高分辨非靶代謝組學(xué)方法研究臻通集膠囊對(duì)高脂血癥模型大鼠的影響△

侯紅平，王彩霞，魏曉露，高云航，趙曉曉，宋玲，陳騰飛，練東銀，李麗麗，彭博*，張廣平*

1.中國(guó)中醫(yī)科科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；

2.河北御芝林生物科技有限公司，河北 石家莊 050035

血脂異常通常表現(xiàn)為血總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低及上述血脂異常共同存在的混合型血脂異常，根據(jù)病因可分為原發(fā)性和繼發(fā)性2 類，前者多見(jiàn)于遺傳性疾病，后者主要見(jiàn)于糖尿病、肝腎疾病等全身性系統(tǒng)性疾病。2017 年全球疾病負(fù)擔(dān)（global burden of disease，GBD）的中國(guó)資料表明，低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）異常是中國(guó)心血管疾?。–VD）的第三大歸因危險(xiǎn)因素[1]。而2012—2015 年心血管健康研究（CHS）顯示，在我國(guó)年齡≥35 歲的居民血脂異?？傮w患病率為34.7%，知曉率、治療率、控制率分別為16.1%、7.8%、4.0%，整體控制情況較差[2]。因此，對(duì)高脂血癥預(yù)防和治療的研究具有非常重要的意義。

臻通集膠囊是以三七粉、黃芪提取物、丹參提取物、銀杏葉提取物、葛根提取物、余甘子提取物、玉竹提取物為主要原料制成的保健品。上述成分經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明具有輔助調(diào)血脂和增強(qiáng)免疫力的作用[3-5]，在本課題組前期實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)臻通集膠囊能夠改善血脂異常的癥狀[6]，但其調(diào)節(jié)血脂代謝的機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)高分辨非靶代謝組學(xué)方法研究臻通集膠囊對(duì)高脂血癥模型大鼠的影響，為其治療和預(yù)防高脂血癥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TBA-120FR 型全自動(dòng)生化分析儀（佳能集團(tuán)）；Triple TOF 6600 型質(zhì)譜儀（AB Sciex 公司）；5430R型低溫高速離心機(jī)（Eppendorf 公司）；1290 Infinity LC型超高壓液相色譜儀（Agilent公司）。

1.2 試藥

臻通集膠囊（批號(hào)：202102010702，河北御芝林藥業(yè)有限公司）；TG 試劑盒（批號(hào)：01130C11）、TC 試劑盒（批號(hào)：01126D11）、HDL 試劑盒（批號(hào)：10222A11）、LDL 試劑盒（批號(hào)：10223A11）均購(gòu)于北京安圖生物工程有限公司；乙腈（Merck公司）；甲醇（Fisher公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)SD 大鼠40 只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所屏障環(huán)境動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)：2021B125）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組與給藥

隨機(jī)取6 只大鼠作為對(duì)照組，給予正常飼料，其余所有大鼠給予高脂飼料（基礎(chǔ)飼料+15%豬油+20%蔗糖+1.2%膽固醇+0.2%膽酸鈉），連續(xù)喂養(yǎng)4 周后，檢測(cè)動(dòng)物血清中的TG 和TC，與對(duì)照組比較明顯升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，視為模型成功。剔除不合格大鼠，其余大鼠根據(jù)TC值隨機(jī)分層分組，分為模型組和高、中、低劑量給藥組，每組6只。

對(duì)照組大鼠正常飲食。模型組和給藥組大鼠給予高脂飼料的同時(shí)，高、中和低劑量組分別給予臻通集膠囊0.432、0.216、0.108 g·kg–1（2.0、1.0、0.5 倍臨床等效劑量），灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)給藥8周。

2.2 動(dòng)物處理及指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥后，大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈采血，離心分離血清，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中TC、TG、HDL-C 和LDL-C 的含量。取部分中劑量的大鼠肝組織用于高分辨非靶代謝組學(xué)的研究。

2.3 高分辨非靶代謝組學(xué)分析

2.3.1 肝臟組織提取方法 大鼠肝臟組織解凍，取適量樣本加入預(yù)冷的甲醇-乙腈-水溶液（2∶2∶1），渦旋混合，低溫超聲30 min，–20 ℃靜置10 min，14 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液，真空干燥，質(zhì)譜分析時(shí)加入乙腈水溶液（乙腈-水，1∶1）100 μL復(fù)溶，渦旋，14 000×g、4 ℃離心 15 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.3.2 質(zhì)量控制（QC）樣本制備 QC 樣本是由待測(cè)樣本等量混合制成，在待測(cè)樣本超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）進(jìn)樣前、進(jìn)樣中和進(jìn)樣后上機(jī)檢測(cè)。

2.3.3 色譜-質(zhì)譜分析 色譜條件：Agilent 1290 Infinity LC型超高效液相色譜系統(tǒng)（Waters ACQUITY UPLC BEH Amide 型色譜柱，100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫為25 ℃；流速為0.5 mL·min–1；進(jìn)樣量為2 μL；流動(dòng)相A 為水+25 mmol·L–1乙酸銨+25 mmol·L–1氨水，流動(dòng)相B 為乙腈；梯度洗脫（0～0.5 min，95%B；0.5～7.0 min，95%～65%B；7.0～8.0 min，65%～40%B；8.0～9.0 min，40%B；9.0～9.1 min，40%～95%B；9.1～12.0 min，95%B）。

質(zhì)譜條件：采用Triple TOF 6600 型質(zhì)譜儀進(jìn)行樣本一級(jí)、二級(jí)譜圖的采集。分別采用電噴霧離子源（ESI）正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 數(shù)據(jù)處理

血脂水平的數(shù)據(jù)以（-x±s）表示，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard 3.0.6428軟件轉(zhuǎn)換成.mzXML 格式，然后采用XCMS 84 軟件進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。對(duì)XCMS 提取得到的數(shù)據(jù)首先進(jìn)行代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、數(shù)據(jù)預(yù)處理，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)和數(shù)據(jù)分析。

3 結(jié)果

3.1 大鼠血清中的血脂水平檢測(cè)

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TG、TC、HDL-C 和LDL-C 水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明造模成功。臻通集膠囊高劑量能明顯降低大鼠各項(xiàng)指標(biāo)的水平（P<0.05，P<0.01），中劑量能降低TG、TC 和LDL-C 水平（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C的水平（,n=6）

表1 各組大鼠血清中TG、TC、HDL-C和LDL-C的水平（,n=6）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，***P<0.001；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 實(shí)驗(yàn)方法考察

3.2.1 QC 樣本相關(guān)性 對(duì)QC 樣本進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，相關(guān)性圖譜見(jiàn)增強(qiáng)出版附加材料。一般r>0.9 表明相關(guān)性較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，QC 樣本間的r均大于0.9，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。

3.2.2 總體樣本Hotelling′s T2 檢驗(yàn) Hotelling′sT2檢驗(yàn)通過(guò)多元變量建模對(duì)樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，定義了95%或99% 置信區(qū)間，可用于離群樣本的診斷。Hotelling′sT2 檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明QC 樣本均在99%置信區(qū)間內(nèi)[7]，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性好。

圖1 臻通集膠囊給藥后大鼠血清總體樣本Hotelling′s T2檢驗(yàn)

3.3 總體樣本主成分分析（PCA）

將所有實(shí)驗(yàn)樣本和QC 樣本提取得到的峰進(jìn)行PCA，見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正、負(fù)離子模式下QC樣本緊密聚集在一起，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性好。同時(shí)，對(duì)照組和模型組明顯分離，說(shuō)明模型成功。經(jīng)臻通集膠囊給藥后，各組均向?qū)φ战M方向回調(diào)，說(shuō)明臻通集膠囊對(duì)高脂血癥具有良好的干預(yù)作用。

圖2 臻通集膠囊給藥后大鼠血清總體樣本PCA

3.4 代謝組學(xué)分析

3.4.1 差異代謝物的篩選結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組共檢測(cè)出138 個(gè)差異代謝物；與模型組比較，臻通集膠囊給藥組共檢測(cè)出123 個(gè)差異代謝物，正離子模式的72個(gè)差異代謝物有24個(gè)在給藥后得到了糾正，負(fù)離子模式的51 個(gè)差異代謝物有9 個(gè)在給藥后得到了糾正（表2、表3）。其中，變量重要性投影（VIP）值表示變量投影重要度，值越大，表示越重要；P值越小，表示差異越顯著[8]。

表2 臻通集膠囊給藥組和模型組在正離子模式下的差異代謝物

表3 臻通集膠囊給藥組和模型組在負(fù)離子模式下的差異代謝物

3.4.2 差異代謝物表達(dá)差異倍數(shù)分析 以差異代謝物的log2FC（FC 為差異倍數(shù)）為橫坐標(biāo)，顯著性差異代謝物為縱坐標(biāo)，分析給藥組和模型組的差異代謝物表達(dá)，并對(duì)差異代謝物進(jìn)行分類。正離子模式的差異代謝物主要包括L-肉堿、甜菜堿、胞苷、L-脯氨酸肉堿、亞油酸肉堿、DL-苯丙氨酸、UDP-D-半乳糖；負(fù)離子模式的差異代謝物主要包括肌苷、替尼泊苷、亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-纈氨酸、亮氨酸、D-脯氨酸、甲基丙二酸等。差異代謝物表達(dá)差異倍數(shù)分析及分類見(jiàn)增強(qiáng)出版附加材料。

3.4.3 差異代謝物的亞類分析 給藥組和模型組差異代謝物進(jìn)行亞類分析，正離子模式的差異代謝物亞類主要集中在哌啶、脂肪?；⑶手?、呋喃、肽模擬物等方面；負(fù)離子模式的差異代謝物亞類主要集中在甘油磷脂、類黃酮、嘌呤核苷酸和香豆素等方面。差異代謝物表達(dá)差異火山圖及亞類分析圖見(jiàn)增強(qiáng)出版附加材料。

3.4.4 差異代謝物生物信息學(xué)分析

3.4.4.1 聚類分析 顯著性差異代謝物（VIP值>1，P<0.05）的層次聚類分析結(jié)果顯示，聚在同一簇內(nèi)的代謝物具有相似的表達(dá)模式，可能具有相似的功能或者共同參與同一代謝過(guò)程和細(xì)胞通路。正離子模式的差異代謝物主要聚集在腺苷5-單磷酸、還原型甘油磷酸膽堿、脫氧腺苷、半胱氨酸-甘氨酸、L-谷胱甘肽等方面，負(fù)離子模式的差異代謝物主要聚集在L-谷氨酰胺、尿酸、腺嘌呤、抗壞血酸、谷氨酸、D-脯氨酸等方面。顯著差異代謝物的層次聚類分析圖見(jiàn)增強(qiáng)出版附加材料。

3.4.4.2 相關(guān)性分析 對(duì)顯著性差異代謝物間的代謝密切程度進(jìn)行相關(guān)性分析。正、負(fù)離子模式均集中在脂質(zhì)、核酸、有機(jī)酸及其衍生物、有機(jī)氮化合物、有機(jī)氧化合物等方面。顯著性差異代謝物的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)增強(qiáng)出版附加材料。

3.4.4.3 京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路注釋與分析 將正、負(fù)離子模式篩選到的差異代謝物合并，對(duì)其進(jìn)行KEGG（http://www.kegg.jp/）通路注釋與分析，見(jiàn)圖3。然后對(duì)KEGG 代謝通路整體變化進(jìn)行差異豐度得分分析，見(jiàn)圖4。涉及的代謝通路包括雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷酸依賴性蛋白激酶（cGMP-PKG）信號(hào)通路、叉頭轉(zhuǎn)錄因子（FoxO）信號(hào)通路、蛋白質(zhì)消化和吸收、嘧啶代謝、微生物消化和吸收、甘油磷脂代謝、氨基酸生物合成、嘌呤代謝等。

圖3 臻通集膠囊給藥組和模型組大鼠血清中差異代謝物KEGG通路富集分析

4 討論

代謝組學(xué)主要通過(guò)對(duì)特定細(xì)胞、器官或生物體中的低相對(duì)分子質(zhì)量代謝物（<2000）進(jìn)行定量分析，是1999 年由Nicholson 等[9]提出，主要用來(lái)研究生物體受刺激后所發(fā)生的各種代謝應(yīng)答變化，可以直觀反映機(jī)體的代謝狀況。目前，代謝組學(xué)最常用的判別歸類分析方法包括以PCA 為主的無(wú)監(jiān)督的判別分析方法及以偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）為主的有監(jiān)督的判別分析方法[10]。

本研究中，模型組大鼠血清中的TG、TC、HDL-C 和LDL-C 較對(duì)照組均明顯升高，且PCA 顯示，對(duì)照組和模型組分離明顯，說(shuō)明模型成功。而臻通集膠囊給藥后，高劑量和中劑量組的TG、TC、LDL-C，高劑量組的HDL-C 較模型組明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中劑量為臻通集的有效劑量，在此基礎(chǔ)上，比較了模型組和臻通集中劑組的代謝組學(xué)差異。

前期進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的考察，QC樣本間的相關(guān)性系數(shù)均大于0.9，且QC 樣本均在置信區(qū)間內(nèi)，表明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。PCA 顯示，經(jīng)臻通集膠囊給藥后，各組均向?qū)φ战M方向回調(diào)，說(shuō)明臻通集膠囊對(duì)高脂血癥具有良好的干預(yù)作用，與上述血脂水平變化相一致。與對(duì)照組比較，模型組共檢測(cè)出138 個(gè)差異代謝物，其中正離子模式有66 個(gè)差異代謝物，負(fù)離子模式有72 個(gè)差異代謝物。給藥組與模型組比較，共檢出123 個(gè)差異代謝物，其中正離子模式有72 個(gè)差異代謝物，主要包括甘油磷酸膽堿、氨基酸、腺苷、谷胱甘肽、磷酸膽堿、胞嘧啶、乳酸、l-花生四烯酰肉堿等；負(fù)離子模式有51 個(gè)差異代謝物，主要包括尿嘧啶、氨基酸、谷氨酸、尿酸、吲哚乳酸、腺嘌呤等。上述差異代謝物主要集中在木脂素、新木脂素及相關(guān)化合物，羧酸及其衍生物，肉桂酸和衍生物，香豆素及其衍生物，吲哚類衍生物，異黃酮，木脂素內(nèi)酯，有機(jī)磷酸和衍生物等。

經(jīng)生物信息學(xué)分析，臻通集干預(yù)大鼠高脂血癥的代謝過(guò)程涉及多個(gè)信號(hào)通路，主要包括mTOR 信號(hào)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路、FoxO 信號(hào)通路、蛋白質(zhì)消化和吸收、嘧啶代謝、微生物消化和吸收、甘油磷脂代謝、氨基酸生物合成、嘌呤代謝等。這與臻通集含有銀杏葉提取物、葛根提取物、余甘子提取物等多個(gè)調(diào)脂成分密切相關(guān)[11-12]。

磷脂腺肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）-mTOR信號(hào)通路是典型的自噬通路，該通路通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成和降解、改善細(xì)胞能量代謝等多種途徑發(fā)揮重要的生理功能，激活該通路可增強(qiáng)肝臟細(xì)胞的自噬表達(dá)，能夠有效調(diào)節(jié)血脂、改善肝臟脂質(zhì)沉積等[13-14]。FoxO1是位于PI3K/Akt下游的關(guān)鍵因子，在肝臟糖脂代謝的調(diào)節(jié)中具有至關(guān)重要的地位。研究表明，通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt 通路，促進(jìn)FoxO1 磷酸化，能夠調(diào)節(jié)血脂水平，緩解高脂血癥[15-18]。文獻(xiàn)報(bào)道，次黃嘌呤異構(gòu)體別嘌呤醇能夠改善患者高尿酸血癥，利于改善患者的血脂代謝情況[19]。李玉紅等[20]研究發(fā)現(xiàn)，糖脂清可以改善四氧嘧啶糖尿病小鼠的生長(zhǎng)狀況，降低小鼠空腹血糖濃度和血清中TG的含量，提示嘧啶代謝參與血脂水平的調(diào)節(jié)。

綜上，臻通集膠囊能夠有效改善高脂血癥大鼠的血脂水平，與其能夠調(diào)節(jié)嘌呤代謝、嘧啶代謝、甘油磷脂代謝、mTOR 信號(hào)通路，cGMP-PKG 信號(hào)通路等密切相關(guān)。