò)對(duì)市售牛肉、羊肉、鴨血（共計(jì)100 批次）樣品進(jìn)行快速檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)14 批次問(wèn)題樣品， 采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 38164—2019和SN/T 2051—2008 對(duì)問(wèn)題樣品進(jìn)行確證檢測(cè)，通過(guò)對(duì)2 種檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比分析， 發(fā)現(xiàn)有3 組樣品檢測(cè)結(jié)果存在偏差。 引起偏差的原因可能是實(shí)驗(yàn)室確證檢測(cè)法較快速篩查檢測(cè)法的檢出限更低。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 數(shù)字微流控芯片平臺(tái)快速篩查檢測(cè)法具有快速、高效、成本低且適用于現(xiàn)場(chǎng)操作等特點(diǎn)，既能夠?qū)崿F(xiàn)大批量檢測(cè)，又能保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性， 可滿足市場(chǎng)上動(dòng)物源性成分快速篩查檢測(cè)的需求。當(dāng)然，數(shù)字微流控芯片平臺(tái)在實(shí)際應(yīng)用中也存在一定的局限性，例如，檢出限指標(biāo)尚未達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法水平，上機(jī)檢測(cè)對(duì)環(huán)境要求較高，有待于進(jìn)一步研究完善。

5 建議及措施

5.1 對(duì)監(jiān)管部門建議

（1）加強(qiáng)銷售經(jīng)營(yíng)者監(jiān)管。建議市場(chǎng)監(jiān)管部門加強(qiáng)對(duì)食品經(jīng)營(yíng)者的許可證明及合格證明的監(jiān)管，將動(dòng)物源性成分摻假檢測(cè)納入監(jiān)督抽檢范圍。 對(duì)抽檢中發(fā)現(xiàn)的問(wèn)題牛肉、羊肉及鴨血產(chǎn)品進(jìn)行依法查處，逐級(jí)追溯，直至生產(chǎn)企業(yè)和源頭。

（2）加強(qiáng)生產(chǎn)企業(yè)監(jiān)管。建議加強(qiáng)對(duì)問(wèn)題企業(yè)的監(jiān)管力度，督促牛肉、羊肉及鴨血產(chǎn)品經(jīng)營(yíng)者進(jìn)行自查自糾，規(guī)范進(jìn)貨渠道，主動(dòng)索取并留存《動(dòng)物檢疫合格證明》等證明文件和進(jìn)貨憑證，同時(shí)建立食品安全追溯體系和誠(chéng)信體系，嚴(yán)厲打擊欺詐失信行為，確保食品質(zhì)量安全。

5.2 對(duì)消費(fèi)者購(gòu)買和就餐建議

（1）建議消費(fèi)者外出就餐時(shí)盡量選擇大型正規(guī)和口碑較好的餐館，不要一味追求價(jià)格低廉，避免食用假冒偽劣產(chǎn)品。

（2）消費(fèi)者在購(gòu)買牛肉、羊肉和鴨血等食材時(shí)，可先通過(guò)感官初步辨別真假。新鮮的羊肉呈較均勻的紅色，有光澤，肉質(zhì)堅(jiān)而細(xì)，無(wú)異味；新鮮的牛肉呈暗紅色，肌肉纖維很均勻，有光澤，外表微干，同時(shí)富有彈性，指壓凹陷后立即恢復(fù)，具有牛肉特有的氣味；鴨血呈暗紅色，烹制后彈性較好，用水焯時(shí)不會(huì)掉色，煮熟后表面比較粗糙，且有少量不規(guī)則的氣孔。