海南普通大薊馬對(duì)擬除蟲菊酯藥劑抗性監(jiān)測(cè)及鈉通道突變檢測(cè)

袁琳琳 潘雪蓮 陸容材 陳龍威 席羽 吳少英

摘要

普通大薊馬?Megalurothrips?usitatus?在海南省對(duì)豇豆造成嚴(yán)重危害且抗藥性逐漸增強(qiáng)。本研究測(cè)定了2019年至2021年海南省普通大薊馬對(duì)氯菊酯和甲氰菊酯的抗性。結(jié)果表明，海口、樂(lè)東和三亞3個(gè)地理種群對(duì)甲氰菊酯處于極高水平抗性，對(duì)氯菊酯處于高水平抗性，且抗性逐年增強(qiáng)。對(duì)普通大薊馬鈉離子通道序列分析發(fā)現(xiàn)存在M283R突變，該突變位于鈉離子通道同源結(jié)構(gòu)域Ⅰ。突變頻率檢測(cè)顯示，2019年至2021年連續(xù)3年?？诜N群該突變位點(diǎn)的突變頻率分別為1/30、1/30、3/30，有升高趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)海南省普通大薊馬從2019年到2021年對(duì)擬除蟲菊酯類藥劑的抗藥性呈逐年上升趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞

普通大薊馬;?鈉離子通道;?突變;?擬除蟲菊酯;?抗藥性

中圖分類號(hào)：

S?433

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022062

Detection?of?the?resistance?of?Megalurothrips?usitatus?to?pyrethroids?and?sodium?channel?mutation?in?Hainan

YUAN?Linlin，?PAN?Xuelian，?LU?Rongcai，?CHEN?Longwei，?XI?Yu，?WU?Shaoying*

（Sanya?Nanfan?Research?Institute?of?Hainan?University，?Sanya?572025，?China）

Abstract

Megalurothrips?usitatus?has?caused?serious?damage?to?cowpeas?in?Hainan?province?and?its?resistance?to?insecticide?is?building?up.?This?study?investigated?the?resistance?of?M.usitatus?to?permethrin?and?fenpropathrin?in?Hainan?province?from?2019?to?2021.?Haikou，?Ledong?and?Sanya?populations?showed?extremely?high?level?of?resistance?to?fenpropathrin?and?high?level?of?resistance?to?permethrin，?and?the?resistance?enhanced?year?by?year.?The?M283R?mutation?was?found?in?the?domain?Ⅰ?of?the?sodium?channel?in?M.usitatus.?The?frequencies?of?this?mutation?was?1/30，?1/30?and?3/30?in?three?Haikou?populations?collected?from?2019?to?2021，?respectively，?with?an?increasing?trend.?In?a?word，?this?study?found?that?the?resistance?of?M.usitatus?to?pyrethroids?in?Hainan?province?enhanced?year?by?year?from?2019?to?2021.

Key?words

Megalurothrips?usitatus;?sodium?channel;?mutation;?pyrethroids;?insecticide?resistance

豇豆是海南省主要的冬季蔬菜作物。據(jù)報(bào)道，海南省每年豇豆的種植面積可達(dá)?2?萬(wàn)?hm2?左右［1］。普通大薊馬?Megalurothrips?usitatus，也稱豆大薊馬（薊馬科?Thripidae，大薊馬屬?Megalurothrips），是海南省冬季瓜菜上的主要害蟲。普通大薊馬主要通過(guò)取食、產(chǎn)卵造成直接危害，此外還可以通過(guò)傳播植物病毒造成間接危害。直接危害主要是其利用銼吸式口器取食植物汁液，影響寄主植物的花、果實(shí)和生長(zhǎng)點(diǎn)的生長(zhǎng)，致使植物葉片卷曲皺縮，無(wú)法正常進(jìn)行光合作用，最終導(dǎo)致作物生長(zhǎng)緩慢甚至停止生長(zhǎng)。植物開花期受害最重，薊馬會(huì)在植物開花后迅速鉆入花心為害，造成花蕊腐爛壞死甚至脫落［2］。研究表明，普通大薊馬可以傳播煙草線條病毒（tobacco?streak?virus，?TSV）［34］、花生芽壞死病毒（peanut?bud?necrosis?virus，?PBNV）［5］等造成間接危害。普通大薊馬在海南省主要為害豇豆［6］，尤其在冬季蔬菜種植期間為害更為嚴(yán)重，對(duì)豇豆的品質(zhì)和產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響［68］。

海南省大面積種植豇豆供應(yīng)冬季蔬菜的同時(shí)也給普通大薊馬營(yíng)造了天然家園。伴隨著殺蟲劑的不斷使用，在有效防治普通大薊馬的同時(shí)也致使其抗藥性水平不斷攀升，給田間防治帶來(lái)了困難。2014年－2015年海南地區(qū)普通大薊馬對(duì)高效氯氰菊酯、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（甲維鹽）、吡蟲啉、乙基多殺菌素、阿維菌素和啶蟲脒的抗性測(cè)定結(jié)果表明，三亞種群2014年對(duì)高效氯氰菊酯、甲維鹽、吡蟲啉，產(chǎn)生了低水平抗性，?2015年對(duì)甲維鹽、吡蟲啉依然維持低水平抗性，同時(shí)又對(duì)乙基多殺菌素和啶蟲脒產(chǎn)生了低水平抗性，對(duì)高效氯氰菊酯產(chǎn)生了中等水平抗性;澄邁種群2014年對(duì)甲維鹽產(chǎn)生了低水平抗性，2015年對(duì)除甲維鹽外的其他藥劑仍然處于敏感狀態(tài)；

?？诜N群2014年和2015年對(duì)這6種藥劑均處于敏感階段［9］。此外，研究者2014年測(cè)定了毒死蜱、阿維菌素、高效氯氰菊酯、甲維鹽、吡蟲啉和啶蟲脒對(duì)海南省普通大薊馬的毒力，發(fā)現(xiàn)其中高效氯氰菊酯的?LC50?為?0.165?4?g/L［8］。2017年三亞和澄邁的普通大薊馬種群對(duì)阿維菌素仍處于敏感狀態(tài)，海口種群對(duì)高效氯氰菊酯、甲維鹽、乙基多殺菌素、吡蟲啉和啶蟲脒等藥劑產(chǎn)生了中等水平抗性［10］。而到2019年，普通大薊馬?？诜N群對(duì)擬除蟲菊酯類藥劑的抗性倍數(shù)增加，其中高效氯氟氰菊酯的LC50超過(guò)?1?000?mg/L［11］。

電壓門控鈉離子通道（voltagegated?sodium?channel，以下簡(jiǎn)稱鈉離子通道）存在于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，是神經(jīng)細(xì)胞傳遞電信號(hào)的重要通道。鈉離子通道是河豚毒素、蝎毒素和蟾蜍毒素等動(dòng)物源神經(jīng)毒素的作用靶標(biāo)［12］，同時(shí)也是擬除蟲菊酯類殺蟲劑和滴滴涕的主要作用靶標(biāo)［13］。此外，鈉離子通道阻斷殺蟲劑（sodium?channel?blocker?insecticides，?SCBI）也可以作用于昆蟲鈉離子通道［1415］。

哺乳動(dòng)物鈉離子通道的?α?亞基由多個(gè)基因編碼，而絕大多數(shù)昆蟲的神經(jīng)鈉離子通道由1個(gè)基因編碼。目前為止僅發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜?Tribolium?castaneum?和蚜蟲的鈉離子通道由2個(gè)基因編碼［16］。昆蟲鈉離子通道含有1個(gè)大型糖基化?α?亞基和1個(gè)與哺乳動(dòng)物?β?亞基功能相同的?Tip?E?蛋白，該?Tip?E?蛋白可以提高鈉離子通道的表達(dá)水平，利于后續(xù)鈉離子通道的功能驗(yàn)證［1720］。α?亞基由N端、C端和中間的4個(gè)同源結(jié)構(gòu)域（Domain?Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）組成。鈉離子通道的中央孔洞由4個(gè)結(jié)構(gòu)域圍繞形成，每個(gè)同源結(jié)構(gòu)域由6個(gè)跨膜螺旋片段組成（S1～S6），其中S5和S6間的跨膜片段形成P環(huán)（Ploop），而決定鈉離子通道離子選擇性的D（天冬氨酸）、E（谷氨酸）、K（賴氨酸）、A（丙氨酸）4個(gè)氨基酸殘基分別存在于4個(gè)同源結(jié)構(gòu)域的P環(huán)上［21］。4個(gè)同源結(jié)構(gòu)域和不同的跨膜螺旋片段之間通過(guò)多肽鏈相互連接。一般情況下，鈉離子通道有靜息態(tài)、激活態(tài)和失活態(tài)3種狀態(tài)［22］。昆蟲鈉離子通道的開放受膜電位控制，所以被稱為電壓門控離子通道。而鈉離子通道的門控是指在電刺激下通過(guò)

鈉離子通道蛋白構(gòu)象的改變開啟或關(guān)閉通道［16］。

擬除蟲菊酯類殺蟲劑（pyrethroids）是天然除蟲菊素的衍生物，共分為兩類，一類是不含α氰基的Ⅰ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑，如氯菊酯、聯(lián)苯菊酯等;一類是含有α氰基的Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑，如溴氰菊酯、甲氰菊酯等。相關(guān)研究表明，Ⅰ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑作用于神經(jīng)鈉離子通道導(dǎo)致軸突重復(fù)放電，致使突觸前神經(jīng)纖維處于重復(fù)興奮狀態(tài)，從而擾亂突觸功能。而Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用機(jī)理與Ⅰ型不同，不產(chǎn)生重復(fù)放電，而是抑制動(dòng)作電位的產(chǎn)生，引起膜電位的去極化，從而擾亂突觸功能［23］。因此盡管Ⅰ型和Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑均作用于昆蟲神經(jīng)鈉離子通道，但兩者對(duì)鈉離子通道的作用方式和產(chǎn)生毒力的機(jī)制完全不同［2325］。

擊倒抗性（knockdown?resistance，kdr）是昆蟲對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制［26］。相關(guān)藥理學(xué)試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)擊倒抗性的機(jī)理是鈉離子通道的結(jié)構(gòu)變化引起殺蟲劑結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生改變，使鈉離子通道對(duì)擬除蟲菊酯類藥劑的敏感性降低［27］。研究證實(shí)，擬除蟲菊酯類殺蟲劑在昆蟲鈉離子通道上的結(jié)合位點(diǎn)有兩個(gè)，分別為結(jié)合位置對(duì)稱而結(jié)合方向相反的?DomainⅡL45DomainⅡS5DomainⅡS6Domain?ⅢS6?和?DomainⅠL45DomainⅠS5DomainⅠS6DomainⅡS6［17，?28］。在過(guò)去近20年的研究中，與擊倒抗性有關(guān)的鈉離子通道突變是研究者關(guān)注的重點(diǎn)，研究也表明擊倒抗性與鈉離子通道氨基酸的突變有著密不可分的關(guān)系［16］，因此，我們可以通過(guò)測(cè)定昆蟲鈉離子通道中與擊倒抗性密切相關(guān)的某一個(gè)單突變或一對(duì)雙突變的突變頻率來(lái)評(píng)價(jià)昆蟲對(duì)菊酯類殺蟲劑的抗性現(xiàn)狀。

本文旨在通過(guò)連續(xù)3年的抗藥性水平測(cè)定來(lái)揭示海南省普通大薊馬對(duì)擬除蟲菊酯類藥劑的抗性發(fā)展趨勢(shì)，并通過(guò)普通大薊馬神經(jīng)鈉離子通道的克隆及突變位點(diǎn)分析來(lái)進(jìn)行分子水平的鑒定，監(jiān)測(cè)普通大薊馬對(duì)擬除蟲菊酯藥劑的抗性變化，為田間合理使用殺蟲劑提供一定的理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?供試?yán)ハx

2019年至2021年在海南省?？谑忻捞m區(qū)（東經(jīng)?110.3°E，北緯?20.1°N）、樂(lè)東黎族自治縣利國(guó)鎮(zhèn)（東經(jīng)?109.1°E，北緯?18.5°N）和三亞市崖城鎮(zhèn)（東經(jīng)?109.2°E，北緯?18.4°N）采集普通大薊馬田間種群，包括：??？诜N群（HK2019、HK2020、HK2021）、樂(lè)東種群（LD2019、LD2020、LD2021）和三亞種群（SY2019、?SY2020、SY2021）。相對(duì)敏感品系（S）由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院范詠梅教授2018年饋贈(zèng)，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用未施用任何農(nóng)藥的豇豆‘夏寶?2?號(hào)（廣東省興寧市興研種子店），在光照培養(yǎng)箱（RXZ380?BM，寧波揚(yáng)輝儀器有限公司）中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度（70±5）%，光周期?L∥D=16?h∥8?h。將清洗干凈并晾干的豇豆切成?8～10?cm?長(zhǎng)的兩端切口為實(shí)心、無(wú)孔洞的豇豆段，將豇豆段放入底部有吸水紙且瓶蓋上有氣孔的?500?mL?玻璃瓶中飼養(yǎng)。

1.2?生物測(cè)定

95%甲氰菊酯原藥（TC）和97%氯菊酯原藥（TC）購(gòu)自北京穎泰嘉和有限公司。本研究使用的生物測(cè)定方法是在TIBS（thrips?insecticide?bioassay?system）法［29］的基礎(chǔ)上改進(jìn)的葉管藥膜法［30］改良而來(lái)。首先根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用0.1?mg/L的Triton?X100（美國(guó)?Sigma）將原藥稀釋成不同濃度。取不同稀釋濃度的藥液浸滿2?mL離心管，3?h后倒出藥液，晾干備用。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。將無(wú)農(nóng)藥的豇豆切成1.5?cm長(zhǎng)的兩端切口為實(shí)心、無(wú)孔洞的豇豆段，在不同濃度的藥液中浸泡15?s后放在濾紙上晾干備用。以0.1?mg/L的Triton?X100處理的離心管和豇豆段作為空白對(duì)照。每個(gè)晾干的離心管中接入30頭普通大薊馬成蟲，并放入對(duì)應(yīng)濃度處理的豇豆段，飼養(yǎng)條件同上。于處理后48?h統(tǒng)計(jì)普通大薊馬的死亡率。使用Polo?Plus?2.00軟件計(jì)算不同種群不同藥劑的半致死濃度（LC50，95%置信區(qū)間），計(jì)算抗性倍數(shù)，并根據(jù)2020年全國(guó)農(nóng)業(yè)有害生物抗藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果及科學(xué)用藥建議的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［31］進(jìn)行抗性水平等級(jí)劃分，按抗性倍數(shù)（RR）由高到低劃分為：高水平抗性（RR>100.0）、中等水平抗性（10.0＜RR≤100.0）、低水平抗性（5.0＜RR≤10.0）、相對(duì)敏感（RR≤5.0）。

1.3?構(gòu)建重組質(zhì)粒

利用TRIzol?Reagent（美國(guó)Ambion）提取普通大薊馬成蟲總?RNA，并用?PrimeScriptTM?Ⅱ?1st?Strand?cDNA?Synthesis?Kit（日本?TaKaRa）將?RNA?反轉(zhuǎn)錄為?cDNA。設(shè)計(jì)擴(kuò)增普通大薊馬鈉離子通道全長(zhǎng)的引物?Mu5?（F）/Mu3?（R）（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用?Mu5?（F）/Mu3?（R）及?Phanta??Max?SuperFidelity?DNA?Polymerase（南京諾唯贊）擴(kuò)增鈉離子通道全長(zhǎng)片段，獲得的?PCR?產(chǎn)物經(jīng)?1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用?Cycle?Pure?Kit（美國(guó)?OMEGA）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。使用Clone?Express??Ⅱ?One?Step?Cloning?Kit（南京諾唯贊）將回收產(chǎn)物連接到表達(dá)載體?PGH19?上獲得重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入XL10gold?感受態(tài)細(xì)胞（北京博邁德），在含?10?mg/mL?氨芐卡鈉霉素的?LA?固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單克隆后通過(guò)飽和酚（北京索萊寶）進(jìn)行陽(yáng)性克隆的快速檢測(cè)篩選。具體篩選方法為：50?μL單克隆菌液與?50?μL?飽和酚以及?10?μL?的?6×loading?buffer?振蕩混合均勻，在?4℃條件下?12?000?r/min?離心?10?min，取?25?μL?上清液進(jìn)行?1.0%的凝膠電泳檢測(cè)，條帶長(zhǎng)度正確的菌落即為陽(yáng)性克隆。將篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液培養(yǎng)，利用?Plasmid?DNA?Mini?Kit（美國(guó)?OMEGA）提取重組質(zhì)粒，并使用限制性內(nèi)切酶?Hind?ⅢHF（北京?NEB）?進(jìn)行酶切，驗(yàn)證質(zhì)粒的正確性。最終獲得的含全長(zhǎng)鈉離子通道的陽(yáng)性質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4?基因突變頻率檢測(cè)

檢測(cè)?？贖K2019、HK2020和HK2021種群突變位點(diǎn)的突變頻率。利用溶液型中/大量細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（北京百泰克）提取單頭普通大薊馬成蟲的基因組DNA。根據(jù)突變位點(diǎn)所在同源結(jié)構(gòu)域Domain?Ⅰ設(shè)計(jì)引物Domain?Ⅰ5?（F）/Domain?Ⅰ3?（R）［引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，表1］。利用Rapid?Taq?Master?Mix（南京諾唯贊）擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照試劑盒說(shuō)明書。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)Cycle?Pure?Kit（美國(guó)OMEGA）回收純化后使用5?min?TA/BluntZero?Cloning?Kit（南京諾唯贊）連接到T載體獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Stbl2感受態(tài)細(xì)胞（上海唯地）中，使用含10?mg/mL氨芐卡鈉霉素的LA液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。菌液PCR篩選出陽(yáng)性克隆后提取重組質(zhì)粒，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。每組樣本各檢測(cè)30頭，計(jì)算突變頻率。突變頻率=每組含突變位點(diǎn)總樣本數(shù)/每組檢測(cè)總樣本數(shù)×100%。

2?結(jié)果與分析

2.1?普通大薊馬抗藥性檢測(cè)結(jié)果

本研究測(cè)定了甲氰菊酯和氯菊酯兩種擬除蟲菊酯類藥劑對(duì)相對(duì)敏感品系以及9個(gè)田間種群的毒力（表2）。結(jié)果表明，對(duì)室內(nèi)相對(duì)敏感品系，氯菊酯的LC50為1.4?mg/L，甲氰菊酯的LC50為1.9?mg/L。對(duì)田間種群，從2019年至2021年，?？?、樂(lè)東和三亞種群對(duì)甲氰菊酯和氯菊酯的抗性均表現(xiàn)出不斷增強(qiáng)的趨勢(shì)，其中?？诜N群對(duì)氯菊酯的抗性3年間從194.3倍增加到241.2倍，一直處于高水平抗性;對(duì)甲氰菊酯的抗性處于超高水平，最高達(dá)1?426.5倍（HK2021）;樂(lè)東種群，對(duì)氯菊酯的抗性3年來(lái)一直處于高水平，3年抗性倍數(shù)從204.8倍增加到314.3倍，對(duì)甲氰菊酯的抗性2021年已達(dá)到2?189.9倍（LD2021），為超高水平抗性;三亞種群，對(duì)氯菊酯的抗性一直處于高水平，且3年內(nèi)抗性倍數(shù)從?232.1倍增加到?386.9倍，對(duì)甲氰菊酯的抗性也處于超高水平，且至2021年抗性倍數(shù)達(dá)到了?3?107.5倍（SY2021）。研究結(jié)果表明，?？冢℉K）、樂(lè)東（LD）和三亞（SY）普通大薊馬種群中，三亞種群對(duì)擬除蟲菊酯類藥劑的抗性水平最高，樂(lè)東次之，海口種群的抗性水平最低但也呈高水平抗性，并且3地的抗性均呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。

2.2?普通大薊馬鈉離子通道克隆及突變位點(diǎn)分析

2.2.1?鈉離子通道全長(zhǎng)基因的克隆

普通大薊馬鈉離子通道基因全長(zhǎng)6?282?bp（圖1），編碼2?094個(gè)氨基酸，其全長(zhǎng)氨基酸序列已上傳?NCBI?GenBank?數(shù)據(jù)庫(kù)并獲得序列號(hào)?MZ043856。獲得普通大薊馬鈉離子通道的基因全長(zhǎng)后，根據(jù)其基本結(jié)構(gòu)和氨基酸序列信息，使用?SWISSMODEL?網(wǎng)站（https：∥swissmodel.expasy.org/）構(gòu)建了普通大薊馬鈉離子通道的?3D?模擬圖（圖2）。

2.2.2?普通大薊馬鈉離子通道蛋白突變位點(diǎn)分析

將?？贖K2019種群與敏感品系鈉離子通道氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示HK2019的鈉離子通道在Domain?Ⅰ區(qū)域S5位置上的第283個(gè)氨基酸的第二位核苷酸發(fā)生了突變，ATG?變?yōu)?AGG，使蛋氨酸（M）突變?yōu)榫彼幔≧）（圖3a），且?M283R?突變位點(diǎn)出現(xiàn)在擬除蟲菊酯類藥劑的結(jié)合區(qū)域?Domain?ⅠS5（圖3b）。

2.2.3?普通大薊馬鈉離子通道蛋白M283R突變位點(diǎn)的突變頻率

本研究主要檢測(cè)了普通大薊馬海口種群鈉離子通道蛋白突變位點(diǎn)M283R的突變頻率。對(duì)HK2019、?HK2020、HK2021共3個(gè)種群中各?30?頭單頭蟲體樣本的Domain?Ⅰ?陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序和序列分析顯示，?普通大薊馬鈉離子通道Domain?Ⅰ基因長(zhǎng)?840?bp（圖4），編碼280個(gè)氨基酸。HK2019、HK2020、?HK2021種群各?30頭樣本中產(chǎn)生突變的分別有1、1頭和3頭，M283R的突變頻率分別為1/30、1/30和3/30，即3.3%、3.3%和10.0%（表3）。

3?結(jié)論與討論

薊馬類害蟲的為害方式主要是通過(guò)銼吸式口器吸食植物細(xì)胞汁液，導(dǎo)致植物光合能力降低［32］，而高溫高濕的環(huán)境會(huì)加重這種損害［33］。海南濕熱的環(huán)境導(dǎo)致普通大薊馬的發(fā)生越發(fā)嚴(yán)重［10］。當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶使用化學(xué)殺蟲劑來(lái)控制普通大薊馬的種群數(shù)量，導(dǎo)致其抗藥性不斷攀升。

近幾年，海南省普通大薊馬對(duì)擬除蟲菊酯類藥劑的抗性水平測(cè)定結(jié)果顯示，三亞種群對(duì)高效氯氰菊酯已經(jīng)產(chǎn)生了中等水平抗性（17.06倍）［10］。在我們最新的研究結(jié)果中，海南省?？?、樂(lè)東、三亞3個(gè)野外地理種群對(duì)高效氯氟氰菊酯（414～1?128倍）和溴氰菊酯（161～352倍）表現(xiàn)出較高水平的抗性（尚未發(fā)表）。本研究的生物測(cè)定結(jié)果表明，2019年至2021年3年內(nèi)，?？凇?lè)東、三亞的普通大薊馬種群對(duì)氯菊酯和甲氰菊酯均產(chǎn)生了高水平或極高水平的抗性，且抗性水平呈逐年上升趨勢(shì)。并且三亞種群的抗藥性在3個(gè)地理種群中最高，樂(lè)東種群較?？诜N群稍高。突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果顯示，本研究3個(gè)田間抗性種群中均發(fā)現(xiàn)有M283R突變位點(diǎn)存在，因該突變位點(diǎn)最先在?？诜N群HK2019中被發(fā)現(xiàn)，所以本文僅以HK2019為例進(jìn)行鈉離子通道的全長(zhǎng)克隆及序列分析，并連續(xù)3年對(duì)海口種群（HK2019、HK2020及HK2021）發(fā)生該突變的頻率進(jìn)行檢測(cè)。?？诜N群M283R突變位點(diǎn)3年的突變頻率分別為3.3%、3.3%和10.0%，由不同種群抗性水平高低及發(fā)展趨勢(shì)推測(cè)，樂(lè)東和三亞種群中M283R的突變頻率極有可能會(huì)高于?？诜N群，甚至可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于10%，實(shí)際突變頻率是否真如推測(cè)所言，仍需大量分子試驗(yàn)的驗(yàn)證。

害蟲產(chǎn)生抗藥性的機(jī)制主要有3個(gè)方面，分別為解毒酶代謝增強(qiáng)［34］、靶位點(diǎn)敏感性降低［35］以及表皮穿透性降低［36］。擬除蟲菊酯類藥劑是一種高效低毒的神經(jīng)毒劑，幾十年來(lái)一直被用于害蟲防治。相關(guān)遺傳學(xué)研究表明，普通大薊馬對(duì)氯氰菊酯等菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性可能與鈉通道的突變有關(guān)［37］。近幾年，鈉離子通道Domain?Ⅱ和Domain?Ⅲ的突變位點(diǎn)在許多昆蟲中也相繼被報(bào)道［38］。在擬除蟲菊酯長(zhǎng)期的選擇壓力下，已經(jīng)在黑腹果蠅Drosophila?melanogaster中發(fā)現(xiàn)了I260T突變位點(diǎn)和I265N突變位點(diǎn)［39］，昆蟲Domain?Ⅰ突變也與其對(duì)擬除蟲菊酯抗性相關(guān)。

在薊馬類昆蟲中已經(jīng)報(bào)道了與擬除蟲菊酯類藥劑抗性相關(guān)的突變位點(diǎn)，例如在煙薊馬Thrips?tabaci中已經(jīng)確定了4個(gè)與擬除蟲菊酯抗性相關(guān)的突變，包括兩對(duì)氨基酸雙突變M918T/L1014F和M918L/V1010A［40］，并在日本煙薊馬鈉離子通道中發(fā)現(xiàn)了與擬除蟲菊酯抗性密切相關(guān)的T929I和K1774N雙突變，并首次發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)單氨基酸突變位點(diǎn)T929I和M918L［4143］。而西花薊馬Frankliniella?occidentalis通過(guò)鈉離子通道的L1014F和T929C單突變位點(diǎn)獲得了抗藥性［44］，棕櫚薊馬Thrips?palmi也通過(guò)M843I、A1231D和T945I單突變獲得了對(duì)擬除蟲菊酯殺蟲劑的抗藥性［45］。

本研究從田間普通大薊馬種群鈉離子通道的Domain?Ⅰ中檢測(cè)到一個(gè)新的突變位點(diǎn)M283R，且在檢測(cè)的樣本中該突變?yōu)榧兒贤蛔儭１狙芯堪l(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)與黑腹果蠅中的兩個(gè)突變位點(diǎn)在位置上相近，也位于擬除蟲菊酯類藥劑結(jié)合位點(diǎn)上，因此推測(cè)該突變位點(diǎn)與普通大薊馬對(duì)擬除蟲菊酯類藥劑產(chǎn)生抗性相關(guān)，但有待通過(guò)爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和雙電極電壓鉗技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）