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    遼寧梨樹枝枯病病原菌Diplodia seriata 的分離與鑒定

    2023-06-05 20:42:23丁丹丹劉博李爽趙繼榮程國亭回虹燕徐成楠
    植物保護(hù) 2023年3期

    丁丹丹 劉博 李爽 趙繼榮 程國亭 回虹燕 徐成楠

    摘要

    在遼寧興城秋子梨栽培園出現(xiàn)一種新型枝干病害,主要癥狀為枝枯及木質(zhì)部壞死。為明確梨樹枝枯病病原菌的分類地位,本研究從遼寧興城地區(qū)采樣,經(jīng)過菌株分離培養(yǎng)和致病性測(cè)定,以及形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合病原菌的ITS、EF1α和βtubulin多基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定引起秋子梨枝枯病的病原菌為色二孢Diplodia?seriata。研究結(jié)果為明確色二孢引起的遼寧梨樹枝枯病發(fā)生規(guī)律和防治措施的制定提供了理論基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞

    梨樹;?枝枯病;?系統(tǒng)發(fā)育分析;?色二孢

    中圖分類號(hào):

    S?436.612

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:?A

    DOI:?10.16688/j.zwbh.2022045

    Isolation?and?identification?of?the?pathogen?Diplodia?seriata?causing?stem?blight?disease?on?pear?in?Liaoning

    DING?Dandan,?LIU?Bo,?LI?Shuang,?ZHAO?Jirong,?CHENG?Guoting,?HUI?Hongyan,?XU?Chengnan*

    (College?of?Life?Science,?Yanan?University,?Shaanxi?Key?Laboratory?of?Chinese?Jujube,Yanan?716000,?China)

    Abstract

    A?new?stem?disease?on?Pyrus?ussuriensis?orchard?with?typical?symptoms?including?branches?dieback?and?xylem?necrosis?was?observed?in?Xingcheng?city,?Liaoning?province.?In?order?to?clarify?the?pathogen?causing?stem?blight?disease?on?pear?in?Liaoning,?samples?were?collected,?meanwhile,?isolates?were?purified?and?Kochs?postulation?was?carried?out.?Based?on?morphological?features?and?combined?gene?sequence?analysis?on?ITS,?EF1α?and?βtubulin,?the?causal?pathogen?of?this?new?disease?was?identified?to?be?Diplodia?seriata.?Our?results?provided?a?theoretical?basis?for?further?research?on?the?disease?epidemic?and?control?strategy?of?stem?blight?disease?on?P.ussuriensis?in?Liaoning.

    Key?words

    pear;?stem?blight;?phylogeny?analysis;?Diplodia?seriata

    梨是世界性主要果樹品種之一,我國梨樹種植面積和產(chǎn)量繼蘋果和柑橘之后居第三位[1]。梨樹在我國種植范圍廣泛,根據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),截至2020年底,我國梨栽植面積達(dá)94萬hm2,總產(chǎn)量達(dá)到1?781萬t,居全球首位。遼寧是我國梨栽培第二大省,秋子梨Pyrus?ussuriensis?Maxim.、白梨P.bretschneideri?Rehd.、西洋梨P.communis?L.和沙梨P.pyrifolia?(Burm.F.)?Nakai四大系統(tǒng)均有分布。很多特色梨品種在國內(nèi)外均享有盛譽(yù)[2]。梨輪紋病、枝枯病和潰瘍病長期危害我國北方梨產(chǎn)區(qū),近年來作者曾在遼寧省興城地區(qū)發(fā)現(xiàn)間座殼Diaporthe?nobilis侵染‘錦豐梨引起枝枯癥狀[3]。隨著遼寧省矮砧密植梨樹新栽培模式的發(fā)展,真菌侵染引起的枝干病害日趨嚴(yán)重,甚至造成幼樹死亡,影響當(dāng)?shù)乩鏄浒杳苤残略耘嗄J降膹V泛推廣。

    2019年8月,作者在遼寧省興城市一個(gè)矮化栽培梨園發(fā)現(xiàn)一種新病害,癥狀主要表現(xiàn)為當(dāng)年生枝條枯萎、主干木質(zhì)部壞死,該病害的發(fā)生嚴(yán)重影響新建梨園幼樹的成活率,阻礙了遼寧興城地區(qū)矮砧密植梨樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此,本研究在對(duì)遼寧秋子梨樹枝枯病害進(jìn)行調(diào)查的基礎(chǔ)上,對(duì)癥狀進(jìn)行了詳細(xì)描述,對(duì)采集的病樣進(jìn)行分離純化,結(jié)合真菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其病原菌進(jìn)行鑒定,明確該病原種類歸屬,以期為該病害的發(fā)生流行規(guī)律及防治策略研究奠定理論基礎(chǔ)。

    1?材料與方法

    1.1?供試材料

    2019年8月在遼寧省興城市梨樹枝枯病發(fā)生嚴(yán)重梨園進(jìn)行調(diào)研采樣。梨園栽培模式為矮化密植新型栽植方式,砧木為杜梨Pyrus?betulifolia?Bunge,嫁接接穗為秋子梨。采集具有梨樹枝枯病典型癥狀的患病枝條,觀察拍照并記錄病害癥狀特征。

    供試培養(yǎng)基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)和2%水瓊脂培養(yǎng)基(WA)。其他材料包括:滅菌松針30根;2×Taq?MasterMix、DNA?marker?DL2000,康為世紀(jì)公司;CTAB、Tris、EDTA、瓊脂糖,生工生物工程(上海)股份有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    1.2?病原菌的分離

    采用常規(guī)組織分離法分離病原。從發(fā)病枝條的病健交界處切取5?mm?×?5?mm大小組織塊,用清水洗凈后,先用75%乙醇表面消毒45?s,再用無菌水漂洗2次后置于PDA培養(yǎng)基上于25℃黑暗培養(yǎng)。挑取菌絲體進(jìn)行純化,將純化后的菌株4℃保存于延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物病原真菌學(xué)與病害綜合防治研究室。選取代表性菌株pearbot1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

    1.3?分離株致病性測(cè)定

    采用有傷和無傷接種方式測(cè)定pearbot1對(duì)梨樹枝條和果實(shí)的致病性。選擇健康的當(dāng)年生秋子梨枝條及果實(shí)備用,將枝條截為25?cm長枝段,用無菌水清洗后用75%乙醇表面消毒,兩端封蠟。自然風(fēng)干后使用4?mm打孔器在枝段及果實(shí)表皮打上圓形傷口并去掉皮層,同時(shí)用4?mm打孔器打取病菌菌絲塊,菌絲面貼至有傷或無傷枝條以及果實(shí)傷口表面。以接種PDA作為對(duì)照。接種后枝條置于搪瓷盤中用塑料膜密封,果實(shí)置于塑料密封盒中,25℃恒溫保濕培養(yǎng)。有傷、無傷枝條及果實(shí)分別接種3根枝條及3個(gè)果實(shí),每枝條和果實(shí)設(shè)置3個(gè)接種點(diǎn)并均勻分布,重復(fù)3次。逐日觀察記錄枝條及果實(shí)發(fā)病情況,待接種試材出現(xiàn)癥狀后,再次進(jìn)行組織分離培養(yǎng)并用形態(tài)學(xué)方法鑒定病原菌。

    1.4?病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

    將菌株pearbot1接種于PDA平板上,25℃恒溫黑暗培養(yǎng)7?d,觀察并記錄菌落生長特性,同時(shí)將菌株接種于含有滅菌松針的2%水瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)孢觀察。待病原菌產(chǎn)孢后,挑取分生孢子器制成臨時(shí)玻片,用顯微鏡觀察其形態(tài),拍照并測(cè)量分生孢子大小,與文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)病原菌進(jìn)行比對(duì)分析。

    1.5?病原菌分子生物學(xué)鑒定

    收集培養(yǎng)7?d的病原菌菌絲體,采用改良的CTAB法[4]提取菌絲DNA。分別利用真菌通用引物ITS1(5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′)和ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′),EF1

    728F(5′CATCGAGAAGTTCGAGAAGG3′)和EF1986R(5′TACTTGAAGGAACCCTTACC3′),Bt2a(5′GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3′)和Bt2b(5′ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC3′)對(duì)病原菌的rDNAITS、EF1α和βtubulin基因進(jìn)行擴(kuò)增;擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。將獲得的基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì),并提交序列至GenBank。下載GenBank中已發(fā)表的色二孢及葡萄座腔菌相關(guān)菌株序列信息,利用MEGA?7.0軟件的最大似然法(maximum?likelihood,ML)構(gòu)建3基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用菌株及登錄號(hào)見表1。

    2?結(jié)果與分析

    2.1?病害田間調(diào)查與病原菌分離純化

    2019年至2020年對(duì)遼寧省興城市梨樹枝枯病田間病害發(fā)生情況調(diào)查表明,該病害主要危害梨樹主干和當(dāng)年生幼嫩枝條,并且主要危害新建梨園中2~3年生幼樹,梨園病株率為25%。當(dāng)年生梨樹枝條染病部位黑褐色,病斑呈梭形沿枝條上下擴(kuò)展。梨樹主干枝枯癥狀多在矮化砧木處開始發(fā)生,病原菌從矮化砧木修剪傷口處侵染,沿主枝維管束組織擴(kuò)展,導(dǎo)致主干枝條組織壞死,枝干外部呈現(xiàn)棕褐色至黑褐色病斑,病斑偶爾凹陷,發(fā)病梨樹枝干組織表面著生黑色小顆粒狀物即為病原菌的子實(shí)體。發(fā)病嚴(yán)重的梨樹整株枯死,將枝條橫切后,可見木質(zhì)部一側(cè)維管束組織壞死,變?yōu)樽睾稚蚝谏▓D1)。通過對(duì)發(fā)病枝條組織分離培養(yǎng),獲得形態(tài)學(xué)表現(xiàn)一致的疑似病原分離株25株,編號(hào)為pearbot1~pearbot25。選取代表性菌株pearbot1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

    2.2?分離株致病性測(cè)定

    在健康梨樹有傷離體枝條和果實(shí)表面接種分離株pearbot1均可引致枝枯病癥狀的發(fā)生。梨樹離體枝條接種后2?d,接種點(diǎn)部位出現(xiàn)黑褐色水漬狀病斑,病斑凹陷并向兩端擴(kuò)展,5?d后接種枝條一側(cè)木質(zhì)部組織變?yōu)楹谏?。果?shí)接種后2?d,接種點(diǎn)部位呈圓形黑褐色水漬狀病斑,切開發(fā)病果實(shí),可見果肉組織變?yōu)楹诤稚?。無傷接種以及接種PDA的對(duì)照枝條及果實(shí)未出現(xiàn)任何癥狀(圖2)。從接種后發(fā)病的枝條及果實(shí)上重新分離到該病原菌,根據(jù)柯赫氏法則,分離株是引起梨樹枝枯病的病原菌。

    2.3?病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

    將代表性分離株pearbot1在PDA平板上25℃暗培養(yǎng),菌落生長速度較快,培養(yǎng)2?d菌落直徑可達(dá)8.0?cm。菌落生長初期呈白色,氣生菌絲發(fā)達(dá),邊緣整齊;后期菌落呈灰色至黑色,菌絲呈簇狀直立生長,生長至培養(yǎng)皿皿蓋處(圖3a)。分離株在含滅菌松針的2%水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)15?d后產(chǎn)生分生孢子器。分生孢子器散生、單室、近球形、器壁黑色、近炭質(zhì);分生孢子單胞、橢圓形、兩端鈍圓,初期無色透明,后期轉(zhuǎn)為棕色,分生孢子大小為(24.82±3.09)μm?×(10.69±1.15)μm?(n=20)(圖3b)。根據(jù)上述形態(tài)學(xué)特征將所獲病原菌分離株初步鑒定為色二孢屬Diplodia真菌。

    2.4?病原菌多基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析

    擴(kuò)增代表菌株pearbot1核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)、α延伸因子序列(EF1α)和微管蛋白序列(βtubulin),分別得到大小為555、260?bp和432?bp的基因片段。BLAST序列比對(duì)結(jié)果顯示,菌株的3段保守基因分別與色二孢Diplodia?seriata相關(guān)基因相似性達(dá)到99%,將所有序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫,獲得登錄號(hào)分別為OM018671、OM063100和OM063099。

    下載NCBI數(shù)據(jù)庫中色二孢屬以及葡萄座腔菌科其他屬相關(guān)物種的ITS、EF1α和βtubulin相關(guān)序列,利用MEGA軟件選擇最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖4可以看到分離株pearbot1與色二孢的模式菌株CBS121885T、CBS112876T和CBS112555T的序列聚在同一個(gè)分支,而與其他種親緣關(guān)系較遠(yuǎn),該獨(dú)立分支自舉支持率達(dá)到100%(圖4)。結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征,將該病原菌鑒定為色二孢Diplodia?seriata。

    3?結(jié)論與討論

    本研究對(duì)遼寧省興城市矮化密植梨園中的梨樹枝枯病進(jìn)行病害診斷,分離獲得病原菌分離株并且在梨樹枝條和果實(shí)上驗(yàn)證了其致病性。通過傳統(tǒng)真菌形態(tài)學(xué)特征結(jié)合多基因的系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)病原菌進(jìn)行了鑒定,確定引致該病害的病原菌為色二孢?Diplodia?seriata,田間病害調(diào)研及實(shí)驗(yàn)室病菌培養(yǎng)過程中均未發(fā)現(xiàn)其有性階段。

    Diplodia?seriata是葡萄座腔菌科真菌中的重要一員,廣泛分布于世界上大多數(shù)熱帶及溫帶地區(qū)[56]。D.seriata是一種重要的植物病原真菌,寄主范圍十分廣泛,可以侵染梨和蘋果等多種植物的枝干和果實(shí),引起葉斑病、果實(shí)黑腐病、枝干潰瘍及枝枯病等多種病害,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[78]。近年來,色二孢屬真菌作為葡萄、蘋果和梨樹等重要經(jīng)濟(jì)果樹病原菌在國內(nèi)外被廣泛報(bào)道[911],D.seriata引起梨樹潰瘍和枝枯等癥狀分別在中國、土耳其和美國有發(fā)生報(bào)道[5,?1314]。由于葡萄座腔菌科真菌極少在田間和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)產(chǎn)生有性階段,該科真菌分類主要依賴無性型分生孢子器和分子孢子形態(tài)特征[1516]。隨著DNA序列分析及多基因分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展,基于形態(tài)學(xué)特征和分子特征的該科真菌系統(tǒng)分類逐漸得到了廣泛應(yīng)用,也極大地促進(jìn)了植物病原真菌系統(tǒng)分類學(xué)的發(fā)展[17]。我們?cè)谔镩g調(diào)研發(fā)現(xiàn),矮砧密植栽培秋子梨時(shí),矮化砧木存在剪鋸口,而傷口是該病原菌侵染的重要途徑。Slippers等[18]的研究表明,D.seriata等葡萄座腔菌科真菌通常作為一種弱寄生菌或內(nèi)生真菌存在于寄主體內(nèi),在本研究中僅有傷枝條接種發(fā)病也印證了這一觀點(diǎn),因此在梨樹枝枯病的防治過程中更應(yīng)高度重視梨樹砧木嫁接傷口的保護(hù),避免病原菌從該處侵入寄主危害主干。本文研究結(jié)果為進(jìn)一步探索由色二孢引起的梨樹枝枯病的致病機(jī)制和綜合防治提供了理論基礎(chǔ)。

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    (責(zé)任編輯:田?喆)

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