泛素連接酶與帕金森病發(fā)病機制中線粒體自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的研究進展

梁宇，任銘心，王凱麗，仲光尚，葉明，劉長青*

（1. 蚌埠醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，安徽蚌埠 233000；2. 蚌埠醫(yī)學院生命科學學院；3. 蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是僅次于阿爾茲海默癥的第二大退行性疾病，多發(fā)于中老年，臨床上可分為散發(fā)性PD 和家族性PD［1］。PD 的病理變化以中腦黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元缺失和路易小體（Lewy bodies，LBs）的形成為其主要病理特點［2］。其發(fā)病機制包括遺傳和環(huán)境因素，分為LBs 內(nèi)α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）的聚集、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin proteasome system，UPS）損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、線粒體異常及神經(jīng)炎癥等因素［3］。這些復雜的相互關系的發(fā)病機制和神經(jīng)細胞程序性死亡是發(fā)病的必要途徑。然而PD 的發(fā)病機制目前仍不清楚。UPS可以通過泛素修飾蛋白質(zhì)發(fā)揮降解或調(diào)節(jié)作用，其損傷是上述PD 發(fā)病機制中眾多誘因的基礎。因此，本文就線粒體自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激這2種細胞器的泛素依賴型保護反應作一綜述。

1 UPS簡介

UPS 是ATP 依賴的高度特異性和選擇性的蛋白水解系統(tǒng)，通過多個步驟降解錯誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)。UPS 可以調(diào)節(jié)細胞中80%的蛋白質(zhì)的降解，幾乎涉及細胞生理發(fā)育的所有方面，包括神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、免疫、病毒感染和細胞凋亡等［4］。

UPS 包括泛素（ubiquitin，Ub）、E1 泛素激活酶、E2 泛素結合酶、E3 泛素連接酶、26S 蛋白酶體和去泛素化酶。人體中有2 種E1 泛素激活酶（Uba1 和Uba6），約40 種E2 泛素結合酶和600 多種E3 泛素連接酶［5］。E3 泛素連接酶可分為3 種：HECT 型、RBR 型、RING 型（包括Ubox 型）［5］。不同類型的E3 泛素連接酶將Ub 傳遞到底物蛋白的方式不同［6］。其中大部分E3 是RING 型，可見E3 泛素連接酶功能作用的復雜性和多樣性［7］。

Ub是UPS的核心部分，是由76個氨基酸殘基組成的一種高度保守的小蛋白質(zhì)（約8.6 KDa）［8］。Ub標記蛋白的水解反應比較復雜。首先，E1泛素激活酶以ATP 依賴的方式在泛素C 端的甘氨酸殘基上激活泛素，而后者則通過硫酯鍵與E1 泛素激活酶的 Cys 殘基結合，從而形成Ub-E1 復合體。E2 泛素結合酶隨后也通過同樣的硫酯鍵將Ub-E1激活的泛素轉(zhuǎn)移到自身的Cys上，從而形成Ub-E2。接下來E3 泛素結合酶能夠識別出Ub-E2 與底物蛋白，并將其直接或間接地轉(zhuǎn)移到底物蛋白上，進而對底物蛋白進行Ub 修飾［9］。經(jīng)過Ub 修飾的底物蛋白會在不同的生理學進程中起作用，這些過程由Ub 鏈來決定。底物的泛素化可以通過單個Ub 修飾分子（單一泛素化）、幾個單個Ub 修飾分子（多泛素化）、Ub 修飾鏈（多聚泛素化）來調(diào)節(jié)［10］。Ub 有7 個賴氨酸殘基（Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48 和Lys63）及其N 端（Met1），可共價連接形成泛素鏈，執(zhí)行不同的生理功能［11］，其中通過Lys48 連接的泛素鏈可以介導26S蛋白酶體對底物的降解，這是泛素化降解的主要鏈型［12］。

2 泛素連接酶與PD的相關性

600 多種E3 泛素連接酶在身體的各個部位表達，通過發(fā)揮不同的功能維持著生理環(huán)境的穩(wěn)定。同樣E3 泛素連接酶在調(diào)節(jié)神經(jīng)退行性疾病中也具有至關重要的作用，通過調(diào)節(jié)線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、神經(jīng)炎癥和細胞凋亡等影響神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生進展［13-14］。α-syn 的異常聚集導致PD 的發(fā)生，其與線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等均可被Parkin 等泛素連接酶調(diào)控，可見泛素連接酶的缺失或突變是PD 發(fā)病機制的基礎。目前與線粒體自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激有關的主要E3 泛素連接酶有Parkin、 CHIP、 SIAH1、 FBXO7 和 HRD1 五種［15-16］，而不同種類泛素連接酶發(fā)揮各自特異性的作用。

3 泛素連接酶與PD 發(fā)病機制中線粒體自噬的相關性

線粒體是一種高度動態(tài)的雙膜細胞器，在真核細胞中發(fā)揮著廣泛的功能。在活性氧、缺氧等外界環(huán)境刺激下可以引起線粒體的損害，從而引起線粒體的自噬。線粒體自噬是一種能夠選擇性地去除受損或多余線粒體的自噬過程，與家族性和散發(fā)性的PD有顯著的病理相關性［17］。PARK6編碼的蛋白激酶PINK1 及PARK2 編碼的E3 泛素連接酶Parkin 被確定是早發(fā)性常染色體隱性遺傳PD 的致病基因［18］。PINK1/Parkin 是泛素依賴型線粒體自噬的重要調(diào)節(jié)通路，PINK1 是Parkin 的上游因子，它能激活Parkin 的E3 泛素結合酶活性，PINK1/Parkin 突變會導致線粒體自噬功能異常，促進PD的發(fā)生和發(fā)展［19］。E3泛素連接酶FBXO7、CHIP 和SIAH1 也是PINK1 的下游底物，參與線粒體自噬。

3.1 PINK1/Parkin 介導的線粒體自噬 PINK1 和Parkin 分別是Ser/Thr 激酶和RBR 型E3 泛素連接酶，是泛素依賴型線粒體自噬途徑的關鍵蛋白，其缺失可能導致PD。在正常的線粒體中，PINK1激酶以膜電位依賴性方式進入線粒體內(nèi)膜。然后PINK1被線粒體內(nèi)膜PARL等蛋白酶切割，這些被切割的PINK1 被逆向轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，由蛋白酶體進行N 端規(guī)則降解［20］。所以，PINK1 在正常情況下的含量非常低，使其難以被檢測到。在線粒體應激和去極化之后，PINK1 進入線粒體機制的通路被切斷。這樣PINK1 即在線粒體的外膜上聚集，從而激活Parkin。PINK1首先在Ser228位點進行自身磷酸化［21］，激活后募集并在Parkin Ser65 位點磷酸活化Parkin，進而泛素化線粒體外膜蛋白OMM，介導線粒體自噬［22］。同時PINK1 也可以在Ser65 磷酸化Ub，進一步募集活化Parkin［23］。Ub 磷酸化和Parkin 是互相依賴的，線粒體上磷酸化Ub 的積累需要Parkin，而Parkin 的募集也取決于Ub的磷酸化［24］。

3.2 FBXO7 通過PINK1/Parkin 通路影響線粒體自噬 FBXO7 是Skp-Cullin-F-box（SCF）E3 泛素連接酶的一段，由PARK15 編碼，其突變導致早發(fā)性常染色體隱性遺傳的PD［25］。正常情況下，F(xiàn)BXO7 主要位于細胞核中，氧化應激會使FBXO7 轉(zhuǎn)運并聚集到線粒體，形成的聚集體會損害線粒體功能［25］。另一方面，F(xiàn)BXO7 可作為輔助蛋白通過與PINK1 和Parkin 相互作用參與線粒體的質(zhì)量控制［26］。FBXO7 可促進Parkin 轉(zhuǎn)移到去極化的線粒體上，而FBXO7 又需要PINK1 才能轉(zhuǎn)移到線粒體中［27］。在哺乳動物中，Parkin 以依賴FBXO7 的方式促進線粒體自噬，沉默F(xiàn)BXO7會抑制Parkin 的寡集和線粒體自噬［27］。FBXO7 基因突變導致的臨床癥狀類似于PINK1 和Parkin 基因突變所產(chǎn)生的癥狀［28］，但是FBXO7 突變患者通常不會在受影響的腦區(qū)產(chǎn)生α-syn，這是其獨有的病理特征［25］。

3.3 CHIP 與Parkin 協(xié)同介導線粒體自噬 CHIP（Hsp70 相互作用蛋白）是U-box 型E3 泛素連接酶，自發(fā)現(xiàn)以來，CHIP 已經(jīng)被證明與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有關，包括卒中、腦出血，阿爾茲海默癥、PD等［29］。其中CHIP影響PD中線粒體自噬和α-syn 的發(fā)生發(fā)展。有研究表明，CHIP 可以快速定位到受損傷的線粒體，并通過線粒體自噬發(fā)揮作用［30］。在果蠅中，CHIP在PINK1信號傳導的下游發(fā)揮作用，當Parkin 沉默表達時，CHIP 的過表達可以挽救線粒體自噬［31］。Parkin 和CHIP 具有協(xié)同性，它們可能有共同的作用底物Miro、Gdap-1、Dnm3 和Drp1 以介導線粒體自噬［32］。然而具體機制和CHIP 介導線粒體自噬有沒有其他途徑還需要進一步研究。

3.4 PINK1-synphilin-1-SIAH1 介導線粒體自噬α-syn 相關蛋白synphilin-1 存在于PD 患者的LBs中［33］，常與α-syn 作為LBs 的標志物。雖然synphilin-1 定位于突觸小泡附近，但其功能仍然不清楚。Parkin 的IBR 結構域與E2 結合酶家族的UcbH7 和UcbH8 蛋白相互作用以促進synphilin-1泛素化［34］，α-syn、synphilin-1 和Parkin 三者共表達導致出現(xiàn)LBs 內(nèi)泛素陽性［35］。研究發(fā)現(xiàn)，PINK1-synphilin-1-SIAH1 是一種不依賴與Parkin的線粒體自噬途徑，抑制Parkin 表達對PINK1-synphilin-1-SIAH1 介導的線粒體自噬沒有影響［36］。其機制是PINK1 將synphilin-1 募集到線粒體，后者再募集SIAH1，進而泛素化線粒體蛋白OMM，介導LC3 募集并運送至溶酶體進行線粒體自噬。

4 泛素連接酶與PD 發(fā)病機制中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的相關性

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)控制著約1/3 蛋白質(zhì)的合成、折疊和轉(zhuǎn)導后修飾，還負責脂質(zhì)和類固醇激素的合成，是Ca2+的主要貯存位點［37］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)主要受未折疊蛋白質(zhì)反應（unfolded protein response，UPR）調(diào)節(jié)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)Ca2+濃度改變，發(fā)生氧化應激或者合成運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)發(fā)生了一些突變時，將導致錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，進而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，并激活UPR［38］。錯誤折疊的蛋白質(zhì)也可以被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關降解途徑（ER-associated degradation，ERAD）清除，ERAD 是指將錯誤折疊的蛋白質(zhì)運出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后被UPS 系統(tǒng)降解的過程。在哺乳動物中，UPR 由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上IRE1、PERK 和ATF6 信號通路介導激活，當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激持續(xù)時間過長時，細胞功能將會發(fā)生障礙，最終導致細胞凋亡，而這是通過CHOP、JNK 和Caspase12 等途徑介導的［39］。越來越多的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與PD 的聯(lián)系存在于遺傳和各種非生物因素的PD 模型中［40］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的α-syn 聚集在體內(nèi)體外通過PERK 途徑誘導了UPR 激活［41］。當?shù)鞍酌阁w功能受損時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累的錯誤折疊蛋白不能被有效降解而導致神經(jīng)元變性［42］。

4.1 Parkin 調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體的相互作用 Imai等［43］早在2000年就發(fā)現(xiàn)Parkin可以抑制UPR誘導的細胞凋亡，這是因為其具有E3 泛素連接酶活性。Parkin 可以被UPR 的PERK/ATF4 信號誘導上調(diào)［44］，然后作為一種參與了ERAD 的E3 泛素連接酶，針對性地泛素化降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的未折疊蛋白質(zhì)，保護神經(jīng)元免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡［45］。Imai 等［46］發(fā)現(xiàn)，在AR-JP 中，Parkin 抑制Parkin 相關的內(nèi)皮素受體樣受體（Pael-R）積累誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，Pael-R 是ER 應激誘導因子和家族性PD的致病因素；并且CHIP可正向調(diào)節(jié)Parkin的E3 活性，增強其抑制Pael-R 誘導的細胞凋亡的能力［46］。另有研究發(fā)現(xiàn)，C/EBP 同源蛋白CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引發(fā)細胞凋亡的調(diào)節(jié)因子，其可被Parkin 泛素化并被26S 蛋白酶體降解［47］。Parkin 也可以E3 泛素連接酶活性抑制JNK 信號，抑制細胞凋亡［48］?？梢奝arkin 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護功能。

此外，Parkin在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中的作用可以相互聯(lián)系并彼此影響。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的接觸位點稱為線粒體相關膜（MAM），Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到線粒體是MAM 的基本功能［49］。PINK1和Parkin也表達于MAM 中，最近研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅PINK1/Parkin 突變體中，損傷的線粒體會通過激活UPR 的Perk 途徑產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號［50］。還發(fā)現(xiàn)PINK1/Parkin磷酸泛素化MFN2，促進線粒體自噬和線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分開［51］。MFN2是MAM中的關鍵組成部分，敲除MFN2 可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體相互作用［52］。然而，有與之相反的研究表明，PINK1/Parkin 突變或抑制表達導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的相互作用減少［53-54］。這2 種矛盾的學說表明PINK1/Parkin 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體中具有重要作用，但仍不完全清楚。

4.2 HRD1 通過降解Pael-R 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 HMG-CoA還原酶降解蛋白1（HRD1）包含有E3 的環(huán)指結構域，在黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元中廣泛表達，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。其與Parkin均在ERAD 中發(fā)揮保護作用［55］，HRD1被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的IRE1 和ATF6 信號上調(diào)，進而泛素降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)［56］。上調(diào)的HRD1 可以泛素化并降解EIF2α 和IRE1α，抑制PERK-EIF2α-ATF4-CHOP 和IRE1α-p38 信號通路，減少細胞凋亡［57-58］。同時HRD1 與Parkin 有相同的作用底物Pael-R，HRD1 可以介導Pael-R 的泛素化和降解，抑制其誘導的神經(jīng)細胞凋亡［59］。而且當HRD1 抑制表達時，Parkin 表達上調(diào)；Parkin 抑制表達時，HRD1 表達水平不變［60］。所以Parkin 可以通過補償機制緩解HRD1 突變導致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞凋亡。

4.3 CHIP 維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的適應反應 有研究發(fā)現(xiàn)，過表達的CHIP 抑制了由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的CHOP 和p53 的上調(diào)，減弱了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的凋亡反應［61］。同時CHIP 不能影響UPR 誘導的BiP/GRP78 上調(diào)，維持了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的適應反應［61］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶BiP/GRP78 是PD 中UPR 啟動的重要蛋白。在未折疊蛋白的壓力下，BiP/GRP78 會與PERK、IRE1 和ATF6 解離，進而發(fā)揮減弱翻譯，促進蛋白質(zhì)正確折疊等保護功能［62］。而且CHIP 也可泛素化IRE1，促進IRE1/TRAF2 復合物的形成，拮抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的衰老過程［63］。

E3 泛素連接酶參與調(diào)控線粒體自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用機制見圖1。

圖1 E3泛素連接酶參與調(diào)控線粒體自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

5 小結與展望

UPS 途徑泛素降解系統(tǒng)近年來被廣泛關注，其各種組成結構和功能均逐漸明確，冷凍電鏡技術的發(fā)展將難以解密的26S 蛋白酶體結構得以窺視。但是泛素連接酶種類繁多，以Parkin 為代表研究較多的泛素連接酶，仍有很多機制需要進一步研究。Parkin通過調(diào)控線粒體自噬發(fā)揮保護和凋亡的機制如何闡明，什么原因?qū)е聝煞N不同的自噬結果；Parkin 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體串擾中為什么具有兩種相反的作用；這些問題仍有待后續(xù)進一步研究。不同的泛素連接酶，在某些方面也許有同樣的功能。Parkin、FBXO7、CHIP 和SIAH1 具有神經(jīng)保護作用，這是通過調(diào)節(jié)線粒體自噬來實現(xiàn)的；Parkin、HRD1 和CHIP 可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的神經(jīng)細胞凋亡。然而E3 泛素連接酶SIAH1 在PD 的發(fā)生發(fā)展中，與其它泛素連接酶不同，具有雙重效應，SIAH 促進線粒體自噬的同時，也促進α-syn的單泛素化聚集?？傊?，這些E3泛素連接酶通過影響線粒體自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑，促進或者抑制PD 的發(fā)病過程，為后續(xù)研究UPS途徑治療PD提供了有價值的治療線索。