酒炙廣地龍的炮制工藝優(yōu)選及HPLC特征圖譜分析

關(guān)水清 周改蓮 錢力 文建軍 王乃斌 謝雪婷

【摘 要】 目的：探討酒炙廣地龍的最佳炮制工藝，建立其HPLC特征圖譜。方法：采用正交試驗，以次黃嘌呤、肌苷、蛋白質(zhì)及水溶性浸出物含量為評價指標，優(yōu)選酒炙廣地龍的炮制工藝；再按最優(yōu)炮制工藝制備酒炙廣地龍樣品，建立其特征圖譜。結(jié)果：酒炙廣地龍飲片炮制過程中，4個因素影響程度依次為：炒制溫度>悶潤時間>炒制時間>加酒量，最佳炮制工藝為加酒量每100 kg廣地龍，黃酒量為15 kg，悶潤時間30 min，炒制溫度80 ℃及炒制時間10 min。建立以SETSAIL II AQ-C18柱，流動相甲醇（A）-5 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（B）梯度洗脫的指紋圖譜檢測方法，15批酒炙廣地龍確定了17個共有峰，指認了次黃嘌呤、尿苷、 肌苷、尿嘧啶4個共有峰，相似度為0.974～0.999。結(jié)論：次黃嘌呤、肌苷、蛋白質(zhì)及水溶性浸出物含量4個指標可作為廣地龍飲片酒炙炮制過程中的質(zhì)量評價指標，中試驗證評判所得最優(yōu)炮制工藝合理可行；建立的HPLC特征圖譜方法準確可靠，為酒炙廣地龍的質(zhì)量控制和現(xiàn)代研究提供了科學依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 廣地龍；酒炙；多指標評價；正交試驗；炮制工藝

【中圖分類號】R283.3 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2023）09-0029-07

Abstract：Objective Investigate the best processing technology of Pheretima aspergillum （E. Perrier） Processed with rice wine， and establish its HPLC characteristic chromatogram. Methods Orthogonal test was adopted， and the contents of hypoxanthine， inosine， protein and water-soluble extract were used as evaluation indicators， and the processing technology of Pheretima aspergillum （E. Perrier） Processed with rice wine was optimized; Then prepare 15 batches of Pheretima aspergillum （E. Perrier） Processed with rice wine according to the optimal processing technology， and Build its characteristic map.Results In the process of processing Pheretima aspergillum （E. Perrier） Processed with rice wine decoction pieces， the order of influence of four factors is： frying temperature>simmering time>frying time>amount of wine added.The best processing technology is that the amount of wine added is 100kg of Pheretima aspergillum （E.Perrier）， and the amount of yellow wine is 15 kg，the moisturizing time is 30 min， the frying temperature is 80 ℃ and the frying time is 10min.A fingerprint detection method using SETSAIL II AQ-C18 column and mobile phase methanol （A）-5mmol/L potassium dihydrogen phosphate solution （B） gradient elution was established. 17 common peaks were identified in 15 batches of Pheretima aspergillum （E. Perrier） Processed with rice wine. Four common peaks of hypoxanthine， uridine， inosine， and uracil were identified， and the similarity ranged from 0.974 to 0.999.Conclusion The four indexes of hypoxanthine， inosine， protein and water-soluble extract content can be used as quality evaluation indexes in the process of wine processing of Pheretima aspergillum （E.Perrier） Processed with rice wine decoction pieces，The pilot test proves that the optimal processing technology obtained is reasonable and feasible; the established HPLC characteristic chromatogram The method is accurate and reliable， and provides a scientific basis for the quality control and modern research of Pheretima aspergillum （E. Perrier） Processed with rice wine.

Keywords：Pheretima Aspergillum（E.Perrier）;Wine Roasting;Multi-index Evaluation; Orthogonal Test; Processing Technology

廣地龍為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）的干燥體［1］，具有清熱定驚、通絡、平喘、利尿的功效［1］。歷代記載諸多炮制方法［2-5］，如蛤粉制、酒制、滑石粉炒制、砂炒法等［2-5］，隨時代變遷今多以生品、酒制品為主［6-10］，中醫(yī)認為“藥材經(jīng)酒炙后能引藥上行，能增強其活血止痛”的作用［9-10］。

2020年版《中國藥典》中未收載酒炙廣地龍，飲片炮制僅描述“除去雜質(zhì)，洗凈，切段，干燥”，未見具體炮制參數(shù)、質(zhì)量控制無指紋圖譜等內(nèi)容［1］。當前市場銷售的廣地龍質(zhì)量的良莠不齊［11-16］，全國的地方炮制規(guī)范方法混雜不一，對其缺少相應的符合現(xiàn)代標準化、產(chǎn)業(yè)化的質(zhì)量標準，如依賴工人經(jīng)驗來決定輔料的用量、加工時間和炒制溫度，缺乏生產(chǎn)規(guī)范和技-術(shù)標準，質(zhì)量不穩(wěn)定且不可控，不利于現(xiàn)代企業(yè)傳承和規(guī)?；庸どa(chǎn)?，F(xiàn)今對酒炙品的工藝研究較多，但多以地龍中（次黃嘌呤、肌苷、蛋白質(zhì)、水溶性浸出物）單個或兩個為指標優(yōu)選工藝，未發(fā)現(xiàn)將這4種指標同時納入工藝評價，缺乏整體性評價優(yōu)化工藝［7-10］；已有學者［17-19］建立地龍指紋圖譜對其質(zhì)量控制提供參考，但鮮有報道酒炙廣地龍的指紋圖譜。

本研究建立了酒炙廣地龍的HPLC指紋圖譜，采用正交試驗對次黃嘌呤、肌苷、蛋白質(zhì)、水溶性浸出物4種指標綜合考察，綜合評價優(yōu)選酒炙廣地龍的炮制工藝，并借助藥企進行炮制工藝驗證，旨在為酒炙廣地龍質(zhì)量控制和現(xiàn)代研究提供科學依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀，美國安捷倫1200，美國安捷倫1260；UV檢測器-1780［島津儀器（蘇州）有限公司］；FeiniGen AQ- C18色譜柱（菲尼根有限公司），SETSAIL II AQ- C18色譜柱（贛州科飛儀器有限公司）；CTDC640型智能炒藥機；電子分析天平SQP型［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；KQ5200B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）、TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）、CW2002-Z紅外爐（艾美特電器有限公司）、HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）、SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）、DFT-200型手提式高速粉碎機（溫嶺市大機械有限公司）。

1.2 材料 生廣地龍：廣地龍藥材采自廣西、廣東的15個產(chǎn)地，經(jīng)暨南大學馬志國教授、廣西中醫(yī)藥大學周改蓮副教授鑒定為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier ）的干燥體，具體見表1。酒炙廣地龍：按每100g藥材加入15g黃酒，拌勻，悶潤30min，80℃炒制獲得。廣地龍及酒炙廣地龍的粉末制備：將藥材切片、打粉，打過60目篩，即可。

對照品次黃嘌呤（批號：wkq19021804）、肌苷（批號：wkq19012205 ）、尿苷（批號：wkq17100902）、鳥苷（批號：wkq17092012），質(zhì)量分數(shù)均≥98%，均購自四川維克奇生物科技有限公司；對照品考馬斯亮藍G250（批號：20190117）、牛血清白蛋白BSA（批號：20190117），均購自南京建成生物工程研究所。

甲醇（色譜純，F(xiàn)esher公司）、黃酒（浙江古越龍山紹興酒股份有限公司）、濃鹽酸（批號：20151288，廉江市愛廉化試劑有限公司）、磷酸（批號：20190108，成都金山化學試劑有限公司）、乙醇（批號：2018020201，成都市科隆化學品有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒炙廣地龍的制備 按2020年版《中國藥典》酒炙法（通則0213）方法進行。

2.2 廣地龍中次黃嘌呤和肌苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：FeiniGen AQ-C18柱（250 nm×4.6 nm，5 μm）；流動相：甲醇-水（5∶95）；檢測波長：250 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣體積：10 μL；檢測時間：25 min。按上述色譜條件進行檢測，廣地龍中各成分分離度良好，次黃嘌呤及肌苷對照品、供試品色譜圖分別如圖1～3所示。

2.2.2 溶液的制備 對照品溶液的配置：精密稱取次黃嘌呤2.56 mg和肌苷10.19 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加入適量純水，超聲溶解，加純水定容至刻度，即得。

供試品溶液的制備：取經(jīng)粉碎過篩的廣地龍粉末，精密稱定1 g，置于25 mL具塞錐形瓶中，加10 mL純水，搖勻，稱重，靜置30 min后，超聲1 h，用純水補足失重，搖勻倒入10 mL離心管中，然后以13000 r/min，常溫離心15 min，精密取上清液2 mL，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 線性關(guān)系考察 分別吸取次黃嘌呤標準品備用溶液0.05 mL、0.10 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.90 mL、1.20 mL、1.40 mL，分別置2 mL容量瓶中，各自加超純水定容搖勻，配成7個次黃嘌呤濃度溶液；再分別吸取肌苷標準品備用溶液0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL，分別置2 mL容量瓶中，各自加超純水定容搖勻，配成6個肌苷濃度溶液，按上述“2.1.1”色譜條件檢測，以次黃嘌呤、肌苷的峰面積為縱坐標（Y），相應標準品的濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線圖，獲得線性回歸方程。得回歸方程：次黃嘌呤Y=55198X-17.363，r = 0.9999；肌苷Y=29396X+184.42，r=0.9996；表明次黃嘌呤濃度在0.0064～0.1792 mg/mL與肌苷濃度在0.0510～0.5095 mg/mL范圍內(nèi)，兩種對照品的進樣濃度與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 方法學考察 精密移取“2.2.2”項下的對照品備用溶液適量，稀釋次黃嘌呤濃度為0.0512 mg/mL，肌苷濃度為0.3057 mg/mL，按“2.2.1”項下色譜條件各測定6次，獲得次黃嘌呤平均峰面積為2829.9（RSD=0.05%），肌苷平均峰面積為9222.0（RSD=0.08%），表明檢測的儀器精密度良好；取同一批廣地龍供試品溶液6份，進樣測定，計算得到次黃嘌呤含量的RSD為1.10%，肌苷含量的RSD為0.30%，表明該方法重復性良好；取同一廣地龍供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h進樣測定，計算得到次黃嘌呤峰面積的RSD為2.80%，肌苷峰面積的RSD為1.20%，結(jié)果表明供試品溶液12 h內(nèi)檢測穩(wěn)定；取已知含量的廣地龍粉末6份，精密稱定，分別加入“2.2.2”項下的標準品備用溶液（0.09 mL次黃嘌呤溶液和0.3 mL肌苷溶液），按“2.2.2”項下供試品制備方法提取樣品，經(jīng)測定得到次黃嘌呤平均回收率為99.66%（RSD=0.10%），肌苷平均回收率為100.20%（RSD=1.10%），表明測定方法滿足實驗要求。

2.3 廣地龍中蛋白質(zhì)的含量測定

2.3.1 蛋白質(zhì)標準溶液的制備 從4 ℃冰箱中取出儲存的牛血清白蛋白，精密稱定1 g，移至25 mL燒杯，加入適量純水充分溶解，移至100 mL潔凈容量瓶中，定容至刻度線，得到1.001g/mL的蛋白質(zhì)標準溶液，放4 ℃冰箱中存儲備用。

2.3.2 考馬斯亮藍溶液的制備 取考馬斯亮藍G-250，精密稱定100 mg，移至100 mL燒杯中，精確量取50.0 mL 95.0%乙醇溶液充分溶解，加入100.0 mL 85.0%磷酸溶液混勻，轉(zhuǎn)移至1000 mL容量瓶進行定容，搖勻后濾過，放4 ℃冰箱存儲備用。

2.3.3 樣品溶液的制備 取廣地龍粗粉約0.5 g，精密稱定。置25 mL錐形瓶中，移入純水（10 mL）浸泡30 min后，超聲30 min，搖勻倒入10 mL離心管中，然后以4200 r/min，常溫離心10 min，精密取1 mL廣地龍上清液，于10 mL容量瓶中，經(jīng)過定容，放于4 ℃冰箱中存儲備用。

2.3.4 最大吸收波長的確定 精密量取“2.3.1”項下的蛋白質(zhì)標準溶液及“2.3.3”項下的樣品溶液各0.5 mL，轉(zhuǎn)移到10mL具塞試管中，然后精密量取“2.3.2”項下的考馬斯亮藍溶液5.0 mL，搖勻，再靜置5 min，空白溶液同法制備。分別用紫外可見分光光度計在400～900 nm范圍進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在595 nm處兩者均有最大吸收峰，選取595 nm作為最大吸收波長。

2.3.5 線性關(guān)系考察 分別精確移取“2.3.1”項下蛋白質(zhì)標準溶液適量，依次稀釋為0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.07 mg/mL、0.11 mg/mL、0.14 mg/mL，按“2.3.4”項下方法操作和分析，以蛋白濃度作為橫坐標X，吸光度值作為縱坐標Y，得到回歸方程為Y=3.2149X+0.0458（r=0.9990），即濃度在0.02～0.14 mg/mL范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與吸光度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

2.3.6 方法學考察 精密取0.5 mL“2.3.1”項下蛋白質(zhì)標準溶液，轉(zhuǎn)移到10 mL具塞試管中，按“2.3.4”項下蛋白質(zhì)顯色測定方法檢測6次，平均吸光度為0.3725（RSD=0.18%），表明儀器精密度良好；取0.5 mL已制備好的廣地龍供試品溶液，轉(zhuǎn)移到10 mL具塞試管中，分別在0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h，按“2.3.4”項下蛋白質(zhì)顯色測定方法，吸光度值的RSD為2.73%，表明廣地龍溶液3.5h內(nèi)穩(wěn)定性良好；取同一批廣地龍供試品溶液6份，按“2.3.3”項下供試品制備方法，按“2.3.4”項下蛋白質(zhì)顯色測定方法，測定廣地龍生品蛋白質(zhì)平均含量為19.53 mg/g（RSD=1.30%），表明該方法重復性較好；取已知含量的廣地龍粉末6份，加入蛋白質(zhì)標準溶液適量，按“2.3.3”項下供試品方法制備，按“2.3.4”項下蛋白質(zhì)顯色測定方法，經(jīng)測定平均回收率為97.85%（RSD=1.42%），表明上述方法回收率較好。

2.4 水溶性浸出物含量測定 照水溶性浸出物測定法（《中國藥典》2020年版四部附錄“2201”浸出物測定法）項下的熱浸法測定。

2.5 酒炙廣地龍炮制工藝的優(yōu)化 通過對地龍相關(guān)文獻查閱及結(jié)合前期預實驗結(jié)果，選擇以加酒量（A）、悶潤時間（B）、炒制溫度（C）、炒制時間（D）為4個考察因素，以次黃嘌呤、肌苷、蛋白質(zhì)及水溶性浸出物含量的綜合評分為評價指標，優(yōu)化酒炙廣地龍的炮制工藝。依據(jù)其藥理作用和研究進展［17-18］進行各個指標的權(quán)重分配，綜合得分（Z）=次黃嘌呤得分×40%+肌苷得分×20%＋蛋白質(zhì)得分×20%＋水溶性浸出物得分×20%，即指標得分=該指標含量/該指標所在組中最高含量。因素與水平見表2，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

由表3可知，4個因素對工藝影響程度依次為C（炒制溫度）>B（悶潤時間）>D（炒制時間）>A（加酒量），而各個因素不同水平的影響程度依次為C1>C2>C3、B2>B3>B1、D1>D3>D2、A3>A2>A1。由表4可知，4個因素對酒炙廣地龍工藝測定指標的綜合性評分沒有顯著性影響（P>0.05）。結(jié)合結(jié)果分析，最佳酒炙工藝應為：A3B2C1D1，即加入黃酒量為15%，密封好悶潤30 min，放置于溫度80 ℃炒制，炒制時間10 min。

2.6 中試驗證 在酒炙廣地龍小試的工藝基礎上，課題組于廣東康美藥業(yè)股份有限公司普寧二期廠房生產(chǎn)車間進行中試，以最佳炒制時間對應的產(chǎn)品外觀色澤和質(zhì)地等作為把控指標，根據(jù)實際生產(chǎn)需求，取凈廣地龍10 kg，加入黃酒（每100 kg地龍，加入黃酒12.5 kg）拌勻，在密閉容器內(nèi)悶潤30 min，置智能電磁炒藥機中，250 ℃加熱，炒制一定程度時，取出，攤開，放涼。

將酒炙廣地龍擴大到6批次進行生產(chǎn)，次黃嘌呤、肌苷、蛋白質(zhì)及水溶性浸出物均相對穩(wěn)定，見表5。查閱古今炮制書籍可知研究飲片的炮制工藝條件，保證其性狀合格是最基本的，觀察中試產(chǎn)品的外觀表面色澤焦黃色，偶見焦斑，聞之具較濃酒香氣，且各指標含量結(jié)果均符合企業(yè)生產(chǎn)要求，故評判該酒炙工藝合理。

2.7 酒炙廣地龍的HPLC特征圖譜分析

2.7.1 色譜條件 色譜柱：SETSAIL II AQ-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇（A）-5 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（B）；梯度洗脫（0～15 min，0%A；15～25 min，5%A；25～50 min，15%A）；檢測波長：254 nm；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣體積：10 μL；檢測時間：50 min。

2.7.2 溶液的制備 對照品溶液制備：精密稱取5種核苷類對照品，分別加純水配制成濃度為0.1152 mg/L次黃嘌呤溶液、0.3057 mg/L肌苷溶液、0.0125 mg/L尿嘧啶溶液、0.013 mg/L尿苷溶液、0.0225 mg/L黃嘌呤溶液、0.018 mg/L鳥苷溶液。

供試品溶液制備：精密稱取廣地龍飲片粉末約1.0 g，放入8 mL純水，靜置20 min后，密塞并稱重，超聲40 min，待放冷至室溫，補足失重，離心13000 r/min，時間15 min，過0.45 μm濾膜，即可。

2.7.3 方法學考察 取同一批廣地龍供試品溶液，按“2.7.1”色譜條件連續(xù)重復進樣6次，以次黃嘌呤為參照峰計算各共有峰相對保留峰面積，結(jié)果表明共有峰整體相似度在0.999～1.000之間，相對保留時間RSD﹤1%，表明儀器性能良好；取同一批廣地龍飲片6份，按“2.7.2”方法制備溶液，按“2.7.1”色譜條件連續(xù)進樣，結(jié)果表明共有峰的整體相似度為1.000，共有峰相對保留時間RSD﹤1%，表明方法重復性良好；取同一批廣地龍供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h進樣測定，以次黃嘌呤為參照峰，計算各共有峰相對保留時間，結(jié)果表明各共有峰的相對保留時間RSD﹤1%，表明本供試品在12h內(nèi)檢測數(shù)據(jù)穩(wěn)定。

2.7.4 特征圖譜的構(gòu)建和解析

2.7.4.1 色譜峰的指認 取同一批廣地龍供試品溶液，“2.7.2”項下5種對照品溶液，按“2.7.1”項色譜條件依次進樣，記錄HPLC色譜圖。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版本）”分析，得到酒炙廣地龍與對照品指紋圖譜，如圖4所示。確認酒炙廣地龍指紋圖譜中峰7為次黃嘌呤，峰9為尿苷，峰13為肌苷，峰14為尿嘧啶。

2.7.4.2 特征圖譜的構(gòu)建 將15批酒炙廣地龍（J1～J15）供試品溶液，依次按“2.7.1”項色譜條件測定，記錄HPLC色譜圖。酒炙廣地龍分別以J1色譜圖為參照圖譜，以時間寬度0.4 min、時間范圍7～50 min，經(jīng)處理得到酒炙廣地龍指紋圖譜共有峰17個。如圖5所示。

2.7.4.3 特征圖譜相似度分析 以J1樣品的HPLC色譜圖為參照圖譜，以時間寬度0.4 min、時間范圍7～50 min，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版本）”分析處理，15批酒炙廣地龍指紋圖譜共有峰整體相似度在0.974～0.999之間，結(jié)果表明酒炙廣地龍飲片群體特征的一致性較高。

2.7.4.4 特征指紋圖譜的制定 對15批酒炙廣地龍飲片及次黃嘌呤等4種對照品的特征圖譜的出峰時間比對，制定出酒炙廣地龍飲片特征圖譜。如圖6所示。

3 討論

蛋白質(zhì)屬于地龍干品中占比最大的主要成分之一［20-21］，具有抗血栓、溶栓和舒緩平滑肌［22-25］等多方面的藥理作用；以次黃嘌呤、肌苷為代表的核苷類成分，可作為廣地龍藥材質(zhì)量評價的指標［14，17-19］；水溶性浸出物作為地龍質(zhì)量評價的重要指標［20，26-27］，考慮以浸出物含量與特定活性成分含量組成的復合指標，可更好地控制飲片質(zhì)量。因此，以酒炙廣地龍中次黃嘌呤、肌苷、蛋白質(zhì)和水溶性浸出物含量的綜合評分為評價指標，重點考察了悶潤時間、炒制溫度、炒制時間、烘制溫度等因素，篩選獲得了酒炙廣地龍的炮制工藝。隨后課題組在中藥飲片企業(yè)生產(chǎn)車間進行中試驗證該酒炙炮制工藝合理性。

研究前期對流動相系統(tǒng)及色譜條件進行優(yōu)選，建立了酒炙廣地龍飲片的HPLC指紋圖譜方法，制定酒炙廣地龍的特征圖譜。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，15批不同產(chǎn)地酒炙廣地龍飲片標定的共有色譜峰為17個，指認了次黃嘌呤、尿苷、 肌苷、尿嘧啶4個共有峰。比較15批不同產(chǎn)地的酒炙廣地龍的色譜圖后發(fā)現(xiàn)，雖然各批樣品中成分的含量存在一定的差異，但色譜圖概貌相對一致，整體分離度較好且穩(wěn)定性強，特征圖譜是其內(nèi)在化學成分種類與數(shù)量的表里反映，可對酒炙廣地龍飲片組分群體特征的相關(guān)性作出判斷，能充分反映酒炙廣地龍飲片的質(zhì)量特征，為該飲片標準的制定和質(zhì)量評價提供了新的依據(jù)。

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（收稿日期：2022-09-01 編輯：陶希睿）

基金項目：2022年度廣西高校中青年教師科研基礎能力提升項目 （2022KY0543）；右江民族醫(yī)學院2021年度校級科研課題項目（yy2021sk041）。

作者簡介：關(guān)水清（1993—），女，漢族，碩士，助教，研究方向為中藥質(zhì)量標準及炮制機制研究。E-mail：554981031@qq.com

通信作者：周改蓮（1981—），女，漢族，博士，副教授，研究方向為中藥質(zhì)量標準及炮制機制研究。E-mail：zhgllhw@126.com