基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接的半夏瀉心湯治療腹瀉型腸易激綜合征作用機(jī)制研究△

潘世怡，高松林，吳美玲，鐘嘉圖，黃貴華

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；

2.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023

腸易激綜合征（IBS）是一種長(zhǎng)期發(fā)展，反復(fù)發(fā)作，以腹痛、腹部脹滿伴大便習(xí)慣及性狀變化為主要臨床特征的綜合征，屬于功能性胃腸道疾病[1]。羅馬Ⅲ診斷準(zhǔn)則將IBS分為4個(gè)亞型，有腹瀉型（IBSD）、便秘型（IBS-C）、混合型（IBS-M）和未定型（IBS-U），以IBS-D 為主[2]。IBS-D 病因與病理機(jī)制復(fù)雜，可能與胃腸動(dòng)力異常、腸-腦軸功能異常、內(nèi)臟異常高敏感、腸道炎癥等有關(guān)，但其機(jī)制仍未完全明確[3]。因此，目前以口服促排泄、止瀉、解痙及抗抑郁等為主要治療方法。

中醫(yī)認(rèn)為，IBS-D 可歸屬為泄瀉、腹痛范疇。中醫(yī)臨床多見(jiàn)肝氣郁滯、肝郁脾虛、脾腎虛寒、濕熱蘊(yùn)結(jié)等證型，疾病發(fā)展過(guò)程會(huì)出現(xiàn)脾胃氣機(jī)升降異常、寒熱錯(cuò)雜、虛實(shí)夾雜的病機(jī)變化，治療以疏肝解郁、疏肝健脾、溫中健脾、清利濕熱、調(diào)平寒熱等為主[4-7]。半夏瀉心湯由半夏、黃連、黃芩、人參、大棗、干姜、甘草組成，是張仲景創(chuàng)立的“辛開(kāi)苦降、寒溫平調(diào)”治法中五瀉心湯的代表方之一，為后世所傳承活用，現(xiàn)多用于消化系統(tǒng)疾病。臨床運(yùn)用半夏瀉心湯治療IBS-D 較為常見(jiàn)且具有較好的療效，可明顯改善患者癥狀[8-9]。藥理學(xué)研究表明，半夏瀉心湯可能通過(guò)調(diào)控膽堿能或5-羥色胺能神經(jīng)從而對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)起到雙向調(diào)節(jié)作用[10]。半夏瀉心湯治療IBS-D 安全、有效、復(fù)發(fā)率低[11]，但其發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制尚未闡明。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)研究半夏瀉心湯治療IBS-D 的作用機(jī)制，為其深入研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 半夏瀉心湯活性成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[12]對(duì)半夏瀉心湯中各藥材活性成分和靶點(diǎn)進(jìn)行收集及篩選?；钚猿煞忠钥诜锢枚龋∣B）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為依據(jù)[13]進(jìn)行遴選。選擇“Related Targets”選項(xiàng)找出各活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)[14]（https://www.uniprot.org/）中選定物種為“人”的靶點(diǎn)，將所有靶點(diǎn)名字都校正為標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.2 IBS-D靶點(diǎn)篩選

在GeneCards（https://www.genecards.org/）[15]、OMIM（https://omim.org/）[16]、DrugBank（https://go.drugbank.com/）[17]、PharmGKB（https://www.pharmgkb.org/）[18]數(shù)據(jù)庫(kù)中以“diarrhea irritable bowel syndrome”為關(guān)鍵字搜索IBS-D 的疾病作用靶點(diǎn)，并對(duì)得到的靶點(diǎn)進(jìn)行整理合并及刪除重復(fù)項(xiàng)。

1.3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的繪制

利用微生信平臺(tái)，對(duì)藥物靶點(diǎn)與IBS-D 靶點(diǎn)提取重合部分，繪制韋恩圖，獲得半夏瀉心湯治療IBS-D 的可能作用靶點(diǎn)。使用Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用軟件工具中網(wǎng)絡(luò)分析儀進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值（degree）篩選關(guān)鍵活性成分。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入藥物與IBS-D 的共同靶點(diǎn)，選擇種類為“人”，建立PPI 網(wǎng)絡(luò)，設(shè)定最低互作打分為0.95 并隱藏脫離節(jié)點(diǎn)，其他均為默認(rèn)設(shè)定，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)信息與數(shù)據(jù)。輸出.TSV 格式文件，采用Cytoscape 3.8.0軟件的CytoNCA 插件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)解析，通過(guò)調(diào)整節(jié)點(diǎn)連接度（DC）、中心度（BC）、特征向量中心度（EC）、緊密中心度、網(wǎng)絡(luò)中心度（NC）和基于局部均值量法中心性（LAC）參數(shù)篩檢出核心作用靶點(diǎn)，將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化處理。

1.5 基因本體（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析

將半夏瀉心湯治療IBS-D 的靶基因?qū)胫罬etascape 數(shù)據(jù)庫(kù)，分析物種為人，選擇“Custom Analysis”。設(shè)定閾值P<0.01，進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析。根據(jù)P值評(píng)估蛋白列表注釋功能的顯著性，選擇前10 個(gè)GO 功能和前20 個(gè)KEGG通路輸入到微生信平臺(tái)繪出富集氣泡圖。

1.6 分子對(duì)接

將核心活性成分作為小分子配體，從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出核心活性成分的2D 結(jié)構(gòu)文件，輸入Chem 3D軟件將其調(diào)整為3D結(jié)構(gòu)并優(yōu)化Minimize能量，輸出為.mol2 格式文件。核心靶點(diǎn)作為大分子受體，從UniPort數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索核心靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)蛋白的ID，再?gòu)腜DB 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選為人的物種、分辨率較高的核心靶點(diǎn)蛋白，下載蛋白的三維模型結(jié)構(gòu)。在PyMOL 2.4.0 軟件中打開(kāi)核心靶點(diǎn)蛋白，去除該蛋白水分子結(jié)構(gòu)和原始小分子配體。將大分子導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.7 軟件進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷數(shù)等處理，并將以上2 個(gè)文件轉(zhuǎn)變成.pdbqt 格式。利用AutoDock Vina 1.1.2 進(jìn)行分子對(duì)接，將對(duì)接結(jié)果通過(guò)PyMOL繪制成對(duì)接模型。

2 結(jié)果

2.1 半夏瀉心湯活性成分與作用靶點(diǎn)

在TCMSP 中依據(jù)OB>30%與DL>0.18 為條件篩選出半夏瀉心湯活性成分共211 個(gè)，其中半夏13個(gè)、人參22個(gè)、黃連14個(gè)、大棗29個(gè)、黃芩36個(gè)、干姜5 個(gè)、甘草92 個(gè)。活性成分包括槲皮素、金合歡素、漢黃芩素、千層紙素、山柰酚、甘草查耳酮A、黃芩素、異鼠李素、柚皮素等。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出3478 個(gè)半夏瀉心湯活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將藥物靶點(diǎn)更改成標(biāo)準(zhǔn)基因名并去掉重復(fù)項(xiàng)，最后共得到99 個(gè)靶點(diǎn)，143 個(gè)活性化合物。

2.2 IBS-D 疾病靶點(diǎn)的收集及半夏瀉心湯治療IBSD潛在靶點(diǎn)

在OMIM、PharmGKB、GeneCards、DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中共得到與疾病相關(guān)靶點(diǎn)2775 個(gè)，經(jīng)剔除重復(fù)靶點(diǎn)剩余2545 個(gè)，與藥物靶點(diǎn)映射取交集，得到58 個(gè)靶點(diǎn)半夏瀉心湯治療IBS-D 的潛在靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

2.3 藥物-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

通過(guò)Cytoscape 軟件對(duì)58 個(gè)交集靶點(diǎn)構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)有196 個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中138個(gè)成分節(jié)點(diǎn)、58個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，646條邊，見(jiàn)圖2。在“Network analyzer”計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋮?shù)，節(jié)點(diǎn)的度值越大則表明該節(jié)點(diǎn)可能是半夏瀉心湯治療IBS-D 的關(guān)鍵化合物或靶點(diǎn)。篩選出排序靠前的活性成分，見(jiàn)表1。

圖2 半夏瀉心湯治療IBS-D的藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

由圖2可見(jiàn)，度值較高的靶標(biāo)為熱休克90 kD 蛋白1（HSP90AA1）、雄激素受體（AR）、鈉通道蛋白5 型α亞基（SCN5A）、胰腺囊性纖維化基因（PRSS1）、細(xì)胞周期蛋白依賴激酶-2（CDK2）、β2-腎上腺素受體（ADRB2）、鉀電壓門控通道亞家族H 成員2（KCNH2）、毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型3（CHRM3）、B淋巴細(xì)胞瘤2（BCL2）等。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

半夏瀉心湯治療IBS-D 靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)有109 個(gè)節(jié)點(diǎn)和312條邊，見(jiàn)圖3A。使用Cytoscape里的插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)圖的拓?fù)鋮?shù)，以DC、BC、EC、緊密中心度、NC 和LAC 值均大于其中位數(shù)作為篩選條件[19]，獲得網(wǎng)絡(luò)a（圖3B），按同樣的篩選步驟再次篩選得到核心網(wǎng)絡(luò)b（圖3C）。由核心網(wǎng)絡(luò)b 得到度值靠前的靶點(diǎn)有原癌基因蛋白Jun（JUN）、FOS、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65（RELA）、蛋白激酶B1（Akt1）、雌激素受體1（ESR1）、細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）、MYC、缺氧誘導(dǎo)因子1-α（HIF1A）、細(xì)胞周期素依賴激酶抑制因子1A（CDKN1A）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白1（RB1），這些靶點(diǎn)可能對(duì)半夏瀉心湯治療IBS-D起到關(guān)鍵作用。

圖3 半夏瀉心湯治療IBS-D的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能及KEGG通路富集分析

GO 功能富集分析（P<0.01）中的生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）分別獲得1403、69、143 條。根據(jù)P值分別選擇排名前10 的條目繪制GO 功能分析圖（圖4）。BP 主要有細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激、對(duì)氧化應(yīng)激及對(duì)活性氧的反應(yīng)等。CC主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物、膜筏、膜微區(qū)等。MF主要有DNA 結(jié)合調(diào)控因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA 結(jié)合調(diào)控因子結(jié)合等。KEGG通路富集分析得出181條信號(hào)通路（P<0.01），排名前20的通路見(jiàn)圖5。

圖4 半夏瀉心湯治療IBS-D靶點(diǎn)的GO功能富集分析

圖5 半夏瀉心湯治療IBS-D靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

2.6 分子對(duì)接

選取度值最大的6個(gè)核心成分分別與PPI網(wǎng)絡(luò)中度值最大的6 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，若配體與受體結(jié)合能≤–5.0 kcal·mol–1（1 cal≈4.186 J），則說(shuō)明小分子配體與蛋白受體可以結(jié)合，且結(jié)合能越低則有越良好的結(jié)合能力。結(jié)果表明，核心靶點(diǎn)和成分結(jié)合能均≤–7.0 kcal·mol–1，見(jiàn)表2。部分活性成分和蛋白分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖6。

表2 半夏瀉心湯治療IBS-D關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

圖6 半夏瀉心湯治療IBS-D關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)的部分分子對(duì)接可視化圖

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接探討半夏瀉心湯治療IBS-D的分子作用機(jī)制。藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)提示半夏瀉心湯主要活性成分有槲皮素、漢黃芩素、山柰酚、金合歡素、甘草查耳酮A、黃芩素、千層紙素、異鼠李素、柚皮素等。槲皮素是一種黃酮類化合物，具有抗炎、降糖、抗癌、抗瘧疾等藥理作用，其通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸、調(diào)節(jié)神經(jīng)化學(xué)釋放、增強(qiáng)腦源性神經(jīng)因子、抑制腦氧化/氮能應(yīng)激、神經(jīng)炎癥及調(diào)控凋亡途徑，起到一定抗焦慮抑郁作用[20-22]。漢黃芩素提取自黃芩，具有抗氧化、抗炎、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗癌等多種活性[23]，尤其是其能抑制脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮（NO），這可能是黃酮類化合物的抗炎作用機(jī)制[24]。山柰酚[25]、金合歡素[26-27]、查耳酮[28]屬于黃酮類化合物，有抗腫瘤，抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種生物活性。研究證明，山柰酚可以減輕胃炎、胰腺炎和腹痛小鼠模型的炎癥損傷擴(kuò)張，從而減輕炎癥、腹痛及扭體反應(yīng)[29]。金合歡素可通過(guò)抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-Akt 信號(hào)通路的激活改善胃腸動(dòng)力障礙[30]。金合歡素還有神經(jīng)保護(hù)、鎮(zhèn)痛和抑制單胺氧化酶的作用，Xiao 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，金合歡素可能通過(guò)降低小鼠血清素和單胺氧化酶的活性起到抗抑郁作用。黃芩素是一種類黃酮，具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒、抗癌等[32]。

通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，JUN、FOS、RELA、Akt1、ESR1、CCND1、MYC、HIF1A、CDKN1A、MAPK1等為網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶蛋白，可能在半夏瀉心湯治療IBS-D 的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。JUN 是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與調(diào)控細(xì)胞生存、繁殖、分化、凋亡和機(jī)體炎性反應(yīng)等過(guò)程有密切聯(lián)系[33]。FOS 蛋白是即早基因c-fos的表達(dá)產(chǎn)物，JUN 與FOS 作為活化蛋白-1（AP-1）家族的主要成員，與癌癥、疼痛和抑郁有密切聯(lián)系[34-35]。c-fos基因可影響主體痛覺(jué)，在IBS 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭写竽X的非同一處呈現(xiàn)強(qiáng)表達(dá)，提示c-fos基因影響IBS-D 的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸。MARK1屬于MAPK 家族，是一種絲氨酸蛋白激酶，可調(diào)控炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等，有研究推斷出MAPK-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號(hào)通路可能使內(nèi)臟異常敏感，引起IBS-D 的發(fā)生[36]。RELA 是核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的成員，是miR-7 的目標(biāo)基因，miR-7可使RELA 呈現(xiàn)低表達(dá)，從而影響NF-κB 通路的活性，抑制與細(xì)胞繁殖和凋亡相關(guān)的下行分子[37]，調(diào)控NF-κB 通路在治療IBS-D 中有重要作用。Akt1 對(duì)PI3K-Akt 信號(hào)通路可起到關(guān)鍵調(diào)控作用。PI3K 在該通路上游被活化出現(xiàn)肌醇，調(diào)節(jié)被磷酸化的Akt，再控制下游因子，影響如代謝、增殖、存活和生長(zhǎng)的細(xì)胞周期進(jìn)程。NO在信號(hào)通路末端，對(duì)胃腸肌肉收縮和運(yùn)動(dòng)有重要功能，其中NO 的調(diào)節(jié)酶正是PI3K-Akt信號(hào)通路中的內(nèi)皮NO合成酶[38-39]。

通過(guò)富集分析發(fā)現(xiàn)，半夏瀉心湯參與細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)及對(duì)活性氧的反應(yīng)、DNA 結(jié)合調(diào)控因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子結(jié)合等。KEGG 分析顯示半夏瀉心湯治療IBS-D 可能涉及癌癥通路、白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、Toll 樣受體（TLR）信號(hào)通路、輔助性T 細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞分化、細(xì)胞程序性死亡-配體1（PDL1）在腫瘤中的表達(dá)及PD-1檢查點(diǎn)通路、NF-κB 信號(hào)通路等多種通路。低度黏膜炎在IBS-D 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[40]。TLR 信號(hào)通路是公認(rèn)的炎癥路徑。在應(yīng)激背景下，該路徑中的受體活性特異，激發(fā)下行信號(hào)分子如NF-κB，促進(jìn)炎性細(xì)胞和炎性損害物質(zhì)的排出，產(chǎn)生各種炎性化學(xué)反應(yīng)[41]。IL-17 有促炎性反應(yīng)作用，IL-17 受體通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合體IL-17R-Act1-TRAF6 活化下游JNK、NF-κB 等通路[42]。NF-κB 信號(hào)通路可能是IBS-D 的腸道炎性反應(yīng)和內(nèi)臟高敏性形成的機(jī)制之一[43]。TNF 具有促炎性細(xì)胞作用，在調(diào)節(jié)組織器官穩(wěn)態(tài)和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。IBS-D 發(fā)生時(shí)，環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A（cAMP/PKA）信號(hào)通路被抑制，NF-κB信號(hào)通路活化，TNF-α表達(dá)增加[44]。有研究表明IBS-D大鼠血清及結(jié)腸TNF-α、IL-1β、IL-8 表達(dá)增加，艾灸干預(yù)干預(yù)能夠減少TNF-α、IL-1β、IL-8 表達(dá)，進(jìn)而減少IBS-D大鼠腹瀉癥狀及內(nèi)臟高敏感性[45]。

分子對(duì)接結(jié)果表明，半夏瀉心湯核心化合物與核心蛋白結(jié)合能較低，也一定程度上驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果。

綜上所述，半夏瀉心湯治療IBS-D 是一個(gè)涉及多成分、多靶點(diǎn)、多通路、多環(huán)節(jié)的疾病干預(yù)過(guò)程，治療過(guò)程中可能涉及JUN、FOS、RELA、Akt1、MAPK1 等核心靶點(diǎn)，通過(guò)調(diào)控IL-17、NF-κB、TLR、TNF等信號(hào)通道發(fā)揮作用。