知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法及指標(biāo)成分的量值傳遞規(guī)律探索

李鵬躍，趙金榮，2，薛曉霞，代云桃*

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；

2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

湯劑亦稱湯液，是指將飲片加水煎煮，去渣取汁而得到的液體制劑。湯劑是我國(guó)應(yīng)用最早的劑型之一，也是目前中醫(yī)臨床應(yīng)用最廣泛的劑型。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)、臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，參考現(xiàn)代提取方法，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥飲片水煎劑[1]。

知母入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2]，為百合科知母屬植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖，春、秋二季采挖，除去須根和泥沙，曬干；或除去外皮，曬干[3]。知母用藥歷史悠久，是中藥復(fù)方的重要組成藥味之一，具有清熱瀉火、滋陰潤(rùn)燥之效，臨床上用于外感熱病、高熱煩渴、肺熱燥咳、骨蒸潮熱、內(nèi)熱消渴、腸燥便秘[3]。2018年4月國(guó)家中醫(yī)藥管理局同國(guó)家藥品監(jiān)督管理局制定并頒布《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》，其中包含知母的經(jīng)典名方有7 首，包括桂枝芍藥知母湯、清金化痰湯、玉女煎、清骨散、達(dá)原飲、升陷湯、二冬湯[4]。建立知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評(píng)價(jià)方法對(duì)這些經(jīng)典名方中知母藥味的質(zhì)量控制具有重要參考價(jià)值。

現(xiàn)代研究表明，知母所含活性成分主要為皂苷類、黃酮類等，其中皂苷類成分根據(jù)其苷元結(jié)構(gòu)的不同可分為螺甾皂苷、呋甾皂苷兩大類；黃酮類的主要成分為氧雜蒽酮，如芒果苷（MGF）、異芒果苷、新芒果苷等[5-6]。已有文獻(xiàn)報(bào)道知母皂苷BⅡ（TB-Ⅱ）具有抗氧化、抗炎、降糖、抗抑郁等作用[7-10]，MGF具有降血糖、抗炎、抗腫瘤、抑菌等作用[11]。知母藥材中兩者含量均較高，《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版規(guī)定，TB-Ⅱ質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于3%，MGF 質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于0.7%[3]，因此適合作為知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分。知母的產(chǎn)地主要為我國(guó)河北、山西、山東、陜西、甘肅、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林和黑龍江等地，朝鮮也有分布。知母產(chǎn)地最早記載于漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》：“知母，味苦寒……生川谷?！盵2]《名醫(yī)別錄》記載：“知母生河內(nèi)川谷，二月八月采根暴干?！盵12]《本草圖經(jīng)》記載：“知母生河內(nèi)川谷，今瀕河諸郡（今甘肅蘭州）及解州（今山西永濟(jì)）、滁州（今安徽滁州）亦有之?！盵13]《本草蒙筌》記載：“多生徐解二州?！盵14]《藥物出產(chǎn)辨》記載：“知母產(chǎn)直隸東陵西陵最為出名?！盵15]綜上所述，河北易縣所產(chǎn)西陵知母最為道地。西陵知母在河北易縣及其周邊有大量栽培，野生資源較少。野生品主要分布在河北易縣、淶水、淶源、滿城等地的陽坡，栽培品在河北省保定市大部分地區(qū)均有引種，尤以疏松的腐殖質(zhì)壤土栽培為宜?！吨兴幹尽酚涊d：“知母主產(chǎn)于河北易縣、懷來、房山、淶源、承德、張家口，此外山西盂縣、長(zhǎng)治，河南濟(jì)源、林縣、內(nèi)蒙古、甘肅，陜西及東北各省均產(chǎn)。”[16]本研究以知母為研究對(duì)象，購買來自河北、山西、內(nèi)蒙古3 個(gè)產(chǎn)地的10 批知母飲片，以標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑[1]，參考《中國(guó)藥典》2020 年版中知母的含量測(cè)定方法，建立知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量測(cè)定方法，計(jì)算10 批知母湯劑中的指標(biāo)成分（MGF、TB-Ⅱ）的含量及轉(zhuǎn)移率范圍，進(jìn)而分析飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑間指標(biāo)成分的量值傳遞規(guī)律，為制定水煎液及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法提供參考。

1 材料

ACQUITY UPLC H-class 型超高效液相系統(tǒng)[配備光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)器，美國(guó)Waters 公司]；1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；2000 型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器[ELSD，美國(guó)奧泰科技（中國(guó)）有限公司]；HC-3018 型高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；XSR105/A 型十萬分之一電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-500DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DK-98-ⅡA 型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

10 批知母飲片來源信息見表1，經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所代云桃研究員鑒定，飲片基原均為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖。對(duì)照品MGF（批號(hào)：111839-201706，純度：94.5%）、TB-Ⅱ（批號(hào)：111607-201704，純度：94.5%）均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院；水為娃哈哈純凈水；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

表1 知母來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

取知母飲片100 g，置于圓底燒瓶中，加7 倍量水，放置浸泡30 min，加熱沸騰后，文火保持微沸30 min，趁熱濾過，藥渣再加6 倍量水，加熱沸騰后，文火保持微沸30 min，趁熱濾過，合并2 次濾液，并減壓濃縮至500 mL，即得。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的制備

MGF 含量測(cè)定供試品溶液：取所得知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑，用甲醇稀釋20 倍，12 000 r·min–1離 心5 min（離心半徑為5.79 cm），取上清液，即得；TB-Ⅱ含量測(cè)定供試品溶液：取所得知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑，用甲醇稀釋10 倍，12 000 r·min–1離心5 min（離心半徑為5.79 cm），取上清液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取MGF 對(duì)照品適量，加稀乙醇制成1.6 mg·mL–1MGF 對(duì)照品母液。精密稱取TB-Ⅱ?qū)φ掌愤m量，用二甲基亞砜制成1.6 mg·mL–1TB-Ⅱ的對(duì)照品母液。

2.4 指標(biāo)成分色譜分析方法

2.4.1 MGF色譜分析方法

2.4.1.1 色譜條件 HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，10%～13%B；3～6 min，13%～14%B；6～7 min，14%～90%B），柱溫為40 ℃，流速為0.4 mL·min–1，檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm，進(jìn)樣量為1 μL。色譜圖見圖1。

圖1 知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑的MGF含量測(cè)定的UPLC-PDA圖

2.4.1.2 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察：取2.3 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋，得MGF質(zhì)量濃度分別為0.320、0.160、0.128、0.080、0.064、0.032、0.016 g·L–1的溶液，按2.4.1.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得MGF 線性回歸方程為Y=9 744.9X–13.769（r=0.999 6），線性范圍為0.016～0.320 g·L–1。

精密度考察：取ZM09 知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4.1.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算MGF 峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.6%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性考察：取知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑ZM09共6份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4.1.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算MGF 平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.02%，RSD為4.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性考察：取ZM09 知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、1、4、6、8、12、24 h 按2.4.1.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算MGF 峰面積的RSD 為1.5%，表明知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收率試驗(yàn)：取已知MGF含量的ZM09知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑200 μL，按1∶1添加對(duì)照品，按2.2項(xiàng)下方法分別平行制備6份供試品溶液，按2.4.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算MGF的平均加樣回收率為101.68%，RSD為1.1%，說明該方法準(zhǔn)確可靠（表2）。

表2 知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑中MGF含量測(cè)定的加樣回收率試驗(yàn)

2.4.2 TB-Ⅱ色譜分析方法

2.4.2.1 色譜條件 同《中國(guó)藥典》2020 年版方法[3]，采用Thermo Aclaim? RD C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水（25∶75）為流動(dòng)相，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min–1，進(jìn)樣量為10 μL，利用ELSD 檢測(cè)，漂移管溫度為104 ℃，載氣流速為2.8 L·min–1。理論板數(shù)按TB-Ⅱ峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000。色譜圖見圖2。

圖2 知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑的TB-Ⅱ含量測(cè)定的UPLC-ELSD圖

2.4.2.2 線性關(guān)系考察 取2.3 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋，得TB-Ⅱ質(zhì)量濃度分別為1.060、0.530、0.265、0.106、0.053 g·L–1的溶液，按2.4.2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以質(zhì)量濃度的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（Y），得TB-Ⅱ的線性回歸方程為Y=0.945 3X+7.867 7（r=0.997 0），線性范圍為0.053～1.060 g·L–1。

2.5 知母飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑指標(biāo)成分的含量測(cè)定

知母飲片中MGF、TB-Ⅱ的含量測(cè)定方法依照《中國(guó)藥典》2020年版，標(biāo)準(zhǔn)湯劑中MGF、TB-Ⅱ的含量測(cè)定方法依照2.4 項(xiàng)下分析方法測(cè)定。樣品分析結(jié)果顯示，10批知母飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中MGF的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.66%～2.04%和0.88%～1.12%，平均值分別為1.89%和0.98%，均在均值的±30%范圍內(nèi)（分別為1.33%～2.46%和0.69%～1.27%）。10 批知母飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中TB-Ⅱ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.28%～6.81%和0.88%～2.53%，平均值分別4.73%和1.71%，其中3 批知母飲片（ZM07、ZM9、ZM10）中TB-Ⅱ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不在均值的±30%范圍內(nèi)（3.31%～6.15%），表明該研究所用不同產(chǎn)地知母飲片中TB-Ⅱ含量波動(dòng)范圍較大，其中山西萬榮縣知母飲片TB-Ⅱ含量最高；4 批知母湯劑（ZM04、ZM07、ZM9、ZM10）中TB-Ⅱ的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不在均值的±30%范圍內(nèi)（1.20%～2.22%），該結(jié)果可能是由研究所用不同產(chǎn)地知母飲片中TB-Ⅱ含量的波動(dòng)大所致。

2.6 知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑其他質(zhì)量屬性測(cè)定

按公式（1）計(jì)算指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率。

式中W表示1 g 飲片經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑提取出的MGF或TB-Ⅱ的質(zhì)量，M表示1 g 飲片按《中國(guó)藥典》2020 年版方法測(cè)定的MGF 或TB-Ⅱ的質(zhì)量（表3）。結(jié)果顯示，10 批知母飲片到湯劑MGF、TB-Ⅱ的轉(zhuǎn)移率分別為45.83%～57.27% 和26.94%～43.49%，平均值分別為51.87%和35.72%，均在其均值的±30%范圍內(nèi)（36.31%～67.43%、25.01%～46.44%）。

表3 知母含量測(cè)定與湯劑特征參數(shù)結(jié)果

分別取2.1 項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)湯劑50 mL，90 ℃干燥至恒重，稱取浸膏的質(zhì)量，根據(jù)公式（2）計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率。

結(jié)果顯示，10批知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率為29.0%～45.0%，平均值為37.2%（表3），均在其均值的±30%范圍內(nèi)（26.0%～48.4%）。

將pH 計(jì)校正，吸取2.1 項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)湯劑，在25 ℃條件下測(cè)定其pH，平行測(cè)定3 次，取平均值（表3）。結(jié)果顯示，10 批知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑的pH 為4.96～5.40，平均值為5.17，均在其均值的±30%范圍內(nèi)（3.62～6.73）。

3 討論

本研究于《中國(guó)藥典》2020 年版知母藥材含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上建立知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑中TB-Ⅱ的HPLC-ELSD 含量測(cè)定方法，以及知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑中MGF 的HPLC-PDA 含量測(cè)定方法。優(yōu)化了MGF 分析的流動(dòng)相和洗脫條件，方法學(xué)考察結(jié)果顯示所建立的MGF含量測(cè)定方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，能用于知母準(zhǔn)湯劑中MGF的含量測(cè)定。

轉(zhuǎn)移率反映了標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝對(duì)指標(biāo)成分的影響，也反映了制備工藝的穩(wěn)定性。而標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)成分的含量與所用飲片中指標(biāo)成分的含量密切相關(guān)。10 批知母湯劑中的指標(biāo)成分的含量及轉(zhuǎn)移率結(jié)果顯示，知母飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑中分別有3、4 批樣品的TB-Ⅱ不在其均值的±30%范圍內(nèi)，該結(jié)果表明本研究所用不同產(chǎn)地知母飲片中TB-Ⅱ含量波動(dòng)范圍較大[17]。但是TB-Ⅱ、MGF 從10 批知母飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的轉(zhuǎn)移率范圍在均值的±30%范圍內(nèi)，提示TB-Ⅱ、MGF 在知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備過程中轉(zhuǎn)移情況穩(wěn)定，表明本研究所用的標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝參數(shù)穩(wěn)定。上述結(jié)果提示不同產(chǎn)地引起的知母飲片中TB-Ⅱ的含量波動(dòng)會(huì)傳遞到知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑中[17]。因此，在后續(xù)知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑及所有源于知母水煎液的經(jīng)典名方制劑研究中，建議對(duì)知母飲片中的指標(biāo)成分（MGF、TB-Ⅱ）含量范圍進(jìn)行限定或者進(jìn)行混批操作，以縮小原料引起的知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑及經(jīng)典名方制劑質(zhì)量波動(dòng)。

本課題組前期對(duì)15 批二冬湯基準(zhǔn)樣品中知母藥味的指標(biāo)成分（MGF、TB-Ⅱ）質(zhì)量分?jǐn)?shù)及轉(zhuǎn)移率進(jìn)行了分析[18]，二冬湯中包括了天冬、麥冬、天花粉、知母、人參、甘草、荷葉、黃芩8 個(gè)藥味。與知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑相比，二冬湯基準(zhǔn)樣品中MGF轉(zhuǎn)移率的均值降低，而TB-Ⅱ轉(zhuǎn)移率的均值升高，知母飲片在制備為標(biāo)準(zhǔn)湯劑及二冬湯基準(zhǔn)樣品的過程中MGF、TB-Ⅱ 2 個(gè)指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率變化趨勢(shì)不同，推斷導(dǎo)致此結(jié)果的原因可能包括二冬湯基準(zhǔn)樣品其余藥味成分對(duì)知母藥味中成分溶出的影響。除了知母外，二冬湯中天冬、麥冬、天花粉、知母、人參、甘草5 個(gè)藥味均含有皂苷類成分，根據(jù)相似相溶原理，可能這些藥味中皂苷類成分促進(jìn)了知母飲片中皂苷類成分的溶出，從而導(dǎo)致TB-Ⅱ轉(zhuǎn)移率高于知母標(biāo)準(zhǔn)湯劑。因此，在含有同一藥味的不同經(jīng)典名方基準(zhǔn)樣品研究中，不同復(fù)方中同一藥味轉(zhuǎn)移率可能不相同，造成這一現(xiàn)象的原因可能來自復(fù)方中其余藥味飲片成分的影響。