基于網(wǎng)絡藥理學的白藜蘆醇治療創(chuàng)傷性顱腦損傷的作用機制研究

劉飛飛 韓麗君 申友奎 陶開亮

創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是指因外界暴力直接或間接地作用于頭部而引起的顱腦外傷性病變[1]。因TBI 易并發(fā)感染、肢體運動功能障礙、腦神經(jīng)功能障礙、全身臟器功能障礙等并發(fā)癥，在我國TBI 的死亡率高達7%[2]。隨著對TBI 病理及生理機制研究的不斷深入，促紅細胞生成素、前列環(huán)素、孕酮和生酮飲食等被用于TBI 的臨床研究，但能通過Ⅲ期臨床試驗的藥物仍較少。因此，開發(fā)高效的治療藥物是當前TBI 研究的重點。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護等多種藥理活性。研究表明，白藜蘆醇可以降低TBI 大鼠腦內(nèi)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-1β 的表達，抑制神經(jīng)元自噬，減少神經(jīng)元凋亡，減輕腦水腫，有助于細胞的修復和神經(jīng)功能的恢復[3]。此外，白藜蘆醇還可以通過抑制核因子（nuclear factor，NF）-κB 通路、抑制炎癥因子釋放等途徑來發(fā)揮神經(jīng)保護作用[4]。為了進一步探討白藜蘆醇治療TBI 的具體作用機制，本研究借助網(wǎng)絡藥理學方法篩選白藜蘆醇治療TBI 的可能作用靶點，并采用分子對接技術進行靶點驗證，以期為TBI的治療與白藜蘆醇的臨床應用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 白藜蘆醇作用靶點獲取 檢索TCMSP[5]、BATMAN-TCM[6]、Drugbank[7]、SuperPred[8]、PharmMapper[9]和SwissTargetPrediction[10]數(shù)據(jù)庫，獲取白藜蘆醇作用靶點577 個。

1.2 TBI 相關靶點收集 以“traumatic brain injury”“brain injury, traumatic”“trauma, brain”“intracranial trauma”“craniocerebral trauma”“brain trauma”“encephalopathy, traumatic”為關鍵詞，分別檢索TTD[11]、Drugbank、CTD[12]、GeneCards[13]、OMIM[14]和Malacards[15]數(shù)據(jù)庫，獲取TBI 相關靶點9 231 個。選取其中相關度＞20 的靶點，最終獲得TBI 相關靶點1 100 個。

1.3 藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡的構建 將TBI 相關靶點與白藜蘆醇作用靶點上傳至UniProt 數(shù)據(jù)庫[16]，再轉(zhuǎn)換成相對應的基因名稱，篩選經(jīng)過驗證的人源基因作為有效作用靶基因，共得到白藜蘆醇治療TBI 作用靶點165 個。利用Bioinformatics 網(wǎng)站構建韋恩圖，交集靶點即白藜蘆醇治療TBI 的作用靶點。將上述作用靶點導入Cytoscape 3.8.0 軟件，構建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡（protein-protein interaction，PPI）構建 將交集靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫[17]構建PPI。設置蛋白種類為“homo sapiens”，最低相互作用閾值為“medium confidence（0.40）”，隱藏無關聯(lián)的靶點，其他參數(shù)設為默認值。采用Cytoscape 3.8.0 軟件“Network Analysis”功能計算蛋白節(jié)點的度值、綜合得分、介數(shù)等重要網(wǎng)絡拓撲參數(shù)。應用CytoHubba 插件基于最大團中心性（maximal clique centrality，MCC）算法來確定PPI 排名前10 的節(jié)點作為核心靶點。應用MCODE 插件對PPI 進行聚類分析，根據(jù)節(jié)點數(shù)及k-core 值選取功能模塊。

1.5 生物學過程與信號通路富集分析 分別將MCODE 1～5 模塊和165 個交集靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫[18]，species 設置為“homo sapiens”，在“Custom Analysis”中選擇基因本體論（gene ontology，GO）進行生物學過程富集分析，主要包括生物過程（biological processes，BP）、分子功能（molecular functions，MF）、細胞組分（cellular components，CC）等，選擇京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）進行信號通路富集分析。設定閾值P＜0.05，并根據(jù)P 值對分析結(jié)果進行排序，篩選具有顯著差異的生物學過程和信號通路（前20 個條目）。采用Cytoscape 3.8.0 軟件構建藥物-靶點-KEGG 通路網(wǎng)絡，繪制Bioinformatics 和ImageGP網(wǎng)站可視化繪圖。

1.6 白藜蘆醇與核心靶點的分子對接 從ZINC 數(shù)據(jù)庫[19]下載白藜蘆醇的3D 結(jié)構（保存為Mol2 格式），作為分子對接中的活性小分子；從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫[20]下載核心靶點的蛋白結(jié)構。采用Pymol 2.4.0 軟件對蛋白進行去水、移除原配體、加氫等操作（保存為PDB 格式）。利用AutoDockTools 1.5.6 軟件進行半柔性對接，取打分最高的構象，用Pymol 2.4.0 將對接結(jié)果進行可視化處理，DiscoveryStudio 2020 進行相互作用分析。

2 結(jié)果

2.1 藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡分析 白藜蘆醇治療TBI 的藥物- 靶點- 疾病網(wǎng)絡涉及1 514 節(jié)點和1 677 條邊，提示白藜蘆醇可能通過多種靶點作用于TBI，見圖1（插頁）。

圖1 白藜蘆醇治療TBI 的藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡

2.2 PPI 分析 所構建的PPI 包含165 個節(jié)點和3672 條邊，提示各靶點相互關聯(lián)，通過相互協(xié)調(diào)對TBI 發(fā)揮作用，見圖2（插頁）。功能模塊分析得到節(jié)點≥4、k-core≥3 的5 個功能模塊，見圖3（插頁）。PPI 排名前10 的節(jié)點分別是胰島素（insulin，INS）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）1、TNF、TP53、白蛋白（albumin，ALB）、IL-6、SRC、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子（signal transducer and transcription activator，STAT）3、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）A、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9，均包含在MCODE 1 中，可能是白藜蘆醇治療TBI 的核心靶點。

圖2 白藜蘆醇治療TBI 的PPI

圖3 白藜蘆醇治療TBI 的功能模塊分析

2.3 GO 和KEGG 富集分析 MCODE 1～5 的GO富集分析顯示，BP 主要涉及細胞遷移的調(diào)控、上皮細胞增殖、氧化應激反應、細胞因子介導的信號通路、星形膠質(zhì)細胞分化等；MF 主要涉及激酶結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合等；CC 主要涉及膜筏、細胞間連接、樹突、囊泡腔、神經(jīng)元胞體、突觸前等。MCODE 1～5 的KEGG富集分析顯示，信號通路主要涉及AGEs-RAGE 信號通路、內(nèi)分泌抵抗、HIF-1 信號通路、JAK-STAT信號通路、胰島素抵抗、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、癌癥途徑、5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸等，見圖4（插頁）。交集靶點的GO 富集分析顯示，BP 主要涉及轉(zhuǎn)移酶活性的正調(diào)控、細胞遷移的積極調(diào)控、活性氧代謝過程、對受傷的反應、內(nèi)皮細胞增殖等；MF 主要涉及激酶結(jié)合、蛋白激酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等；CC 主要涉及膜筏、囊泡腔、突觸后膜、樹突、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、細胞間連接等。交集靶點的KEGG富集分析顯示，信號通路主要涉及癌癥途徑、AGEs-RAGE 信號通路、FoxO 信號通路、補體與凝血級聯(lián)等，見圖5（插頁）。

圖4 MCODE 1～5 的GO 和KEGG 富集分析

圖5 交集靶點的GO 和KEGG 富集分析（A：GO 分析；B：KEGG 分析）

2.4 藥物-靶點-KEGG 通路網(wǎng)絡分析 藥物-靶點-KEGG 通路網(wǎng)絡包含186 個節(jié)點和734 條邊，見圖6（插頁），提示白藜蘆醇的作用靶點分布于不同通路，通過多靶點作用于多條通路來參與TBI 的疾病進程。

圖6 藥物-靶點-KEGG 通路網(wǎng)絡

2.5 白藜蘆醇與核心靶點的分子對接 分子對接結(jié)果顯示，白藜蘆醇與IL-6、INS、MMP-9、SRC、TNF、ALB、IGF1、STAT3、TP53、VEGFA 等10 個核心靶點成功對接，其中白藜蘆醇與IL-6、MMP-9、INS、SRC 的對接結(jié)合能＜-5 kJ/mol，表現(xiàn)出較好的結(jié)合可能性。白藜蘆醇可以與IL-6 中的氨基酸殘基LEU65、GLU173 形成氫鍵，與PRO66、LEU166、MET68 殘基之間形成疏水相互作用；與MMP-9 關鍵殘基LEU418 之間形成氫鍵，與ARG424、GLU416之間形成疏水相互作用；與INS 之間形成4 個氫鍵，包括CYS7、CYS6、CYS11 和SER9，與LEU11、ALA14、LEU16 和LEU13 殘基之間形成疏水相互作用；與SRC 在GLU342、MET344 殘基之間形成氫鍵，與LEU396、VAL284、ALA296 和LEU276 之間形成疏水相互作用。

3 討論

有文獻報道白藜蘆醇的生物利用度和類藥性值較低[21]。但是美國食品藥品監(jiān)督管理局已批準白藜蘆醇作為抗癌劑或抗氧化劑用于臨床治療，這表明白藜蘆醇具有可藥性。本研基于網(wǎng)絡藥理學研究，共篩選出10 個白藜蘆醇治療TBI 的核心靶點，分別為INS、IGF1、TNF、TP53、ALB、IL-6、SRC、STAT3、VEGFA 和MMP-9。分子對接結(jié)果顯示，白藜蘆醇與10個核心靶點均能成功結(jié)合，其中白藜蘆醇與IL-6、MMP-9、INS、SRC 蛋白具有較好的結(jié)合活性。INS 可以降低一氧化氮、活性氧和TNF-α 的產(chǎn)生，進而降低TBI 患者的感染率、改善神經(jīng)功能預后[22-23]。IGF1能夠促進神經(jīng)元的生長和分化，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復和神經(jīng)再生中起著重要作用[24]。TNF 是重要的免疫調(diào)節(jié)和炎癥因子，參與TBI 后炎癥反應等過程[25]。TP53 在控制細胞周期、引發(fā)細胞凋亡過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，還參與DNA 損傷后的修復。ALB 具有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、清除自由基等功能，是重要的細胞外抗氧化劑。IL-6 在TBI 后炎癥反應、免疫應答及神經(jīng)創(chuàng)傷修復等方面起著重要作用。TBI后小膠質(zhì)細胞以IL-6 依賴的方式來促進神經(jīng)修復[26]。SRC 激活會加重TBI 發(fā)生后的血腦屏障破壞和腦水腫[27]。STAT3 參與TBI 后的JAK-STAT 信號通路，促進IL-6、TNF 等炎癥因子的表達。VEGFA和MMP-9 通過破壞血腦屏障，誘導神經(jīng)元凋亡和炎癥反應等，從而加重TBI[28-29]。

GO 和KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可能作用于機體的多種CC，以不同的反應方式參與多種BP，其所涉及的信號通路主要包括AGEs-RAGE 信號通路、FoxO 信號通路、胰島素抵抗、補體和凝血級聯(lián)、HIF-1 信號通路、鈣離子信號通路和JAK-STAT信號通路等。RAGE 分布于神經(jīng)元細胞和膠質(zhì)細胞等部位，與AGEs 特異性結(jié)合后介導細胞內(nèi)氧化應激、NF-κB 通路激活等，從而導致神經(jīng)血管損傷、神經(jīng)細胞凋亡[30]。TBI 后腦組織內(nèi)的FoxO 表達上調(diào)，F(xiàn)oxO 信號通路通過調(diào)控神經(jīng)細胞自噬，以減輕神經(jīng)損傷[31]。有學者發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能通過調(diào)控FoxO 信號通路來抑制TNF-α、IL-1β 釋放和促進抗凋亡因子Bcl-2 的釋放，從而減輕腦缺血再灌注損傷[32]。胰島素與受體結(jié)合所介導的MAPK 通路和PI3K 通路參與TBI 后應激反應。胰島素抵抗可加重TBI 后乳酸酸中毒、鈣離子超載，進而加重腦水腫和神經(jīng)損傷[33]。在腦內(nèi)補體系統(tǒng)和凝血級聯(lián)相互作用，補體系統(tǒng)可以激活凝血級聯(lián)途徑產(chǎn)生凝血酶，而凝血級聯(lián)途徑中的凝血酶、血清素等還能激活補體級聯(lián)途徑。因此，補體和凝血級聯(lián)途徑交叉作用，協(xié)同調(diào)節(jié)TBI后的凝血-纖溶平衡和免疫反應等[34]。TBI 后HIF-1信號通路具有雙向調(diào)節(jié)作用，既可以通過誘導VEGF 表達，促進紅細胞增殖及新生血管形成，增加神經(jīng)細胞耐受[35]；又可以通過介導細胞凋亡及炎癥反應，導致神經(jīng)細胞死亡[36]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以通過HIF-1 信號通路來影響血腦屏障的通透性，進一步驗證了本研究預測結(jié)果的可靠性[37]。TBI 發(fā)生時，細胞內(nèi)鈣離子濃度急驟增加，造成鈣離子超載，進而導致神經(jīng)細胞水腫、凋亡[38]。鈣離子超載還存在于微血管內(nèi)皮細胞，破壞血腦屏障完整性，加劇TBI 后血管源性腦水腫的發(fā)生。TBI 后腦組織內(nèi)JAK-STAT信號通路激活，會加重血腦屏障破壞及神經(jīng)損傷[39]。由此可見，本研究預測的信號通路均與TBI 關系密切，表明白藜蘆醇治療TBI 涉及多條信號通路。

綜上所述，白藜蘆醇可能通過多靶點、多通路發(fā)揮減輕TBI 和促進神經(jīng)功能恢復的治療作用，其中IL-6、MMP-9、INS、SRC 可能是白藜蘆醇治療TBI的核心靶點，AGEs-RAGE、FoxO、胰島素抵抗、補體和凝血級聯(lián)、HIF-1、鈣離子和JAK-STAT 等是藜蘆醇治療TBI 涉及的主要信號通路。