遼寧梨樹枝枯病病原菌Diplodia seriata 的分離與鑒定

丁丹丹 劉博 李爽 趙繼榮 程國亭 回虹燕 徐成楠

摘要

在遼寧興城秋子梨栽培園出現(xiàn)一種新型枝干病害，主要癥狀為枝枯及木質(zhì)部壞死。為明確梨樹枝枯病病原菌的分類地位，本研究從遼寧興城地區(qū)采樣，經(jīng)過菌株分離培養(yǎng)和致病性測定，以及形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合病原菌的ITS、EF1α和βtubulin多基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定引起秋子梨枝枯病的病原菌為色二孢Diplodia?seriata。研究結(jié)果為明確色二孢引起的遼寧梨樹枝枯病發(fā)生規(guī)律和防治措施的制定提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

梨樹;?枝枯病;?系統(tǒng)發(fā)育分析;?色二孢

中圖分類號：

S?436.612

文獻標(biāo)識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022045

Isolation?and?identification?of?the?pathogen?Diplodia?seriata?causing?stem?blight?disease?on?pear?in?Liaoning

DING?Dandan，?LIU?Bo，?LI?Shuang，?ZHAO?Jirong，?CHENG?Guoting，?HUI?Hongyan，?XU?Chengnan*

（College?of?Life?Science，?Yanan?University，?Shaanxi?Key?Laboratory?of?Chinese?Jujube，Yanan?716000，?China）

Abstract

A?new?stem?disease?on?Pyrus?ussuriensis?orchard?with?typical?symptoms?including?branches?dieback?and?xylem?necrosis?was?observed?in?Xingcheng?city，?Liaoning?province.?In?order?to?clarify?the?pathogen?causing?stem?blight?disease?on?pear?in?Liaoning，?samples?were?collected，?meanwhile，?isolates?were?purified?and?Kochs?postulation?was?carried?out.?Based?on?morphological?features?and?combined?gene?sequence?analysis?on?ITS，?EF1α?and?βtubulin，?the?causal?pathogen?of?this?new?disease?was?identified?to?be?Diplodia?seriata.?Our?results?provided?a?theoretical?basis?for?further?research?on?the?disease?epidemic?and?control?strategy?of?stem?blight?disease?on?P.ussuriensis?in?Liaoning.

Key?words

pear;?stem?blight;?phylogeny?analysis;?Diplodia?seriata

梨是世界性主要果樹品種之一，我國梨樹種植面積和產(chǎn)量繼蘋果和柑橘之后居第三位［1］。梨樹在我國種植范圍廣泛，根據(jù)國家統(tǒng)計局統(tǒng)計數(shù)據(jù)，截至2020年底，我國梨栽植面積達94萬hm2，總產(chǎn)量達到1?781萬t，居全球首位。遼寧是我國梨栽培第二大省，秋子梨Pyrus?ussuriensis?Maxim.、白梨P.bretschneideri?Rehd.、西洋梨P.communis?L.和沙梨P.pyrifolia?（Burm.F.）?Nakai四大系統(tǒng)均有分布。很多特色梨品種在國內(nèi)外均享有盛譽［2］。梨輪紋病、枝枯病和潰瘍病長期危害我國北方梨產(chǎn)區(qū)，近年來作者曾在遼寧省興城地區(qū)發(fā)現(xiàn)間座殼Diaporthe?nobilis侵染‘錦豐梨引起枝枯癥狀［3］。隨著遼寧省矮砧密植梨樹新栽培模式的發(fā)展，真菌侵染引起的枝干病害日趨嚴(yán)重，甚至造成幼樹死亡，影響當(dāng)?shù)乩鏄浒杳苤残略耘嗄Ｊ降膹V泛推廣。

2019年8月，作者在遼寧省興城市一個矮化栽培梨園發(fā)現(xiàn)一種新病害，癥狀主要表現(xiàn)為當(dāng)年生枝條枯萎、主干木質(zhì)部壞死，該病害的發(fā)生嚴(yán)重影響新建梨園幼樹的成活率，阻礙了遼寧興城地區(qū)矮砧密植梨樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，本研究在對遼寧秋子梨樹枝枯病害進行調(diào)查的基礎(chǔ)上，對癥狀進行了詳細(xì)描述，對采集的病樣進行分離純化，結(jié)合真菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)對其病原菌進行鑒定，明確該病原種類歸屬，以期為該病害的發(fā)生流行規(guī)律及防治策略研究奠定理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試材料

2019年8月在遼寧省興城市梨樹枝枯病發(fā)生嚴(yán)重梨園進行調(diào)研采樣。梨園栽培模式為矮化密植新型栽植方式，砧木為杜梨Pyrus?betulifolia?Bunge，嫁接接穗為秋子梨。采集具有梨樹枝枯病典型癥狀的患病枝條，觀察拍照并記錄病害癥狀特征。

供試培養(yǎng)基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和2%水瓊脂培養(yǎng)基（WA）。其他材料包括：滅菌松針30根;2×Taq?MasterMix、DNA?marker?DL2000，康為世紀(jì)公司;CTAB、Tris、EDTA、瓊脂糖，生工生物工程（上海）股份有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2?病原菌的分離

采用常規(guī)組織分離法分離病原。從發(fā)病枝條的病健交界處切取5?mm?×?5?mm大小組織塊，用清水洗凈后，先用75%乙醇表面消毒45?s，再用無菌水漂洗2次后置于PDA培養(yǎng)基上于25℃黑暗培養(yǎng)。挑取菌絲體進行純化，將純化后的菌株4℃保存于延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物病原真菌學(xué)與病害綜合防治研究室。選取代表性菌株pearbot1進行后續(xù)試驗。

1.3?分離株致病性測定

采用有傷和無傷接種方式測定pearbot1對梨樹枝條和果實的致病性。選擇健康的當(dāng)年生秋子梨枝條及果實備用，將枝條截為25?cm長枝段，用無菌水清洗后用75%乙醇表面消毒，兩端封蠟。自然風(fēng)干后使用4?mm打孔器在枝段及果實表皮打上圓形傷口并去掉皮層，同時用4?mm打孔器打取病菌菌絲塊，菌絲面貼至有傷或無傷枝條以及果實傷口表面。以接種PDA作為對照。接種后枝條置于搪瓷盤中用塑料膜密封，果實置于塑料密封盒中，25℃恒溫保濕培養(yǎng)。有傷、無傷枝條及果實分別接種3根枝條及3個果實，每枝條和果實設(shè)置3個接種點并均勻分布，重復(fù)3次。逐日觀察記錄枝條及果實發(fā)病情況，待接種試材出現(xiàn)癥狀后，再次進行組織分離培養(yǎng)并用形態(tài)學(xué)方法鑒定病原菌。

1.4?病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株pearbot1接種于PDA平板上，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)7?d，觀察并記錄菌落生長特性，同時將菌株接種于含有滅菌松針的2%水瓊脂培養(yǎng)基上進行誘導(dǎo)產(chǎn)孢觀察。待病原菌產(chǎn)孢后，挑取分生孢子器制成臨時玻片，用顯微鏡觀察其形態(tài)，拍照并測量分生孢子大小，與文獻報道的相關(guān)病原菌進行比對分析。

1.5?病原菌分子生物學(xué)鑒定

收集培養(yǎng)7?d的病原菌菌絲體，采用改良的CTAB法［4］提取菌絲DNA。分別利用真菌通用引物ITS1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′），EF1

728F（5′CATCGAGAAGTTCGAGAAGG3′）和EF1986R（5′TACTTGAAGGAACCCTTACC3′），Bt2a（5′GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3′）和Bt2b（5′ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC3′）對病原菌的rDNAITS、EF1α和βtubulin基因進行擴增;擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將獲得的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，并提交序列至GenBank。下載GenBank中已發(fā)表的色二孢及葡萄座腔菌相關(guān)菌株序列信息，利用MEGA?7.0軟件的最大似然法（maximum?likelihood，ML）構(gòu)建3基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用菌株及登錄號見表1。

2?結(jié)果與分析

2.1?病害田間調(diào)查與病原菌分離純化

2019年至2020年對遼寧省興城市梨樹枝枯病田間病害發(fā)生情況調(diào)查表明，該病害主要危害梨樹主干和當(dāng)年生幼嫩枝條，并且主要危害新建梨園中2～3年生幼樹，梨園病株率為25%。當(dāng)年生梨樹枝條染病部位黑褐色，病斑呈梭形沿枝條上下擴展。梨樹主干枝枯癥狀多在矮化砧木處開始發(fā)生，病原菌從矮化砧木修剪傷口處侵染，沿主枝維管束組織擴展，導(dǎo)致主干枝條組織壞死，枝干外部呈現(xiàn)棕褐色至黑褐色病斑，病斑偶爾凹陷，發(fā)病梨樹枝干組織表面著生黑色小顆粒狀物即為病原菌的子實體。發(fā)病嚴(yán)重的梨樹整株枯死，將枝條橫切后，可見木質(zhì)部一側(cè)維管束組織壞死，變?yōu)樽睾稚蚝谏▓D1）。通過對發(fā)病枝條組織分離培養(yǎng)，獲得形態(tài)學(xué)表現(xiàn)一致的疑似病原分離株25株，編號為pearbot1～pearbot25。選取代表性菌株pearbot1進行后續(xù)試驗。

2.2?分離株致病性測定

在健康梨樹有傷離體枝條和果實表面接種分離株pearbot1均可引致枝枯病癥狀的發(fā)生。梨樹離體枝條接種后2?d，接種點部位出現(xiàn)黑褐色水漬狀病斑，病斑凹陷并向兩端擴展，5?d后接種枝條一側(cè)木質(zhì)部組織變?yōu)楹谏?。果實接種后2?d，接種點部位呈圓形黑褐色水漬狀病斑，切開發(fā)病果實，可見果肉組織變?yōu)楹诤稚?。無傷接種以及接種PDA的對照枝條及果實未出現(xiàn)任何癥狀（圖2）。從接種后發(fā)病的枝條及果實上重新分離到該病原菌，根據(jù)柯赫氏法則，分離株是引起梨樹枝枯病的病原菌。

2.3?病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將代表性分離株pearbot1在PDA平板上25℃暗培養(yǎng)，菌落生長速度較快，培養(yǎng)2?d菌落直徑可達8.0?cm。菌落生長初期呈白色，氣生菌絲發(fā)達，邊緣整齊;后期菌落呈灰色至黑色，菌絲呈簇狀直立生長，生長至培養(yǎng)皿皿蓋處（圖3a）。分離株在含滅菌松針的2%水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)15?d后產(chǎn)生分生孢子器。分生孢子器散生、單室、近球形、器壁黑色、近炭質(zhì);分生孢子單胞、橢圓形、兩端鈍圓，初期無色透明，后期轉(zhuǎn)為棕色，分生孢子大小為（24.82±3.09）μm?×（10.69±1.15）μm?（n=20）（圖3b）。根據(jù)上述形態(tài)學(xué)特征將所獲病原菌分離株初步鑒定為色二孢屬Diplodia真菌。

2.4?病原菌多基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

擴增代表菌株pearbot1核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（ITS）、α延伸因子序列（EF1α）和微管蛋白序列（βtubulin），分別得到大小為555、260?bp和432?bp的基因片段。BLAST序列比對結(jié)果顯示，菌株的3段保守基因分別與色二孢Diplodia?seriata相關(guān)基因相似性達到99%，將所有序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號分別為OM018671、OM063100和OM063099。

下載NCBI數(shù)據(jù)庫中色二孢屬以及葡萄座腔菌科其他屬相關(guān)物種的ITS、EF1α和βtubulin相關(guān)序列，利用MEGA軟件選擇最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖4可以看到分離株pearbot1與色二孢的模式菌株CBS121885T、CBS112876T和CBS112555T的序列聚在同一個分支，而與其他種親緣關(guān)系較遠，該獨立分支自舉支持率達到100%（圖4）。結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征，將該病原菌鑒定為色二孢Diplodia?seriata。

3?結(jié)論與討論

本研究對遼寧省興城市矮化密植梨園中的梨樹枝枯病進行病害診斷，分離獲得病原菌分離株并且在梨樹枝條和果實上驗證了其致病性。通過傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)特征結(jié)合多基因的系統(tǒng)發(fā)育分析對病原菌進行了鑒定，確定引致該病害的病原菌為色二孢?Diplodia?seriata，田間病害調(diào)研及實驗室病菌培養(yǎng)過程中均未發(fā)現(xiàn)其有性階段。

Diplodia?seriata是葡萄座腔菌科真菌中的重要一員，廣泛分布于世界上大多數(shù)熱帶及溫帶地區(qū)［56］。D.seriata是一種重要的植物病原真菌，寄主范圍十分廣泛，可以侵染梨和蘋果等多種植物的枝干和果實，引起葉斑病、果實黑腐病、枝干潰瘍及枝枯病等多種病害，造成巨大的經(jīng)濟損失［78］。近年來，色二孢屬真菌作為葡萄、蘋果和梨樹等重要經(jīng)濟果樹病原菌在國內(nèi)外被廣泛報道［911］，D.seriata引起梨樹潰瘍和枝枯等癥狀分別在中國、土耳其和美國有發(fā)生報道［5，?1314］。由于葡萄座腔菌科真菌極少在田間和實驗室內(nèi)產(chǎn)生有性階段，該科真菌分類主要依賴無性型分生孢子器和分子孢子形態(tài)特征［1516］。隨著DNA序列分析及多基因分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展，基于形態(tài)學(xué)特征和分子特征的該科真菌系統(tǒng)分類逐漸得到了廣泛應(yīng)用，也極大地促進了植物病原真菌系統(tǒng)分類學(xué)的發(fā)展［17］。我們在田間調(diào)研發(fā)現(xiàn)，矮砧密植栽培秋子梨時，矮化砧木存在剪鋸口，而傷口是該病原菌侵染的重要途徑。Slippers等［18］的研究表明，D.seriata等葡萄座腔菌科真菌通常作為一種弱寄生菌或內(nèi)生真菌存在于寄主體內(nèi)，在本研究中僅有傷枝條接種發(fā)病也印證了這一觀點，因此在梨樹枝枯病的防治過程中更應(yīng)高度重視梨樹砧木嫁接傷口的保護，避免病原菌從該處侵入寄主危害主干。本文研究結(jié)果為進一步探索由色二孢引起的梨樹枝枯病的致病機制和綜合防治提供了理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田?喆）