百合組培鱗莖一次性成球技術(shù)體系的構(gòu)建

趙乙璉 席夢(mèng)利

摘要：為簡(jiǎn)化百合組培操作流程，減少鱗莖培養(yǎng)基配方的種類，縮短種球繁育周期，滿足企業(yè)及種球生產(chǎn)用戶百合繁育的需求，以百合品種“幸運(yùn)花束”為試材，通過(guò)對(duì)百合組培生長(zhǎng)過(guò)程中的溫度、光照等培養(yǎng)環(huán)境及激素、蔗糖、培養(yǎng)基等進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，25 ℃條件下有利于百合鱗莖的發(fā)育，溫度過(guò)高（≥30 ℃）或過(guò)低（≤15 ℃）都會(huì)嚴(yán)重抑制鱗莖的生長(zhǎng)；而在光照培養(yǎng)過(guò)程中，全暗培養(yǎng)不僅有利于鱗莖的發(fā)育，而且節(jié)約能源，更能滿足實(shí)際生產(chǎn)的需求；在激素組合誘導(dǎo)鱗片成芽及促進(jìn)鱗莖發(fā)育的過(guò)程中，6-BA和NAA依然是百合組培的最佳組合，但在鱗片誘導(dǎo)成芽及小鱗莖發(fā)育膨大的過(guò)程中，其激素組合濃度雖有差異，但通過(guò)對(duì)比研究表明6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L激素組合能夠同時(shí)滿足百合鱗片不定芽誘導(dǎo)和小鱗莖發(fā)育的需求；在蔗糖的添加中，60 g/L的蔗糖濃度有利于百合鱗莖的生長(zhǎng)發(fā)育，過(guò)高易造成鱗莖發(fā)育畸形，過(guò)低導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)不足；1/2MS、MS等2種培養(yǎng)基對(duì)組培鱗莖根的發(fā)育差異性較小、生根狀態(tài)都良好，且都顯著好于1/4MS和2MS。研究表明，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖60 g/L，瓊脂6 g/L，pH值5.8～6.0，在25 ℃和全暗條件下培養(yǎng)45 d的百合組培技術(shù)體系，可以滿足百合組培規(guī)?；瘜?shí)際生產(chǎn)的需求，為百合種球繁育提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：百合；組培；一次性成球；規(guī)?；庇?/p>

中圖分類號(hào)：S644.104+.3??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??文章編號(hào)：1002-1302（2023）09-0162-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31670603）。

作者簡(jiǎn)介：趙乙璉（1995—），女，江蘇連云港人，博士研究生，從事植物細(xì)胞工程及分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究。E-mail：719591137@qq.com。

通信作者：席夢(mèng)利，博士，教授，主要從事植物細(xì)胞工程及分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究。E-mail：ximenglinjfu@126.com。

百合（Lilium brownii var. viridulum）屬于百合科百合屬，為多年生宿根草本植物［1］。作為世界上最重要的商品和公園花卉，在切花、庭院及公園綠化等方面得到廣泛的應(yīng)用［2］，有力助推了鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和美麗中國(guó)的建設(shè)。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)需求和種植面積的增加，百合種球的需求量越來(lái)越大，但由于百合株芽、種子和鱗片扦插等傳統(tǒng)的繁殖方法存在易帶病、感病、種球品質(zhì)差等缺點(diǎn)［3］，嚴(yán)重制約了百合產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而百合組培具有保持繁殖系數(shù)高、縮短種球繁育周期、種球品質(zhì)好等特性［4］，有利于百合種球的規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)及百合新品種的培育。

目前，關(guān)于百合組培的報(bào)道較多，大多以鱗片、葉片為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)愈傷、轉(zhuǎn)化成苗、鱗莖生根等步驟進(jìn)行并建立了高效的組培體系［5］。但由于所需培養(yǎng)基配方較多，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，實(shí)際操作過(guò)程較為繁瑣，生產(chǎn)的百合組培鱗莖質(zhì)量參差不齊，因此在繁育過(guò)程中難以標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)施及普及。簡(jiǎn)化組培操作流程，減少鱗莖培養(yǎng)基配方種類，構(gòu)建一次性成球的百合組培技術(shù)體系，才能滿足企業(yè)及種球生產(chǎn)用戶繁育需求。然而關(guān)于百合組培鱗莖一次性成球體系的研究卻相對(duì)較少。百合組培鱗莖一次性成球技術(shù)體系，就是通過(guò)1～2種鱗莖培養(yǎng)基配方，在基本相同的培養(yǎng)環(huán)境體系下，培養(yǎng)高品質(zhì)組培鱗莖的過(guò)程。本研究是在傳統(tǒng)百合鱗莖組培的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)溫度、光照等培養(yǎng)環(huán)境以及蔗糖、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)基等培養(yǎng)體系的綜合優(yōu)化和篩選，建立了高效的百合組培鱗莖一次性成球的技術(shù)體系，可為百合種球規(guī)?；M培擴(kuò)繁提供技術(shù)支撐。

1?材料與方法

1.1?材料與處理

供試百合品種為“幸運(yùn)花束”，選取無(wú)病蟲害、無(wú)機(jī)械損傷的“幸運(yùn)花束”種球中層鱗片為試驗(yàn)材料，用自來(lái)水流水沖洗30 min后，先用75%乙醇浸泡搖動(dòng)30 s，再用0.5%次氯酸鈉消毒10 min，用無(wú)菌水漂洗4次后備用。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)處理5個(gè)外植體。試驗(yàn)于2022年1—12月在南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院進(jìn)行。

1.2?溫度及光照對(duì)百合組培鱗莖發(fā)育的影響

把消毒后的百合鱗片接種于培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.3 mg/L+60 g/L蔗糖，瓊脂6 g/L，pH值5.8～6.0）上，分別在15、20、25、30 ℃ 的溫度和全暗條件下培養(yǎng)45 d，測(cè)定其生長(zhǎng)變化情況；25 ℃條件下，分別在自然光、光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）和全暗條件下培養(yǎng) 45 d，測(cè)定其生長(zhǎng)變化情況。

1.3?不同激素組合對(duì)鱗片不定芽誘導(dǎo)的影響

把消毒后的百合鱗片，切成約5 mm2的方形小塊，在無(wú)菌條件下接種到培養(yǎng)基（MS+60 g/L蔗糖，瓊脂6 g/L，pH值5.8～6.0）上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇MS為基本培養(yǎng)基，配合2種激素組合，濃度梯度為 6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）；NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L），正交組合。在25 ℃和全暗條件下培養(yǎng) 45 d，統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率以及觀察其生長(zhǎng)變化情況。

1.4?蔗糖濃度對(duì)鱗莖發(fā)育的影響

把消毒后的百合鱗片分別接種于不同濃度蔗糖（0、30、60、90、120 g/L）的培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.3 mg/L，瓊脂6 g/L，pH值5.8～6.0）上，在25 ℃和全暗條件下培養(yǎng)45 d，測(cè)定其生長(zhǎng)變化情況。

1.5?不同激素組合對(duì)百合鱗莖生長(zhǎng)的影響

將鱗片誘導(dǎo)形成的小鱗莖（直徑0.2～0.3 cm）通過(guò)繼代培養(yǎng)的方式接種于含有不同生長(zhǎng)激素組合的培養(yǎng)基中（MS+60 g/L蔗糖，瓊脂 6 g/L，pH值5.8～6.0），其激素濃度設(shè)置梯度分別為 6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L），NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L），通過(guò)正交試驗(yàn)組合。在25 ℃和全暗條件下培養(yǎng) 45 d，觀察統(tǒng)計(jì)百合鱗莖生長(zhǎng)變化情況。

1.6?不同培養(yǎng)基對(duì)百合生根的影響

將鱗片誘導(dǎo)形成的小鱗莖（直徑0.2～0.3 cm）分別接種于1/4MS、1/2MS、MS、2MS培養(yǎng)基（6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.3 mg/L，蔗糖60 g/L、瓊脂 6 g/L，pH值5.8～6.0）上，在25 ℃和全暗條件下培養(yǎng)45 d，觀察測(cè)定其生長(zhǎng)變化情況。

2?結(jié)果與分析

2.1?溫度對(duì)鱗莖發(fā)育的影響

由表1可以看出，在15、20、25 ℃等3種溫度條件下，試管鱗莖生成數(shù)量差異較小，而在30 ℃培養(yǎng)條件下試管鱗莖生成數(shù)量顯著減少；不同培養(yǎng)溫度下鱗莖質(zhì)量及直徑均存在差異，以25 ℃條件下形成鱗莖的質(zhì)量及直徑最大，鱗莖質(zhì)量由大至小的順序分別是：25 ℃>20 ℃>15 ℃>30 ℃，鱗莖直徑由大至小的順序分別是：25 ℃>30 ℃>15 ℃>20 ℃；15、20、25 ℃等3種培養(yǎng)溫度下鱗莖生根數(shù)較多，差異不顯著，而30 ℃溫度下鱗莖生根數(shù)很少。通過(guò)以上指標(biāo)可以看出，25 ℃條件有利于百合鱗莖的發(fā)育，溫度過(guò)高（≥30 ℃）或過(guò)低（≤15 ℃）都會(huì)嚴(yán)重抑制鱗莖的生長(zhǎng)發(fā)育。

2.2?光照對(duì)鱗莖發(fā)育的影響

從表2可以看出，在自然光、光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）條件下，平均每個(gè)鱗莖分別有1.5個(gè)和2.6個(gè)鱗片葉生成，在全暗培養(yǎng)條件下，則只有0.5個(gè)鱗片葉生成；全暗條件下形成鱗莖的質(zhì)量、直徑及每個(gè)鱗莖生根數(shù)都顯著大于自然光及 3 000 lx 光照16 h—黑暗8 h條件；而自然光由于光照環(huán)境差異較大，生成的鱗莖質(zhì)量大小不一，而在光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）和全暗2種培養(yǎng)條件下生成的鱗莖大小比較一致；在自然光、光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）和全暗3種培養(yǎng)條件下鱗莖生成的數(shù)量生成的數(shù)量無(wú)顯著性差異 而在自然光、 光—暗（3 000 lx光照16 h—黑暗8 h）和全暗2種培養(yǎng)條件下質(zhì)量卻差異顯著，全暗培養(yǎng)不僅質(zhì)量大，而且節(jié)省能源。因此，全暗培養(yǎng)是鱗莖發(fā)育的最佳培養(yǎng)方式。

2.3?不同激素組合對(duì)鱗片不定芽誘導(dǎo)的影響

由表3可以看出，百合各激素配比處理間的誘導(dǎo)率差異顯著，但對(duì)單個(gè)鱗片誘導(dǎo)芽數(shù)和幼苗長(zhǎng)勢(shì)的影響不明顯。當(dāng)6-BA濃度在0.5 mg/L和 1.0 mg/L 時(shí)，鱗片不定芽誘導(dǎo)率都隨NAA濃度增大而相應(yīng)增加，并在NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)達(dá)到最大，達(dá)80.23%，但此時(shí)幼苗長(zhǎng)勢(shì)細(xì)弱，無(wú)法滿足實(shí)際生產(chǎn)的需求，隨著6-BA濃度的繼續(xù)增大，當(dāng) 6-BA 濃度為1.5 mg/L時(shí)，鱗片不定芽誘導(dǎo)率都隨NAA濃度增大而減少；而當(dāng)6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L時(shí)，鱗片不定芽誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)雖然不是最高，但鱗莖發(fā)育較好，幼苗生長(zhǎng)健壯。

2.4?蔗糖濃度對(duì)鱗莖發(fā)育的影響

由表4可見，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到30 g/L時(shí)形成鱗莖數(shù)量最多，平均達(dá)4.23個(gè)，高于其他蔗糖濃度處理，且每個(gè)鱗莖生根數(shù)最多，在不含蔗糖的培養(yǎng)條件下幾乎沒(méi)有鱗莖形成或形成的鱗莖很??；蔗糖濃度在120 g/L和90 g/L時(shí)，生成鱗莖的鮮質(zhì)量都較大，但每個(gè)鱗片上再生鱗莖數(shù)量都較少，且都畸形最嚴(yán)重，鱗莖發(fā)育不正常；只有蔗糖濃度在30 g/L和60 g/L時(shí)形成的鱗莖發(fā)育正常，而60 g/L的蔗糖條件下形成鱗莖的直徑顯著大于30 g/L條件下形成的鱗莖，故60 g/L的蔗糖濃度有利于百合鱗莖的生長(zhǎng)發(fā)育。

2.5?不同激素組合對(duì)百合鱗莖生長(zhǎng)的影響

從表5可以看出，當(dāng)6-BA的濃度為 0.5 mg/L和1.0 mg/L時(shí)，鱗莖鮮質(zhì)量都分別隨著NAA濃度的增加而增大，當(dāng)激素組合在6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L時(shí)達(dá)到最大，為3.8 g，伴隨6-BA的濃度增加到1.5 mg/L時(shí)，隨著NAA濃度的增大，鱗莖分球數(shù)逐漸增多，但此時(shí)，無(wú)論NAA濃度的大與小，鱗莖鮮質(zhì)量都較小。綜合以上分析，6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L的激素組合效果最好。

2.6?不同培養(yǎng)基對(duì)百合生根的影響

由表6可以看出，百合鱗莖在這4種培養(yǎng)基上均能生根，但是在生根率、平均根長(zhǎng)及根的生長(zhǎng)狀態(tài)等指標(biāo)上有所差異。在百合生根培養(yǎng)的過(guò)程中，隨著培養(yǎng)基成分比例的增大，生根率和平均根長(zhǎng)都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，其中以1/2MS培養(yǎng)基的生根率和平均根長(zhǎng)都最大，分別達(dá)到?76.7%?和2.07 cm；1/2MS、MS等2種培養(yǎng)基根的生長(zhǎng)狀態(tài)顯著好于1/4MS和2MS等2種培養(yǎng)基，且1/2MS、MS等2種培養(yǎng)基在生根率及根長(zhǎng)方面差異性較小，生根狀態(tài)良好。因此，1/2MS及MS培養(yǎng)基均可作為百合生根的基本培養(yǎng)基。

3?結(jié)論與討論

在百合組培繁育過(guò)程中，影響百合鱗莖誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等的關(guān)鍵培養(yǎng)環(huán)境及激素種類都已有較多的研究［6-8］。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境等進(jìn)行了綜合研究和優(yōu)化，并根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需求合理選擇培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境，優(yōu)化了培養(yǎng)體系，簡(jiǎn)化了繁瑣的培養(yǎng)步驟，并沒(méi)有像張進(jìn)忠等根據(jù)培養(yǎng)效果篩選最優(yōu)培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境［9-11］，而是結(jié)合生產(chǎn)需求及對(duì)鱗莖生長(zhǎng)的影響程度合理簡(jiǎn)化培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)基配方。

本研究以百合鱗片為外植體，在培養(yǎng)溫度和光暗培養(yǎng)環(huán)境過(guò)程中，百合鱗莖容易組培成球，這與前人的研究結(jié)果［12-13］較為一致。而在培養(yǎng)基選擇上，通過(guò)不同大量元素濃度的培養(yǎng)基篩選，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基不僅滿足百合鱗莖的發(fā)育，也滿足百合生根的需求，這與Monemi等在生根培養(yǎng)基的選擇上［14-15］不同。作為組培過(guò)程中最重要的碳源物質(zhì)，蔗糖對(duì)鱗莖的膨大具有重要的意義，本研究表明適宜的蔗糖濃度為60 g/L，這與前人研究［16］一致，組培鱗莖能正常生長(zhǎng)，沒(méi)有形成畸形鱗莖，隨著蔗糖濃度的提高，當(dāng)蔗糖濃度為90 g/L和120 g/L時(shí)，組培鱗莖雖比60 g/L蔗糖濃度時(shí)要大，但畸形率較高，鱗莖的整體質(zhì)量下降嚴(yán)重。激素對(duì)鱗莖的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的作用，陳麗靜等通過(guò)6-BA和NAA的激素組合篩選了從愈傷到鱗莖生長(zhǎng)的全過(guò)程［17-18］，而本研究則在他們研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)降低激素濃度組合及優(yōu)化激素配置，篩選出從鱗片誘導(dǎo)成芽到小鱗莖生長(zhǎng)膨大的整個(gè)過(guò)程。本研究不僅簡(jiǎn)化了操作步驟及培養(yǎng)基配方，而且也減少了生根培養(yǎng)基的步驟，直接發(fā)育成可以煉苗的百合鱗莖，其效率更高，更適用于企業(yè)的規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。

本研究通過(guò)優(yōu)化百合培養(yǎng)條件及配方，研究過(guò)程中在篩選最優(yōu)的基礎(chǔ)上，從實(shí)際生產(chǎn)需求及百合鱗莖品質(zhì)等方面綜合考量，建立了更加簡(jiǎn)潔高效的百合組培鱗莖一次性成球技術(shù)體系，即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖60 g/L，瓊脂 6 g/L，pH值5.8～6.0，在25 ℃和全暗條件下培養(yǎng)45 d。該技術(shù)體系不僅減少了不同培養(yǎng)時(shí)期培養(yǎng)基的配方，縮短了鱗莖成球的培養(yǎng)周期，而且所組培的小鱗莖也完全滿足實(shí)際生產(chǎn)需求。

參考文獻(xiàn)：

［1］李介文，杜運(yùn)鵬，賈桂霞，等. 我國(guó)部分百合野生資源的親緣關(guān)系及其分布特點(diǎn)［J］. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，41（10）：74-82.

［2］楊?晶，商萬(wàn)有. 百合的觀賞價(jià)值研究［J］. 吉林農(nóng)業(yè)，2011（9）：171.

［3］陳?華，鄭傳奇，蘇海鋒. 卷丹百合種球繁育及組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 現(xiàn)代食品，2021（16）：29-32，36.

［4］呂翠竹，王有國(guó)，王?立. 綠花百合組培芽增殖與試管鱗莖膨大的影響因素研究［J］. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），2020，40（1）：38-45.

［5］孫紅梅，李?敏，付麟嵐，等. 基于文獻(xiàn)計(jì)量的百合研究趨勢(shì)分析［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2021，37（31）：151-158.

［6］孫明偉，邵小斌，趙統(tǒng)利，等. 切花百合木門組培鱗莖煉苗移栽技術(shù)規(guī)程［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（3）：34-35，43.

［7］梁春輝，閆曉東，黃?敏，等. 降低卷丹百合組培褐變技術(shù)研究［J］. 亞熱帶植物科學(xué)，2017，46（2）：122-125.

［8］Hossein N，Amir H G. Innovative optimal approach to implement fast propagation tissue culture［J］. Biosciences Biotechnology Research Asia，2017，14（2）：615-620..

［9］張進(jìn)忠，韋紹龍，孫嘉曼，等. 蘭州百合組培鱗莖發(fā)育研究［J］. 廣西植物，2016，36（3）：297-302.

［10］秦新惠，崔興林，陳學(xué)紅，等. 不同因子對(duì)蘭州百合組培小鱗莖膨大的影響研究［J］. 林業(yè)科技通訊，2015（12）：44-47.

［11］孫紅梅，宋勝利，申屠玥，等. 亞洲百合花器官組培快繁技術(shù)研究［J］. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46（1）：7-12.

［12］崔?祺，賈桂霞. 3種百合組培快繁體系的優(yōu)化［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，40（6）：621-626.

［13］張?杰，李?洋，孫紅梅. LA系列百合‘Eyeliner花器官組培快繁技術(shù)研究［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2014，34（9）：1894-1899.

［14］Monemi M B，Kazemitabar S K，Bakhshee K G，et al. Tissue culture study of the medicinal plant leek （Allium ampeloprasum L.）［J］. International Journal of Molecular and Cellular Medicine，2014，3（2）：118-125.

［15］杜?帥，李?丹，杜喜春，等. 綠花百合組培快繁技術(shù)研究［J］. 現(xiàn)代園藝，2014（8）：12-13.

［16］張彥妮，李兆婷，張艷波，等. 毛百合試管鱗莖形成和膨大的培養(yǎng)優(yōu)化［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：74-78.

［17］陳麗靜，殷小娟，李俊嵐，等. 細(xì)葉百合鱗片誘導(dǎo)與遺傳轉(zhuǎn)化組培體系的建立［J］. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，26（2）：718-722.

［18］Min H K，Young H L，Wook O H，et al. Effects of hot water and chilling treatments of bulblets propagated by tissue culture on sprouting and bulb development in Korean native lilies［J］. Korean Journal of Horticultural Science & Technology，2011，29（2）：87-94.