萱草花藥材DNA條形碼鑒別與HPLC指紋圖譜研究△

鐘春琳，胡綺萍，吳文平，何嘉瑩，羅宇琴，林晗，李國(guó)衛(wèi)

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528200

萱草花收載于《上海中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1994 年版，為百合科植物黃花菜Hemerocallis citrinaBaroni或萱草H.fulvaL.的干燥花蕾，多于7—8 月花蕾未開放前采摘，曬干，有利水滲濕、清熱止渴、解郁寬胸等功效[1]。其在全國(guó)各地常見栽培，主產(chǎn)于山西、甘肅、黑龍江、安徽和吉林等地[2]。研究表明萱草花藥材具有明顯的抗抑郁的作用[3-6]。

萱草花作為常用藥食兩用藥材，目前其質(zhì)量控制研究較少，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中其質(zhì)量控制項(xiàng)目只有性狀和雜質(zhì)檢查，且性狀描述中未對(duì)黃花菜和萱草2 種基原進(jìn)行區(qū)分[1]。目前文獻(xiàn)中對(duì)萱草花2 個(gè)基原區(qū)分手段僅有性狀和顯微鑒別，不能很好地區(qū)分[7]。本研究擬通過(guò)DNA 條形碼技術(shù)對(duì)來(lái)自全國(guó)5個(gè)省的14批藥材進(jìn)行鑒定，在研究藥材基原的基礎(chǔ)上，建立萱草花的高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜，通過(guò)分子生物學(xué)信息和化學(xué)成分表征相結(jié)合，為萱草花藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)萱草花化學(xué)成分主要有黃酮類，如槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、槲皮素-3-O-吡喃木糖苷、3-糠酸、琥珀酸、金絲桃苷、異槲皮苷等[8]，因此，本研究擬開展黃酮類成分指紋圖譜研究。

1 材料

1.1 儀器

5424GM 型高速離心機(jī)、5424R型高速冷凍離心機(jī)均購(gòu)于德國(guó)艾本德公司；BioSpec-nano 型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；OSE-MC8 型微型離心機(jī)[天根生化科技（北京）有限公司]；T100 型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、Sub-CellGT 型水平電泳槽、PowerPac 型電泳儀均購(gòu)于美國(guó)伯樂(lè)生命科技有限公司；NuGenius 型凝膠成像儀（英國(guó)Syngene 公司）；JXFSTPRP-48 型全自動(dòng)樣品快速研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；ACQUITY Arc 型高效液相色譜儀、Waters HSS T3 型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）均購(gòu)于美國(guó)Waters 公司；ME204E 型萬(wàn)分之一天平、XP26 型百萬(wàn)分之一天平均購(gòu)于梅特勒-托利多科技（中國(guó)）有限公司；KQ500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS28 型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司）。

1.2 試藥

萱草花對(duì)照藥材（批號(hào)：DSTYM007901，成都樂(lè)美天醫(yī)藥科技有限公司）；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-202012，純度：91.6%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；高效植物基因組DNA 提取試劑盒[貨號(hào)：DP350-03，批號(hào)：X0121，天根生化科技（北京）有限公司]；2×M5 SupperFastTaqPCR MasterMix（北京聚合美生物科技有限公司）；DL1000 DNA Marker[貨號(hào)：3591A，批號(hào)：AL51615A，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]；實(shí)驗(yàn)所用藥材經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，均為黃花菜Hemerocallis citrinaBaroni 的干燥花蕾。藥材具體信息見表1。

表1 14批萱草花藥材信息

2 方法

2.1 DNA條形碼鑒別

2.1.1 樣品前處理 稱取樣品適量，用75%乙醇擦拭表面，去除泥沙及雜質(zhì)，采用樣品快速研磨儀研磨，得到細(xì)粉（過(guò)五號(hào)篩）。

2.1.2 DNA 提取 取細(xì)粉50 mg，按照高效植物基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書操作，提取樣品基因組DNA。

2.1.3 PCR 擴(kuò)增和測(cè)序 PCR 反應(yīng)體系50 μL：2×M5 SupperFastTaqPCR MasterMix 25 μL，引 物：psbA-F，5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'；trnHR，5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'[9]或matK-3F，5'-CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG-3'；matK-1R，5'-ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC-3'各0.8 μL，DNA 模板1 μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足至50 μL。以ddH2O 為空白對(duì)照。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃復(fù)性45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所有擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后，由北京六合華大基因科技有限公司做Sanger測(cè)序。

2.1.4 數(shù)據(jù)處理 測(cè)序結(jié)果通過(guò)Seqman Version 7.1.0 軟件進(jìn)行序列拼接和人工校正，然后除去拼接后的序列兩端的低質(zhì)量區(qū)。并將所得序列通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行BLAST對(duì)比鑒別。

2.2 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 用十八烷基硅膠為填充劑，Waters HSS T3型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%乙酸（B），梯度洗脫（0～15 min，15%～18%A；15～25 min，18%～20%A；25～30 min，20%～40%A），柱溫為35 ℃，流速為1 mL·min–1，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。

2.2.2 供試品制備方法 取藥材粉末（過(guò)三號(hào)篩）約1 g，加70%甲醇25 mL，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 參照物制備方法 取萱草花對(duì)照藥材1.0 g，加70%甲醇25 mL，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為對(duì)照藥材參照物溶液。另取蘆丁對(duì)照品適量，加甲醇制成含蘆丁100 μg·mL–1的對(duì)照品溶液。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一萱草花供試品溶液（批號(hào)：XCH1），照2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，將圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版），結(jié)果各圖譜的相似度均在0.99 以上，表明儀器的精密度良好。

2.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一萱草花供試品溶液（批號(hào)：XCH1），分別于0、2、4、8、12、24 h 測(cè)定，結(jié)果各圖譜相似度均在0.99 以上，表明供試品溶液在24 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一萱草花藥材粉末（批號(hào)：XCH1）1 g，共6 份，分別按2.2.2 項(xiàng)下供試品制備方法制成供試品溶液，照2.2.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果各圖譜相似度均在0.99 以上，表明該方法的重復(fù)性良好。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA條形碼鑒定結(jié)果與分析

14批萱草花樣品擴(kuò)增電泳圖見圖1，將拼接后的序列通過(guò)NCBI 進(jìn)行BLAST 對(duì)比，結(jié)果見表2。經(jīng)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，黃花菜、萱草、小黃花菜Hemerocallis minorMill.3 個(gè)物種的psbA-trnH和matK片段的同源性較高，其中psbA-trnH在第509位，黃花菜基原堿基為C，而其他基原堿基為A，matK在523位，黃花菜基原堿基為C，而其他基原堿基為T，最終得到本研究14批結(jié)果均為黃花菜基原。

圖1 14批萱草花樣品擴(kuò)增電泳圖

表2 14批萱草花藥材序列與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果

3.2 HPLC指紋圖譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

3.2.1 指紋圖譜的建立 取14 批萱草花供試品溶液各10 μL，在2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，得到14 批萱草花的HPLC 指紋圖譜，根據(jù)色譜圖中各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間，確定共有峰，并選取其中14個(gè)共有峰作為特征峰建立指紋圖譜（圖2）。經(jīng)過(guò)與對(duì)照品比對(duì)可知7 號(hào)峰為蘆?。▓D3），以之為S 峰，計(jì)算其余特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間（表3）和相對(duì)峰面積（表4）。

圖2 14批萱草花藥材指紋圖譜、萱草花對(duì)照藥材和對(duì)照?qǐng)D譜疊加圖

圖3 萱草花指紋圖譜和對(duì)照品HPLC圖

表3 14批萱草花指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 14批萱草花指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

14 批樣品的相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.11%～0.48%，相對(duì)峰面積RSD 為12.40%～31.58%，可見各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間較穩(wěn)定，但相對(duì)峰面積相差較大，說(shuō)明不同批次萱草花各特征峰所代表的化學(xué)成分的比例存在一定的差異，這種差異可能與產(chǎn)地因素有關(guān)。

3.2.2 主成分分析 以14 批樣品指紋圖譜的14 個(gè)共有峰峰面積作為變量導(dǎo)入SPSS 22.0軟件進(jìn)行主成分分析，提取特征值>1的2個(gè)主成分，其累積方差貢獻(xiàn)率為84.729%（表5、圖4）。根據(jù)成分矩陣圖可知峰1～7、峰9～14對(duì)主成分1影響較大，峰8對(duì)主成分2影響較大（表6）。14個(gè)樣品主成分1和主成分2綜合得分為–2.722 81～3.334 31，綜合得分排序見表7。

圖4 14批萱草花藥材各主成分貢獻(xiàn)率碎石圖

表5 14批萱草花藥材各主成分的貢獻(xiàn)率

表6 14批萱草花藥材各因子初始因子載荷矩陣

表7 14批萱草花藥材主成分得分

采用主成分分析，提取2個(gè)主成分，計(jì)算綜合得分，甘肅省的樣品綜合得分整體排序靠后，黑龍江省和安徽省排序前后均有，而山西省的樣品綜合得分排序分別為第1和第7、吉林省的樣品綜合得分為第4，可知山西省、吉林省等產(chǎn)地的萱草花總體質(zhì)量較好。

4 討論

傳統(tǒng)的藥材鑒定方法主要通過(guò)性狀鑒別、理化鑒別和顯微鑒別等，具有一定的主觀性和局限性，有研究中也提到將DNA 條形碼分子鑒定法與《中華人民共和國(guó)藥典》2010 年版規(guī)定的其他鑒別方法相結(jié)合，能夠?qū)λ幤焚|(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)與有效監(jiān)控[10]。本研究通過(guò)DNA 條形碼技術(shù)對(duì)14 批樣品進(jìn)行物種鑒定，結(jié)果顯示樣品均為百合科植物黃花菜H.citrinaBaroni。本研究在基原確定后對(duì)14 批萱草花進(jìn)行指紋圖譜研究，建立的HPLC指紋圖譜共標(biāo)定了14 個(gè)共有峰，方法學(xué)考察結(jié)果符合指紋圖譜技術(shù)要求，并對(duì)圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果各批次的相似度均大于0.99，表明所用的樣品質(zhì)量穩(wěn)定，來(lái)源均一。本研究通過(guò)DNA 條形碼和HPLC 指紋圖譜技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)和化學(xué)成分共同表征，為中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)的應(yīng)用提供了示范，即利用DNA 條形碼技術(shù)進(jìn)行萱草花藥材的物種鑒定，并在物種鑒定的基礎(chǔ)上通過(guò)HPLC 指紋圖譜技術(shù)評(píng)價(jià)萱草花藥材的質(zhì)量。