超快速液相色譜-質譜法測定鮮人參晶及林下山參中的39個人參皂苷成分△

陳麗華，楊秀偉*，白雪媛，趙大慶

1.北京大學 藥學院 天然藥物學系/天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191；

2.長春中醫(yī)藥大學 吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130000

人參為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖[1]，具有大補元氣、生津養(yǎng)血、補脾益肺、安神益智等功效[2-3]，被譽為“百草之王”。林下山參也稱籽海、籽貨、育山參等，是通過人工方式將人參種子播種在深山密林中，在野生環(huán)境下自然生長且10 多年后采收的半野生山參[4-5]。鮮人參晶是一種口服人參凍干品，以鮮人參為原料，采用現代工藝（特殊的高壓、研磨技術及先進的凍干技術）加工制成，能溶出全部活性成分并充分發(fā)揮其作用，具有活性高、吸收好、起效快、服用方便等特點。

人參皂苷是人參的主要活性成分，也是評價人參的主要指標，現代藥理學和生物活性研究表明人參皂苷具有廣泛的藥理、藥效作用[3,6-7]。根據苷元的不同，人參皂苷可分為原人參二醇型（PPD）、原人參三醇型（PPT）及齊墩果酸型（OA）[8]。據文獻報道，林下山參中的人參皂苷與栽培人參相比雖然種類沒有變化，但單體人參皂苷的含量卻有顯著差異，且前者的總人參皂苷含量也遠高于后者[9-11]。鑒于此，本研究選擇林下山參與鮮人參晶進行比較，探究兩者的人參皂苷含量差異。

隨著現代科學技術的不斷發(fā)展，超快速液相色譜-質譜法（UFLC-MS/MS）在醫(yī)藥、食品、化工等眾多領域得到廣泛應用[12-13]。與傳統(tǒng)的高效液相色譜-紫外檢測器法（HPLC-UV）和蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）相比，UFLC-MS/MS 顯示出高效快速的分離能力和超高的靈敏度，可以克服人參皂苷在分析時需衍生化及由于分子離子豐度低難檢測等問題[14]。多反應監(jiān)測（MRM）模式則通過去除不符合規(guī)則的信號干擾，從而達到高靈敏度、高準確性和特異性的靶向定量檢測效果[15]。因此，本研究采用UFLC-MS/MS 測定林下山參及鮮人參晶中人參皂苷的含量，為鮮人參晶和林下山參的質量標準及營養(yǎng)保健作用研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

島津LCMS-8050 型超高效液相色譜-質譜系統(tǒng)，其中Nexera X2 型超高效液相系統(tǒng)（配置LC-30AD型二元泵、SIL-30AC 型自動進樣器、SPD-M30A 型檢測器和CTO-20AC 型柱溫箱）與三重四極桿質譜儀串聯(lián)，配有電噴霧離子源（ESI）及LabSolution LCMS V 5.65 工作站軟件；XS105DU 型十萬分之一電子天平、ME204T/02 型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）；KQ5200型超聲波系統(tǒng)（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q Advantage A10 型超純水機（Merck Millipore公司）。

1.2 試藥

20年生林下山參（批號：LXS-201308，編號：1）于2013 年8 月采自吉林省撫松縣東崗鎮(zhèn)；20 年生林下山參（批號分別為LXS-202001、LXS-202002、LXS-202003，編號為2～4）于2020 年采于吉林省白山市撫松縣露水河鎮(zhèn)，所有樣品均經吉林省人參科學研究院趙大慶教授鑒定為五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖；鮮人參晶（批號：XRSJ-202112，編號：5）由北京同仁堂健康藥業(yè)（遼寧）有限公司提供，原料林下山參經遼寧省食品檢驗檢測院董英杰教授鑒定為15 年生以上人參P.ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，產地為遼寧省寬甸縣；所有憑證標本存放在北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室。

對照品人參皂苷Ra1（G-Ra1，1）、G-Ra2（2）、G-Ra3（3）、G-Rb1（4）、G-Rb2（5）、G-Rb3（6）、G-Rc（7）、G-Rd（8）、G-Re（9）、G-Rs1（10）、20(S)-G-Rs3（S-Rs3，11）、20(R)-G-Rs3（R-Rs3，12）、G-Rs4（13）、G-Rg6（14）、G-F4（15）、G-Rg1（16）、20(S)-G-Rf（S-Rf，17）、20(R)-G-Rf（R-Rf，18）、20(S)-G-Rg2（S-Rg2，19）、20(R)-G-Rg2（R-Rg2，20）、20(S)-G-Rg3（S-Rg3，21）、20(R)-G-Rg3（R-Rg3，22）、G-F2（23）、20(S)-三七皂苷（NG）R2（24）、20(R)-NG-R2（25）、G-Rk1（26）、G-Rg5（27）、G-Rh4（28）、G-Rk3（29）、20(S)-G-Rh1（S-Rh1，30）、20(R)-G-Rh1（R-Rh1，31）、G-Rh2（32）、20(S)-PPT（S-PPT，33）、西洋參皂苷R1（Q-R1，34）、G-Ro（35）、NG-R1（36）、G-Rg9（38）及20-glu-G-Rf（20-glu-Rf，39）為本課題組從生曬參[16-17]、紅參[18-20]及人參莖葉[21-22]中分離得到；竹節(jié)參皂苷Ⅳa（CS-Ⅳa，37）購自成都普思生物科技有限公司；各對照品純度均大于98%。

質譜級甲醇、乙腈、甲酸銨均購自Fisher 公司；色譜純甲醇購于天津西華特種試劑廠；超純水（18 MΩ·cm–1）為本實驗室自制。

2 方法

2.1 色譜與質譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC? BEH Shield RP C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），配備Waters ACQUITY UPLC? BEH Shield RP C18VanGuard?預柱（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.5 mmol·L–1甲酸銨水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，22%B；3～5 min，22%～30%B；5～9 min，30%～35%B；9～11 min，35%～36%B；11～14 min，36%～48%B；14～20 min，48%～51%B；20～22 min，51%～75%B；22～25 min，75%～80%B；25～27 min，80%～90%B；27～30 min，90%B）；柱溫為40 ℃；流速為0.35 mL·min–1；進樣量為2 μL。

優(yōu)化的質譜參數：接口加熱器溫度為300 ℃；脫溶劑管溫度為250 ℃；接口電壓為3 kV；檢測器電壓為1.7 kV；霧化氣流速為3 L·min–1；干燥氣和加熱氣流速均為10 L·min–1；負離子模式，電噴霧離子源（ESI），掃描方式為MRM。

2.2 對照品溶液的配制

分別精密稱取39 個人參皂苷對照品適量，用質譜級甲醇溶解，配制成質量濃度為1.0 mg·mL–1的對照品儲備液，于–20 ℃密封保存。分別精密吸取各對照品儲備液適量，用質譜級甲醇稀釋并制成質量濃度為1.0～10.0 μg·mL–1的混合對照品母液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

2.3 供試品溶液的配制

參照本課題組已發(fā)表文獻的處理方法[18]，精密稱取過40 目篩的樣品粉末0.500 00 g（±0.000 1 g）于50 mL離心管中，精密加入70%甲醇水溶液40 mL，常溫超聲提取60 min。5000 r·min–1（離心半徑為10 cm）離心10 min，取上清液適量，用70%甲醇水10倍稀釋，過0.22 μm 微孔濾膜，作為供試品溶液。每批樣品分別平行制備3份。

2.4 方法學考察

取適量混合對照品母液，用甲醇逐級倍比稀釋，得到系列質量濃度的混合對照品線性工作液。以信噪比（S/N）=3 為檢測下限（LLOD），S/N=10 為定量下限（LLOQ）。通過對同一對照品溶液（質量濃度為125 ng·mL–1）進行如下操作：同日內重復6 次或連續(xù)進樣3 d（每天進樣3 次），測定各分析物的峰面積，分別計算日內和日間精密度的RSD。

按2.3項下方法平行制備6份供試品溶液，測定各分析物的含量，計算RSD，進行重復性試驗。取同一供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24、48 h，按照2.1 項下條件測定各分析物的峰面積，計算RSD，評估所有分析物的穩(wěn)定性。精密稱取同一批鮮人參晶樣品9 份，分別加入不同質量濃度（低、中、高）的混合對照品溶液，每個質量濃度按2.3 項下方法平行制備3 份，按2.1 項下條件測定，計算加樣回收率。

3 結果

3.1 UFLC-MS/MS條件的優(yōu)化

基于本課題組前期對人參皂苷UFLC-MS/MS 條件的研究[18,23]，將流動相確定為乙腈和0.5 mmol·L–1甲酸銨水溶液，在保留時間（tR）30 min內，所有分析物（包括11 對同分異構體）于負離子模式下得到完全分離，39 個人參皂苷混合對照品及樣品的MRM 疊加色譜圖見圖1。其中，[M+HCOO]–作為G-Rg6、G-F4、G-Rk3和G-Rh4的母離子，因為其靈敏度和離子強度均高于相應的去質子化離子[M–H]–，而其他分析物則選擇加合離子[M–H]–更合適。各人參皂苷分析物的tR、母離子、離子對信息、1 極預偏置電壓（Q1）、3 極預偏置電壓（Q3）、碰撞能量（CE）及滯留時間（DT）的優(yōu)化參數見表1。

表1 39個人參皂苷分析物的tR及MRM優(yōu)化參數

圖1 人參皂苷混合對照品和樣品的MRM疊加色譜圖

3.2 方法學考察結果

在各自線性質量濃度范圍內，39 個人參皂苷以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），r為0.999 0～0.999 9，LLOD 為0.10～2.58 μg·L–1，LLOQ為0.33～7.87 μg·L–1（表2）；日內和日間精密度RSD 分別為0.69%～4.40%和0.74%～3.85%，表明儀器精密度良好；各分析物的重復性試驗含量的RSD 為1.15%～3.83%，穩(wěn)定性試驗峰面積RSD 為1.03%～4.29%，表明方法重復性及所有分析物的穩(wěn)定性良好；39 個分析物的平均回收率為92.38%～103.73%，RSD 為0.41%～4.74%，具體結果見表3。分析方法經方法學驗證符合分析物的定量分析要求。

表2 人參中39個人參皂苷的標準曲線、線性范圍、LLOD和LLOQ

表3 39個人參皂苷含量測定的日內及日間精密度、穩(wěn)定性、重復性和回收率

3.3 樣品中人參皂苷的含量測定

按2.3項下方法制備5批樣品的供試品溶液，每批重復3次，按2.1項下條件測定，記錄各分析物峰面積，以外標對照品法計算含量，結果見表4。

表4 鮮人參晶和林下山參樣品中人參皂苷質量分數（,n=5）

表4 鮮人參晶和林下山參樣品中人參皂苷質量分數（,n=5）

注：ND.未檢出；*表示稀有人參皂苷或苷元。

林下山參和鮮人參晶中的總人參皂苷質量分數分別為27.59～52.63、52.26 mg·g–1（表4）。本課題組前期研究顯示，栽培人參根和根莖中總人參皂苷質量分數為8.37～35.44 mg·g–1[23-24]，15～30 年林下山參總人參皂苷質量分數為26.50～38.55 mg·g–1[17]，紅參與白參中總人參皂苷質量分數分別為24.14～35.33、17.54～26.76 mg·g–1[18]。結果顯示，所測的鮮人參晶中總人參皂苷含量遠高于栽培人參，甚至高于紅參，一定程度上說明經過特殊的高壓、研磨技術及先進的凍干技術，促使鮮人參晶中溶出大量的人參皂苷活性成分；林下山參中的總人參皂苷則因采集時間、地點等原因呈現不同的含量差異。因此，種植環(huán)境、采集、保存時間和加工可能是影響人參皂苷含量的重要因素。

4 討論

G-Rb1、G-Re 和G-Rg1是人參藥材中的代表性指標成分，用于評價人參是否合格?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版中規(guī)定：本品按干燥品計算，含G-Rg1（C42H72O14）和G-Re（C48H82O18）的總量不得少于0.30%，G-Rb1（C54H92O23）不得少于0.20%[1]。據表4計算可得，林下山參中GRb1質量分數為0.24%～0.53%，G-Rg1和G-Re 的總質量分數為0.72%～0.94%；鮮人參晶中G-Rb1質量分數為0.43%，G-Rg1和G-Re 的總質量分數為1.21%。上述結果表明，林下山參與鮮人參晶均符合《中國藥典》2020 年版標準中的含量規(guī)定，且鮮人參晶G-Rg1和G-Re 的總含量遠高于《中國藥典》2020 年版的含量要求，因此，其內在質量具有較好的保證。

隨著現代科技的發(fā)展和對人參深入系統(tǒng)的研究，研究者發(fā)現人參皂苷是人參發(fā)揮藥理活性的物質基礎，已有大量研究報道了人參皂苷具有抗腫瘤、抗衰老、降血糖、保護神經系統(tǒng)及調節(jié)心腦血管系統(tǒng)的作用[25-27]，尤其是稀有人參皂苷，如G-Rg5、GRg3、G-Rk1、G-Rh1、G-Rh2及G-Rh4等[28-30]。由于野生人參瀕臨滅絕，目前長白山區(qū)系大力發(fā)展在天然林原始生境中直播人參的方式（原生態(tài)模式）生產的野山參（林下山參，暫定名為Panax ginsengC.A.Mey.cv.‘Silvaticus’）其“五形六體”與野生人參相當或一致[31]。表4結果顯示，林下山參和鮮人參晶中稀有人參皂苷（G-Rg6、G-F4、S-Rg3、R-Rg3、G-Rg5、G-Rk1、G-Rh4、G-Rk3、S-Rh1、R-Rh1、GRh2、S-PPT）總質量分數分別為208.55～429.19、334.95 μg·g–1，提示鮮人參晶可能具有較高的生物活性，有廣闊的開發(fā)利用前景。

除稀有人參皂苷以外，人參中含有豐富的常見人參皂苷，如G-Ra3、G-Rb2、G-Rc、G-Rd 和G-Ro等，含量之和約占總人參皂苷的90%以上[8]，本研究從5 批樣品中檢測到的常見人參皂苷總含量占比均高達95%以上。另外，單個人參皂苷在不同批次中各有差異，其中鮮人參晶中含量最高的人參皂苷個數為11 個，分別是G-Re、R-Rs3、G-Rg6、G-Rg1、S/R-Rf、S/R-Rg2、R-Rg3、R-Rh1及G-Ro，其余則分布在林下山參的不同批次中，其中LXS-202003樣品中分布的個數高達12 個，LXS-201308、LXS-202001、LXS-202002 樣品中含量最高的化合物分別為7、6、1 個。值得注意的是，批次為LXS-201308的樣品中不含S/R-Rs3和G-Rs4，且G-Rh2只存在于該批樣品中，有可能受采集時間和地點的影響。

本研究建立了同時測定39 個人參皂苷的UFLCMS/MS 分析方法，含量檢測結果在一定程度上說明，采用現代工藝技術開發(fā)的鮮人參晶，確實能溶出并較好地保存人參皂苷活性成分，充分保留了人參精華成分，從而發(fā)揮其營養(yǎng)價值和保健功能。其與林下山參比較，盡管人參皂苷含量有一定差異，但種類幾乎無變化。為進一步評估并確保鮮人參晶的質量與功效，有必要對更多批次的鮮人參晶樣品進行含量測定及分析研究。