不同光強(qiáng)對柔毛淫羊藿生長特性和淫羊藿酮醇苷含量的影響△

馬文青，徐超群，郭寶林*，張麗娟

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；

2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭葉淫羊藿E.sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿E.pubescensMaxim.或朝鮮淫羊藿E.koreanumNakai 的干燥葉，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效，在抗炎、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松等方面療效顯著[1]。淫羊藿藥材的市場需求日益增加，其中本課題組培育的柔毛淫羊藿品種——“貴同柔毛1 號”[2]種植推廣數(shù)量最大。該品種具有淫羊藿黃酮醇苷類成分含量高和根狀莖芽萌發(fā)能力強(qiáng)（從而產(chǎn)量較高）等特性，在生產(chǎn)中1 年采收2 次（第1次在6月、第2次在12月），采收期的藥材（淫羊藿葉）一般為萌發(fā)后生長40～90 d。淫羊藿屬所有品種均為陰生植物，喜半陰濕潤環(huán)境，對光環(huán)境敏感，光合特性有所差異[3]。箭葉淫羊藿的凈光合速率（Pn）始終高于擬巫山淫羊藿E.pseudowuhannenseB.L.Guo[4]。適度的高光照強(qiáng)度（以下簡稱光強(qiáng)）可以促進(jìn)箭葉淫羊藿莖葉分枝數(shù)的增加，分枝數(shù)的增加帶來產(chǎn)量的顯著增加[5]?！百F同柔毛1 號”因根狀莖芽具有較強(qiáng)萌發(fā)能力而具有高產(chǎn)特性，但光強(qiáng)對其分枝數(shù)的影響是否與淫羊藿其他基原相似尚無深入研究。淫羊藿中的有效成分為具有異戊烯基取代的黃酮醇苷類成分[6]，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，適度光強(qiáng)對淫羊藿黃酮醇苷類成分含量的增加有促進(jìn)作用，如發(fā)現(xiàn)（72.7±2.5）μmol·m–2·s–1光強(qiáng)下擬巫山淫羊藿的淫羊藿苷類成分含量最高[7]。發(fā)光二極管（LED）光源由于波長易于精準(zhǔn)控制，已經(jīng)成為光合作用研究的主要光源[8]。本研究以“貴同柔毛1 號”為材料，研究柔毛淫羊藿的需光特性及光強(qiáng)對其主要農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的影響，以期為淫羊藿工廠化生產(chǎn)過程中精細(xì)化光調(diào)控提供參考。

1 材料

1.1 樣品

取種植于四川樂山種植基地的1 年生“貴同柔毛1 號”品種健康苗（由樂山市沙灣區(qū)長宏中藥材種植專業(yè)合作社提供），于2022 年1 月下旬移栽到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所溫室中。分單株定植于直徑10 cm、高10 cm 的花盆中，花盆基質(zhì)為育苗基質(zhì)-蛭石（3∶1）。2022 年2 月上旬（新葉萌發(fā)前），選擇長勢一致（1 年生葉片為7～9 片）的植株移入光培室（溫度：20～25 ℃，相對濕度：60%～70%）中，實(shí)驗(yàn)時間2022 年2 月8 日至2022 年3 月10 日。光強(qiáng)設(shè)置4 個梯度，分別是L1[（36.4±5.0）μmol·m–2·s–1]、L2[（91.0±5.0）μmol·m–2·s–1]、L3[（145.6±5.0）μmol·m–2·s–1] 和L4[（200.2±5.0）μmol·m–2·s–1]，光照時間為12 h·d–1，每個光強(qiáng)3 個重復(fù)，每個重復(fù)9 株，持續(xù)培養(yǎng)40 d，每3 d 澆水1次。實(shí)驗(yàn)期間如萌發(fā)新分枝為莖（即開花分枝），剪掉幼小花序。

1.2 儀器

L6500K 型全光譜LED 植物專用燈板（寧波楊輝儀器有限公司）；LI-6400 型便攜式光合作用測定儀（美國LI-COR 公司）；SPAD-502型便攜式手持葉綠素儀（日本Konica Minolta Inc公司）；ACQUITY超高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters 公司）；GZX-9070 MBE 型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；BP211D型十萬分之一電子天平（美國Sartorius公司）；FA2104N 型萬分之一電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試藥

對照品朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷（HPLC 純度>98%，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司）；乙腈、甲醇、乙醇（色譜純，美國Fisher 公司）；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水；CO2充氣囊（宜致餐飲科技有限公司）。

2 方法

2.1 分枝數(shù)及葉片數(shù)測定

在處理10、20、30、40 d 時，分別記錄根狀莖上新萌發(fā)的分枝數(shù)及新萌發(fā)的總?cè)~片數(shù)。分枝數(shù)類型包括單葉分枝（基生葉，單葉）、三葉分枝（基生葉，3 小葉復(fù)葉）、六葉分枝（莖，具2 枚對生的3小葉復(fù)葉）。

2.2 光合指標(biāo)測定

于40 d 時，對4 個光強(qiáng)梯度開展測定，每個處理重復(fù)測定4株植物，每株植物選取3枚葉片，選擇同期萌發(fā)且已經(jīng)成熟的葉片進(jìn)行測定（淫羊藿萌芽到完全展葉約30 d，葉片繼續(xù)成熟革質(zhì)化約10 d[9]），采用光合作用測定儀分別測定Pn、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和胞間CO2濃度（Ci），使用葉綠素儀在波長650、940 nm 下測定葉片的葉綠素相對含量（SPAD）值。

2.3 淫羊藿黃酮醇苷類成分的含量測定

于40 d 時，按《中華人民共和國藥典》2020 年版[1]含量測定方法，每個處理重復(fù)取9 株植物，每株植物取1片葉片，混合為1個樣品，測定葉片中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4 種淫羊藿黃酮醇苷類成分含量。

2.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理和繪圖采用Microsoft Excel 2010 軟件。單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件。

3 結(jié)果

3.1 不同光強(qiáng)對分枝數(shù)及總?cè)~片數(shù)的影響

在各個處理時期，分枝數(shù)都隨光強(qiáng)增加呈現(xiàn)上升趨勢，見圖1。處理10 d，各處理的分枝數(shù)均有所增加，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；處理20 d，L2、L3與L1相比，分枝數(shù)增加差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但L4 顯著增加（P<0.05）；處理30、40 d，各處理間分枝數(shù)增加差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），處理30 d，與L1 光強(qiáng)處理相比，L2、L3 和L4 分別增加43.52%、81.40%、100.00%；處理40 d，與L1光強(qiáng)處理相比，L2、L3和L4分別增加39.75%、79.50%、103.57%。對同一處理分析發(fā)現(xiàn)，隨著時間推移，“貴同柔毛1號”有新的分枝萌出，L1～L3 處理在30 d 時，分枝數(shù)較20 d 時增幅最大，分別為48.52%、70.00%和83.53%，此后增幅下降為44.26%、32.15%和37.81%；L4處理在20 d時，分枝數(shù)較前一時期增幅最大，為165.00%，此后增幅有所下降，分別為69.86%和41.11%。對不同處理下的不同時間葉片數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見圖2。葉片數(shù)的增加與分枝數(shù)的增加呈相同規(guī)律。

圖1 不同光強(qiáng)處理不同時期“貴同柔毛1號”的分枝數(shù)（,n=9）

圖2 不同光強(qiáng)處理不同時期“貴同柔毛1號”的葉片數(shù)（,n=9）

3.2 不同光強(qiáng)對“貴同柔毛1號”光合參數(shù)的影響

3.2.1 SPAD 不同光強(qiáng)處理40 d后，葉片的SPAD值隨光強(qiáng)的增加而減少，L1 下的SPAD 值為44.24±2.74。相較于L1，僅L4 下SPAD 值的下降差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），下降了20.21%，L3 的下降趨勢也比較明顯，下降了15.84%（圖3）。

圖3 不同光強(qiáng)處理40 d時“貴同柔毛1號”的SPAD值（,n=4）

3.2.2 光合特性 由圖4 可知，4 種光強(qiáng)處理40 d時，隨著光強(qiáng)的增加，“貴同柔毛1 號”葉片的凈Pn、Tr、Gs總體呈現(xiàn)增加的趨勢。其中，光強(qiáng)對Pn的影響較大，各個光強(qiáng)處理間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。L1下Pn最低，為（1.00±0.20）μmol·m–2·s–1；較L1 處理，L2 處理下Pn增幅為88.07%，L3、L4 處理分別較前一處理的Pn增幅為18.98%和67.14%。L4光強(qiáng)下Pn達(dá)到最高，為（3.72±0.28）μmol·m–2·s–1。隨著光強(qiáng)從L1增至L2，Gs和Tr均無顯著增加，當(dāng)光照強(qiáng)度增至L4 時，兩者均顯著增加（P<0.05），增幅分別為57.44%和41.82%。Ci與Pn的變化趨勢相反，隨著光強(qiáng)的增加而緩慢降低。

圖4 不同光強(qiáng)處理40 d的“貴同柔毛1號”葉片光合特征參數(shù)（,n=4）

3.3 淫羊藿黃酮醇苷類成分含量

本研究中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷4 種成分隨光強(qiáng)增加，含量均有所增加，但增加規(guī)律有所不同（表1）。其中，朝藿定C 與淫羊藿苷的含量占4 種成分總量的70%～80%。隨著光強(qiáng)的增加，朝藿定C 與淫羊藿苷的變化趨勢大致相同，均呈現(xiàn)L1～L4持續(xù)增加趨勢；與L2處理相比，L3朝藿定C增幅最大；與L1處理相比，L2淫羊藿苷增幅最大；朝藿定A、朝藿定B均呈現(xiàn)L3處理比L2處理顯著增加，L4處理略有下降的趨勢。L2、L3處理淫羊藿黃酮醇苷類成分總含量均顯著增加，L3與L4處理間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 不同處理40 d的“貴同柔毛1號”4種黃酮醇苷類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3） mg·g–1

表1 不同處理40 d的“貴同柔毛1號”4種黃酮醇苷類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3） mg·g–1

注：不同小寫字母表示同一成分下不同光強(qiáng)處理之間P<0.05。

4 討論

淫羊藿為多年生常綠草本，第1 年秋冬季于根狀莖節(jié)上形成休眠芽，第2 年芽萌發(fā)長出新枝，新枝的類型包括單葉分枝（基生葉，單葉）、三葉分枝（基生葉，3小葉復(fù)葉）、六葉分枝（莖，具2枚對生的3 小葉復(fù)葉）3 種類型[10]。常規(guī)萌發(fā)芽為部分休眠芽（以頂芽為主），營養(yǎng)充分或其他外界條件刺激下，其他休眠芽（根狀莖上的側(cè)芽及基部苞片內(nèi)的側(cè)芽）也會萌發(fā)。前期已有研究表明，增加光照或者其他因素處理（如激素）可顯著促進(jìn)擬巫山淫羊藿休眠芽萌發(fā)形成新枝[11-12]。

本研究中，光強(qiáng)梯度設(shè)置主要基于以下3點(diǎn)：1）本課題組前期對擬巫山淫羊藿30 d 室內(nèi)控制光強(qiáng)研究結(jié)果表明，擬巫山淫羊藿的適宜光強(qiáng)為72～91 μmol·m–2·s–1；2）在產(chǎn)地種植過程中發(fā)現(xiàn)，柔毛淫羊藿具有較強(qiáng)的光強(qiáng)耐受能力；3）本課題組對該品種進(jìn)行了高于擬巫山淫羊藿適宜光強(qiáng)的預(yù)實(shí)驗(yàn)（最高設(shè)置光強(qiáng)為163 μmol·m–2·s–1），發(fā)現(xiàn)該品種耐受高光的能力更強(qiáng)。因此，本研究設(shè)置了1 個較低光強(qiáng)L1，1個中等光強(qiáng)L2，2個較高光強(qiáng)L3、L4，研究光強(qiáng)對“貴同柔毛1 號”主要農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的影響。

本研究結(jié)果表明，增加光強(qiáng)可大幅度促進(jìn)“貴同柔毛1 號”根狀莖上的芽萌發(fā)形成新的地上分枝，與本課題組前期對擬巫山淫羊藿[9]和箭葉淫羊藿[13]的研究結(jié)果一致。從不同光強(qiáng)處理下分枝數(shù)最高增幅出現(xiàn)的時間和增加效應(yīng)看，隨著光強(qiáng)增加，“貴同柔毛1 號”的分枝數(shù)也隨之大量增加，且出現(xiàn)最高增幅的時間變短，如L1～L3處理均在30 d時增幅最高，L4處理下則在20 d達(dá)到最高增幅，且增幅約為L3處理的2 倍。本研究中L4 處理已經(jīng)顯著高于本課題組前期對其他淫羊藿物種光強(qiáng)研究處理，如在相同培養(yǎng)條件下，擬巫山淫羊藿出現(xiàn)顯著光抑制的光強(qiáng)僅為（163.6±2.5）μmol·m–2·s–1，而“貴同柔毛1 號”對于光強(qiáng)增加的適應(yīng)能力更強(qiáng)。

光強(qiáng)變化可以直接影響植物葉片中葉綠素含量的變化，進(jìn)而影響植物的光合特性[14]。SPAD 為相對葉綠素含量，與葉綠素含量有極顯著正相關(guān)關(guān)系[15]。本研究通過對“貴同柔毛1 號”開展40 d 不同光強(qiáng)的研究，發(fā)現(xiàn)隨著光強(qiáng)的增加，葉片的SPAD 值逐漸降低，僅L4 處理下SPAD 值顯著下降，其他處理差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Pn則持續(xù)增加。這與Jang 等[16]對2年生人參6月遮陰的研究結(jié)果一致。隨著光強(qiáng)的增加，人參也出現(xiàn)SPAD 值小幅度下降，但Pn仍持續(xù)增加的結(jié)果。結(jié)果表明，葉片高Pn的必需條件并不一定是高葉綠素含量，而光強(qiáng)增加引起的葉片葉綠素含量適當(dāng)降低，在葉綠素合成過程中，將有助于減少葉片氮素的消耗，優(yōu)化其在葉片內(nèi)的合理配置；在一定程度上提高光系統(tǒng)Ⅱ的效率，緩解光強(qiáng)增加引起的光抑制現(xiàn)象，最終提高葉片Pn[17]。

本研究結(jié)果顯示，光強(qiáng)為L2 時，Pn為（1.87±0.14）μmol·m–2·s–1，光強(qiáng)增至L4 時，Pn達(dá)到最高（3.72±0.28）μmol·m–2·s–1。對比前期本課題組潘俊倩[9]對擬巫山淫羊藿和箭葉淫羊藿連續(xù)30 d 的光強(qiáng)實(shí)驗(yàn)，兩者Pn均呈現(xiàn)隨著光強(qiáng)的增加，表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，均在72 μmol·m–2·s–1下Pn達(dá)到最高，達(dá)到1.8～2.0 μmol·m–2·s–1。箭葉淫羊藿在強(qiáng)光145 μmol·m–2·s–1下，Pn能在較長時間維持較高水平；擬巫山淫羊藿的光強(qiáng)耐受能力為18.2～91.0 μmol·m–2·s–1。本結(jié)果顯示，隨光照加強(qiáng)，Pn持續(xù)增加，一方面可能由于研究中設(shè)置的光強(qiáng)尚未達(dá)到脅迫光強(qiáng)，另一方面可能是當(dāng)前光強(qiáng)的處理時間較短，未達(dá)到長期的光脅迫效應(yīng)。綜合比較后得出，“貴同柔毛1 號”比擬巫山和箭葉淫羊藿更能耐受高光強(qiáng)，其在較強(qiáng)光照下仍具有較強(qiáng)的光合能力，有利于其進(jìn)一步積累光合作用產(chǎn)物，為其高萌發(fā)能力奠定基礎(chǔ)。

此外，本研究結(jié)果顯示，隨著光強(qiáng)的增加，Ci變化與Pn的變化趨勢呈負(fù)相關(guān)。這與張勤濤等[18]在LED 黃光不同光強(qiáng)對滇重樓葉片光合特性的影響研究結(jié)果一致。Ci變化與Pn的變化呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果表明，當(dāng)前光強(qiáng)尚未達(dá)到“貴同柔毛1 號”的光飽和點(diǎn)，光強(qiáng)仍是影響Pn進(jìn)一步增長的主要因素，推測Pn隨光強(qiáng)增加而增大的原因主要是葉肉細(xì)胞的光合活性增大，而不是Ci降低。相反，Ci降低是葉肉細(xì)胞的光合活性增大乃至Pn增高的結(jié)果[19]。

植物的化學(xué)成分及其積累過程受光強(qiáng)影響顯著。“貴同柔毛1 號”光照處理40 d 時，主要成分朝藿定C 和淫羊藿苷在L4 處理下最高，但與L3 處理差別不大；朝藿定A 與朝藿定B 在L3 處理下最高，光強(qiáng)增加到L4 處理有所下降；淫羊藿黃酮醇苷類成分總含量在上述2 個光強(qiáng)下差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這與本課題組前期對擬巫山淫羊藿的研究結(jié)果[9]有所區(qū)別。光照處理30 d 時，隨著光強(qiáng)的增加，擬巫山淫羊藿的4 種主要淫羊藿黃酮醇苷類成分總含量在（54.6±2.5）μmol·m–2·s–1光強(qiáng)下達(dá)到最高，在（90.9±2.5）μmol·m–2·s–1光強(qiáng)下開始顯著下降。相比于擬巫山淫羊藿，“貴同柔毛1 號”淫羊藿黃酮醇苷類成分也能在更高的光強(qiáng)下維持積累的較高水平。此外，在比L4 處理更高的光強(qiáng)及處理時間下，“貴同柔毛1 號”中成分下降的拐點(diǎn)仍有待研究。

綜上所述，“貴同柔毛1 號”在強(qiáng)光下的分枝數(shù)增加、Pn增加和淫羊藿黃酮醇苷增加的趨勢和淫羊藿屬其他物種一致，但對更高光強(qiáng)的適應(yīng)性和耐受性顯著高于其他物種。在柔毛淫羊藿和箭葉淫羊藿的亞熱帶種植區(qū)域，夏季高輻射期間，午間75%遮陽網(wǎng)下的光強(qiáng)可達(dá)到620 μmol·m–2·s–1，因此耐受高光強(qiáng)的“貴同柔毛1 號”較其他物種和類型具有更好的適應(yīng)性。如果進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，在淫羊藿未萌發(fā)前，給予較強(qiáng)的光照（如L4）可顯著增加分枝數(shù)，進(jìn)而提高葉片生物量，增加淫羊藿黃酮醇苷類成分的含量?！百F同柔毛1 號”對更高光強(qiáng)、更長的作用時間的效果還有待進(jìn)一步探究。