黃連素通過KLF4 減輕缺血/再灌注損傷所致的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究

陳晨 林科 王愷婧 吳圣杰

心肌梗死是致殘率和致死率均較高的心血管疾病之一，相關(guān)嚴(yán)重并發(fā)癥可降低患者的生活質(zhì)量，增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。目前普遍認(rèn)為缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷參與心肌梗死的病理、生理過程[2]。而體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)也表明，氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡、自噬和細(xì)胞病理過程等可能在機(jī)體I/R 損傷中起著關(guān)鍵作用[3-4]。但是，目前關(guān)于I/R 損傷的分子和細(xì)胞病理學(xué)機(jī)制尚未完全闡明，可供臨床使用的有效藥物也有待進(jìn)一步研究。黃連素（berberine，BBR）是一種具有強(qiáng)大生物活性的生物堿[5]。最新研究證實(shí)，BBR 可以通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、線粒體自噬，從而保護(hù)細(xì)胞免受高血糖或高脂血癥所致的損傷[6-7]。Yu等[8]研究表明，BBR 能通過抑制核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、JNK 通路來減輕心肌I/R損傷。然而，BBR 是一種多位點(diǎn)化合物，具有一定的組織特異性[9]，因此這種保護(hù)功能的潛在機(jī)制較為復(fù)雜，可能存在其他潛在因素參與BBR 減輕心肌I/R 損傷的過程。KRUPPEL 樣因子4（Kruppel-like factor 4，KLF4）是一種進(jìn)化比較保守的含鋅指轉(zhuǎn)錄因子，可作為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子[10]，可能參與心肌I/R 損傷的生理及病理過程。然而，目前尚無相關(guān)研究探討KLF4 與BBR 功效機(jī)制的聯(lián)系。因此，本研究利用心肌I/R 損傷的成熟細(xì)胞模型驗(yàn)證BBR 對(duì)I/R 損傷的保護(hù)作用，并探討KLF4 是否參與保護(hù)心肌細(xì)胞的過程，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑 大鼠永久心肌細(xì)胞系H9C2 細(xì)胞購自上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所。鹽酸BBR 水合物（CASNO.141433-60-5，純度98%）購自上海阿拉丁生化科技公司；杜爾貝科改良Eagle110培養(yǎng)基（Dulbeco modified Eagle110 medium，DMEM）、胎牛血清、青霉素、鏈霉素均購自美國Gibco 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自杭州連科生物科技有限公司；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dutp-biotin nick end labeling assay，TUNEL）檢測(cè)試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；雙鉻酸蛋白檢測(cè)試劑盒購自美國Thermo 公司；抗Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（批號(hào)：ab32503）、抗B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B lymphoblastoma-2 gene，Bcl-2）（批號(hào)：ab32124）、抗KLF4（批號(hào)：ab215036）、抗β-actin（批號(hào)：ab8227）均購自英國Abcam 公司；Trizol 試劑購自美國Thermo 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理 將H9C2 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的DMEM 中，置于含5%CO2的37 ℃濕化孵化器中進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)獲得的3～15 代H9C2 細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法分為4 組，即對(duì)照組、I/R組、BBR 組、KLF4 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）組。除對(duì)照組經(jīng)饑餓處理24 h 后，置于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h，其余3 組均誘導(dǎo)體外I/R 模型，具體參考文獻(xiàn)[11-12]（將密度約60%的傳代培養(yǎng)H9C2 細(xì)胞置于無血清的DMEM 中饑餓處理24 h，隨后置于5%CO2和95%N2混合氣體充填的缺氧室中孵育；缺氧處理1 h 后，將H9C2 細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含95%O2和5%CO2的培養(yǎng)箱中3 h；再次給氧前，更換新鮮培養(yǎng)基）。在此基礎(chǔ)上，BBR 組在誘導(dǎo)I/R 模型期間給予50 μmol/L BBR 作用4 h；KLF4 siRNA 組在誘導(dǎo)I/R 模型前轉(zhuǎn)染KLF4 siRNA，誘導(dǎo)I/R 模型期間給予50 μmol/L BBR 作用4 h。

1.3 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用CCK-8 法。在96 孔板中加入200 μl CCK-8 溶液，在按2.0×104個(gè)/孔加入H9C2 細(xì)胞，37 ℃避光持續(xù)孵育3 h。使用美國Thermo Fisher 酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（optical density，OD）值。細(xì)胞活力=OD 值樣品/OD 值對(duì)照。

1.4 細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) （1）采用TUNEL 染色法。H9C2 細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定1 h，在經(jīng)3%H2O2孵育染色20 min，置于37 ℃進(jìn)行TUNEL 染色1 h。在光鏡下觀察凋亡細(xì)胞并拍照記錄，計(jì)算膜陽性面積百分比。（2）采用流式細(xì)胞術(shù)。H9C2 細(xì)胞經(jīng)冷磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，加入5 μL 異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）和1 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）工作液（100 μg/mL）在室溫下避光孵育15 min。使用雙激光流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況，采用美國BD 公司ModFit 軟件進(jìn)行細(xì)胞凋亡率的估計(jì)。

1.5 Bax、Bcl-2、KLF4 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡法。將H9C2 細(xì)胞置于4 ℃下的RIPA 裂解液（含1/1 000 蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟）中處理30 min，提取總蛋白，使用雙鉻酸蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)。將等量的蛋白裂解物裝入10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。細(xì)胞膜在含0.05%吐溫20 和5%脫脂牛奶的Tris 緩沖液中封閉1.5 h；隨后將聚偏二氟乙烯膜與特定的一抗（包括抗Bax、抗Bcl-2、抗KLF4 和抗β-actin）在4 ℃下孵育過夜。再將聚偏二氟乙烯膜與適當(dāng)?shù)亩乖谑覝叵聫?fù)溫1 h。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行條帶可視化處理，使用Bio Rad 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，使用Quantity One v4.62軟件進(jìn)行分析，使用Image J 1.38e軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，計(jì)算Bax、Bcl-2、KLF4 蛋白表達(dá)水平。

1.6 KLF4 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)。使用Trizol 試劑從H9C2 細(xì)胞中分離總RNA。使用two-step M-MLV Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)。引物由美國Invitrogen 公司合成并獲得。KLF4 的引物序列：正向?yàn)?'-CAAGTCCCGCCGCTCCATTACCAA-3'，反向?yàn)?'-CCACAGCCGTCCCAGTCACAGTGG-3'。以βactin 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算KLF4 mRNA 表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graph Pad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組H9C2 細(xì)胞活力比較 3 組H9C2 細(xì)胞藥物處理48 h 后細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中BBR 組細(xì)胞活力明顯高于I/R 組（P＜0.05），見圖1。

圖1 3 組H9C2 細(xì)胞活力比較

2.2 3 組H9C2 細(xì)胞凋亡因子蛋白表達(dá)水平比較3 組H9C2 細(xì)胞凋亡因子Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中BBR組Bax 蛋白表達(dá)水平明顯低于I/R 組（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯高于I/R 組（P＜0.05），見圖2。

圖2 3 組H9C2 細(xì)胞凋亡因子蛋白表達(dá)比較（A：電泳圖；B：Bax 蛋白表達(dá)水平比較；C：Bcl-2 蛋白表達(dá)水平比較；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與I/R 組比較，bP＜0.05）

2.3 3 組H9C2 細(xì)胞凋亡情況比較 TUNNEL 染色結(jié)果顯示，BBR 組、I/R 組、對(duì)照組膜陽性面積百分比分別為（23.0±5.6）%、（45.0±7.3）%和（16.0±3.3）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中BBR 組明顯低于I/R 組（P＜0.05），見圖3A-B（插頁）。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BBR 組、I/R 組、對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為（15.3±1.4）%、（30.5±2.4）%和（9.3±1.3）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中BBR 組明顯低于I/R 組（P＜0.05），見圖3C-D（插頁）。

圖3 3 組H9C2 細(xì)胞凋亡情況比較（A：TUNNEL 染色結(jié)果，×200；B：膜陽性面積百分比比較；C：流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；D：細(xì)胞凋亡率比較；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與I/R 組比較，bP＜0.05）

2.4 3 組H9C2 細(xì)胞KLF4 蛋白和mRNA 表達(dá)水平比較 3 組H9C2 細(xì)胞KLF4 蛋白和mRNA 表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中BBR 組、對(duì)照組均明顯高于I/R 組（均P＜0.05），見圖4。

圖4 3 組H9C2 細(xì)胞KLF4 蛋白和mRNA 表達(dá)水平比較（A：電泳圖；B：KLF4 蛋白表達(dá)水平比較；C：KLF4 mRNA 表達(dá)水平比較；與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與I/R 組比較，bP＜0.05）

2.5 KLF4 沉默對(duì)BBR 心肌細(xì)胞保護(hù)作用的影響I/R 組、BBR 組、KLF4 siRNA 組細(xì)胞活力、膜陽性面積百分比、細(xì)胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；其中BBR 組細(xì)胞活力明顯高于I/R組（P＜0.05），膜陽性面積百分比和細(xì)胞凋亡率均明顯低于I/R 組（均P＜0.05）；而KLF4 siRNA 組細(xì)胞活力明顯低于BBR 組（P＜0.05），膜陽性面積百分比和細(xì)胞凋亡率均明顯高于BBR 組（均P＜0.05），見圖5（插頁）。

圖5 KLF4 沉默對(duì)BBR 心肌細(xì)胞保護(hù)作用的影響（A：細(xì)胞活力比較；B：膜陽性面積百分比比較；C：流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；D：細(xì)胞凋亡率比較；與I/R 組比較，aP＜0.05；與BBR 組比較，bP＜0.05）

3 討論

心肌I/R 損傷被認(rèn)為是心肌缺血后發(fā)生損傷的主要機(jī)制[2]。研究表明，炎癥反應(yīng)、自噬、細(xì)胞凋亡和焦亡、氧化應(yīng)激、鈣超載等機(jī)制均參與該病的生理及病理過程[13]。Cummins 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在I/R 損傷過程中，NF-κB 激活將導(dǎo)致持續(xù)炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另有研究表明，細(xì)胞凋亡是由于缺血區(qū)活性氧積累導(dǎo)致的[15]。本研究證實(shí)I/R 損傷可導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡，如Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)水平發(fā)生了明顯變化，細(xì)胞凋亡率明顯升高。

BBR 被證實(shí)對(duì)阿爾茨海默病、癌癥、糖尿病、冠心病以及許多其他慢性病治療有效[16]。近年來關(guān)于BBR 對(duì)慢性缺血性疾?。ㄌ貏e是I/R 損傷）的保護(hù)作用，引發(fā)了廣泛而持續(xù)的關(guān)注。Zhu 等[17]研究表明，BBR 能夠改善小鼠的I/R 損傷。此外，BBR 也有利于急性腎I/R 損傷的恢復(fù)[18]。有趣的是，在心臟I/R損傷中也發(fā)現(xiàn)了BBR 具有類似的治療效果[19-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，BBR 可以部分逆轉(zhuǎn)I/R 誘導(dǎo)的心臟損傷，包括降低細(xì)胞凋亡率、下調(diào)Bax 蛋白表達(dá)水平、上調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)水平。關(guān)于BBR 保護(hù)作用的機(jī)制，已有不少研究作了探討。Huang 等[23]報(bào)道BBR 可以過度抑制自噬，這可能是介導(dǎo)此現(xiàn)象的潛在機(jī)制。Wang 等[24]研究發(fā)現(xiàn)I/R 損傷大鼠模型出現(xiàn)線粒體功能受損和細(xì)胞凋亡障礙，包括基質(zhì)金屬蛋白酶過表達(dá)、Bcl-2 及Bax 蛋白表達(dá)水平失衡等，而BBR 可以削減上述現(xiàn)象，從而改善I/R 損傷大鼠的心功能。體外研究表明，BBR 可以通過激活Smad7 來改善I/R 損傷[9]。本研究引入了一個(gè)關(guān)鍵性凋亡相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子KLF4，以探討B(tài)BR 保護(hù)作用的潛在機(jī)制。已有文獻(xiàn)報(bào)道KLF4 作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，與I/R 損傷過程中的細(xì)胞凋亡高度相關(guān)[25-26]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KLF4 在經(jīng)BBR 處理的I/R 損傷的心肌細(xì)胞中過表達(dá)，且沉默KLF4 可抑制BBR 對(duì)I/R 損傷所誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，這與預(yù)期相符。Lin 等[27]研究表明，BBR 可以抑制鼠前脂肪胚胎成纖維貼壁細(xì)胞中miR-92 的表達(dá)。Ji 等[28]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-92 是下調(diào)細(xì)胞中KLF4 表達(dá)水平的主要因子。因此，筆者推測(cè)BBR 可能通過抑制miR-92 的表達(dá)，從而上調(diào)KLF4 在心肌細(xì)胞中的表達(dá)。

綜上所述，BBR 可以通過KLF4 依賴的方式保護(hù)心肌細(xì)胞免受I/R 損傷所致的細(xì)胞凋亡。但本研究也存在一定的局限性，由于缺乏臨床樣本和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，在一定程度上削弱了這一結(jié)論，今后將進(jìn)一步深入研究明確。