趙乙璉 席夢利
摘要:為簡化百合組培操作流程,減少鱗莖培養(yǎng)基配方的種類,縮短種球繁育周期,滿足企業(yè)及種球生產(chǎn)用戶百合繁育的需求,以百合品種“幸運花束”為試材,通過對百合組培生長過程中的溫度、光照等培養(yǎng)環(huán)境及激素、蔗糖、培養(yǎng)基等進(jìn)行優(yōu)化,并結(jié)合實際生產(chǎn)進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明,25 ℃條件下有利于百合鱗莖的發(fā)育,溫度過高(≥30 ℃)或過低(≤15 ℃)都會嚴(yán)重抑制鱗莖的生長;而在光照培養(yǎng)過程中,全暗培養(yǎng)不僅有利于鱗莖的發(fā)育,而且節(jié)約能源,更能滿足實際生產(chǎn)的需求;在激素組合誘導(dǎo)鱗片成芽及促進(jìn)鱗莖發(fā)育的過程中,6-BA和NAA依然是百合組培的最佳組合,但在鱗片誘導(dǎo)成芽及小鱗莖發(fā)育膨大的過程中,其激素組合濃度雖有差異,但通過對比研究表明6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L激素組合能夠同時滿足百合鱗片不定芽誘導(dǎo)和小鱗莖發(fā)育的需求;在蔗糖的添加中,60 g/L的蔗糖濃度有利于百合鱗莖的生長發(fā)育,過高易造成鱗莖發(fā)育畸形,過低導(dǎo)致營養(yǎng)不足;1/2MS、MS等2種培養(yǎng)基對組培鱗莖根的發(fā)育差異性較小、生根狀態(tài)都良好,且都顯著好于1/4MS和2MS。研究表明,MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖60 g/L,瓊脂6 g/L,pH值5.8~6.0,在25 ℃和全暗條件下培養(yǎng)45 d的百合組培技術(shù)體系,可以滿足百合組培規(guī)?;瘜嶋H生產(chǎn)的需求,為百合種球繁育提供技術(shù)支撐。
關(guān)鍵詞:百合;組培;一次性成球;規(guī)模化繁育
中圖分類號:S644.104+.3??文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A??文章編號:1002-1302(2023)09-0162-04
基金項目:國家自然科學(xué)基金(編號:31670603)。
作者簡介:趙乙璉(1995—),女,江蘇連云港人,博士研究生,從事植物細(xì)胞工程及分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究。E-mail:719591137@qq.com。
通信作者:席夢利,博士,教授,主要從事植物細(xì)胞工程及分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究。E-mail:ximenglinjfu@126.com。
百合(Lilium brownii var. viridulum)屬于百合科百合屬,為多年生宿根草本植物[1]。作為世界上最重要的商品和公園花卉,在切花、庭院及公園綠化等方面得到廣泛的應(yīng)用[2],有力助推了鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和美麗中國的建設(shè)。近年來,隨著市場需求和種植面積的增加,百合種球的需求量越來越大,但由于百合株芽、種子和鱗片扦插等傳統(tǒng)的繁殖方法存在易帶病、感病、種球品質(zhì)差等缺點[3],嚴(yán)重制約了百合產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而百合組培具有保持繁殖系數(shù)高、縮短種球繁育周期、種球品質(zhì)好等特性[4],有利于百合種球的規(guī)?;?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)及百合新品種的培育。
目前,關(guān)于百合組培的報道較多,大多以鱗片、葉片為外植體,通過誘導(dǎo)愈傷、轉(zhuǎn)化成苗、鱗莖生根等步驟進(jìn)行并建立了高效的組培體系[5]。但由于所需培養(yǎng)基配方較多,培養(yǎng)周期較長,實際操作過程較為繁瑣,生產(chǎn)的百合組培鱗莖質(zhì)量參差不齊,因此在繁育過程中難以標(biāo)準(zhǔn)化實施及普及。簡化組培操作流程,減少鱗莖培養(yǎng)基配方種類,構(gòu)建一次性成球的百合組培技術(shù)體系,才能滿足企業(yè)及種球生產(chǎn)用戶繁育需求。然而關(guān)于百合組培鱗莖一次性成球體系的研究卻相對較少。百合組培鱗莖一次性成球技術(shù)體系,就是通過1~2種鱗莖培養(yǎng)基配方,在基本相同的培養(yǎng)環(huán)境體系下,培養(yǎng)高品質(zhì)組培鱗莖的過程。本研究是在傳統(tǒng)百合鱗莖組培的基礎(chǔ)上,通過對溫度、光照等培養(yǎng)環(huán)境以及蔗糖、植物生長調(diào)節(jié)劑、培養(yǎng)基等培養(yǎng)體系的綜合優(yōu)化和篩選,建立了高效的百合組培鱗莖一次性成球的技術(shù)體系,可為百合種球規(guī)?;M培擴(kuò)繁提供技術(shù)支撐。
1?材料與方法
1.1?材料與處理
供試百合品種為“幸運花束”,選取無病蟲害、無機(jī)械損傷的“幸運花束”種球中層鱗片為試驗材料,用自來水流水沖洗30 min后,先用75%乙醇浸泡搖動30 s,再用0.5%次氯酸鈉消毒10 min,用無菌水漂洗4次后備用。每個試驗重復(fù)3次,每個處理5個外植體。試驗于2022年1—12月在南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院進(jìn)行。
1.2?溫度及光照對百合組培鱗莖發(fā)育的影響
把消毒后的百合鱗片接種于培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.8mg/L+NAA 0.3 mg/L+60 g/L蔗糖,瓊脂6 g/L,pH值5.8~6.0)上,分別在15、20、25、30 ℃ 的溫度和全暗條件下培養(yǎng)45 d,測定其生長變化情況;25 ℃條件下,分別在自然光、光—暗(3 000 lx光照16 h—黑暗8 h)和全暗條件下培養(yǎng) 45 d,測定其生長變化情況。
1.3?不同激素組合對鱗片不定芽誘導(dǎo)的影響
把消毒后的百合鱗片,切成約5 mm2的方形小塊,在無菌條件下接種到培養(yǎng)基(MS+60 g/L蔗糖,瓊脂6 g/L,pH值5.8~6.0)上。誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇MS為基本培養(yǎng)基,配合2種激素組合,濃度梯度為 6-BA(0.5、1.0、1.5 mg/L);NAA(0.1、0.3、0.5 mg/L),正交組合。在25 ℃和全暗條件下培養(yǎng) 45 d,統(tǒng)計不定芽的誘導(dǎo)率以及觀察其生長變化情況。
1.4?蔗糖濃度對鱗莖發(fā)育的影響
把消毒后的百合鱗片分別接種于不同濃度蔗糖(0、30、60、90、120 g/L)的培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.3 mg/L,瓊脂6 g/L,pH值5.8~6.0)上,在25 ℃和全暗條件下培養(yǎng)45 d,測定其生長變化情況。
1.5?不同激素組合對百合鱗莖生長的影響
將鱗片誘導(dǎo)形成的小鱗莖(直徑0.2~0.3 cm)通過繼代培養(yǎng)的方式接種于含有不同生長激素組合的培養(yǎng)基中(MS+60 g/L蔗糖,瓊脂 6 g/L,pH值5.8~6.0),其激素濃度設(shè)置梯度分別為 6-BA(0.5、1.0、1.5 mg/L),NAA(0.1、0.3、0.5 mg/L),通過正交試驗組合。在25 ℃和全暗條件下培養(yǎng) 45 d,觀察統(tǒng)計百合鱗莖生長變化情況。
1.6?不同培養(yǎng)基對百合生根的影響
將鱗片誘導(dǎo)形成的小鱗莖(直徑0.2~0.3 cm)分別接種于1/4MS、1/2MS、MS、2MS培養(yǎng)基(6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.3 mg/L,蔗糖60 g/L、瓊脂 6 g/L,pH值5.8~6.0)上,在25 ℃和全暗條件下培養(yǎng)45 d,觀察測定其生長變化情況。
2?結(jié)果與分析
2.1?溫度對鱗莖發(fā)育的影響
由表1可以看出,在15、20、25 ℃等3種溫度條件下,試管鱗莖生成數(shù)量差異較小,而在30 ℃培養(yǎng)條件下試管鱗莖生成數(shù)量顯著減少;不同培養(yǎng)溫度下鱗莖質(zhì)量及直徑均存在差異,以25 ℃條件下形成鱗莖的質(zhì)量及直徑最大,鱗莖質(zhì)量由大至小的順序分別是:25 ℃>20 ℃>15 ℃>30 ℃,鱗莖直徑由大至小的順序分別是:25 ℃>30 ℃>15 ℃>20 ℃;15、20、25 ℃等3種培養(yǎng)溫度下鱗莖生根數(shù)較多,差異不顯著,而30 ℃溫度下鱗莖生根數(shù)很少。通過以上指標(biāo)可以看出,25 ℃條件有利于百合鱗莖的發(fā)育,溫度過高(≥30 ℃)或過低(≤15 ℃)都會嚴(yán)重抑制鱗莖的生長發(fā)育。
2.2?光照對鱗莖發(fā)育的影響
從表2可以看出,在自然光、光—暗(3 000 lx光照16 h—黑暗8 h)條件下,平均每個鱗莖分別有1.5個和2.6個鱗片葉生成,在全暗培養(yǎng)條件下,則只有0.5個鱗片葉生成;全暗條件下形成鱗莖的質(zhì)量、直徑及每個鱗莖生根數(shù)都顯著大于自然光及 3 000 lx 光照16 h—黑暗8 h條件;而自然光由于光照環(huán)境差異較大,生成的鱗莖質(zhì)量大小不一,而在光—暗(3 000 lx光照16 h—黑暗8 h)和全暗2種培養(yǎng)條件下生成的鱗莖大小比較一致;在自然光、光—暗(3 000 lx光照16 h—黑暗8 h)和全暗3種培養(yǎng)條件下鱗莖生成的數(shù)量生成的數(shù)量無顯著性差異 而在自然光、 光—暗(3 000 lx光照16 h—黑暗8 h)和全暗2種培養(yǎng)條件下質(zhì)量卻差異顯著,全暗培養(yǎng)不僅質(zhì)量大,而且節(jié)省能源。因此,全暗培養(yǎng)是鱗莖發(fā)育的最佳培養(yǎng)方式。
2.3?不同激素組合對鱗片不定芽誘導(dǎo)的影響
由表3可以看出,百合各激素配比處理間的誘導(dǎo)率差異顯著,但對單個鱗片誘導(dǎo)芽數(shù)和幼苗長勢的影響不明顯。當(dāng)6-BA濃度在0.5 mg/L和 1.0 mg/L 時,鱗片不定芽誘導(dǎo)率都隨NAA濃度增大而相應(yīng)增加,并在NAA濃度為0.5 mg/L時達(dá)到最大,達(dá)80.23%,但此時幼苗長勢細(xì)弱,無法滿足實際生產(chǎn)的需求,隨著6-BA濃度的繼續(xù)增大,當(dāng) 6-BA 濃度為1.5 mg/L時,鱗片不定芽誘導(dǎo)率都隨NAA濃度增大而減少;而當(dāng)6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L時,鱗片不定芽誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)雖然不是最高,但鱗莖發(fā)育較好,幼苗生長健壯。
2.4?蔗糖濃度對鱗莖發(fā)育的影響
由表4可見,當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到30 g/L時形成鱗莖數(shù)量最多,平均達(dá)4.23個,高于其他蔗糖濃度處理,且每個鱗莖生根數(shù)最多,在不含蔗糖的培養(yǎng)條件下幾乎沒有鱗莖形成或形成的鱗莖很??;蔗糖濃度在120 g/L和90 g/L時,生成鱗莖的鮮質(zhì)量都較大,但每個鱗片上再生鱗莖數(shù)量都較少,且都畸形最嚴(yán)重,鱗莖發(fā)育不正常;只有蔗糖濃度在30 g/L和60 g/L時形成的鱗莖發(fā)育正常,而60 g/L的蔗糖條件下形成鱗莖的直徑顯著大于30 g/L條件下形成的鱗莖,故60 g/L的蔗糖濃度有利于百合鱗莖的生長發(fā)育。
2.5?不同激素組合對百合鱗莖生長的影響
從表5可以看出,當(dāng)6-BA的濃度為 0.5 mg/L和1.0 mg/L時,鱗莖鮮質(zhì)量都分別隨著NAA濃度的增加而增大,當(dāng)激素組合在6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L時達(dá)到最大,為3.8 g,伴隨6-BA的濃度增加到1.5 mg/L時,隨著NAA濃度的增大,鱗莖分球數(shù)逐漸增多,但此時,無論NAA濃度的大與小,鱗莖鮮質(zhì)量都較小。綜合以上分析,6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L的激素組合效果最好。
2.6?不同培養(yǎng)基對百合生根的影響
由表6可以看出,百合鱗莖在這4種培養(yǎng)基上均能生根,但是在生根率、平均根長及根的生長狀態(tài)等指標(biāo)上有所差異。在百合生根培養(yǎng)的過程中,隨著培養(yǎng)基成分比例的增大,生根率和平均根長都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,其中以1/2MS培養(yǎng)基的生根率和平均根長都最大,分別達(dá)到?76.7%?和2.07 cm;1/2MS、MS等2種培養(yǎng)基根的生長狀態(tài)顯著好于1/4MS和2MS等2種培養(yǎng)基,且1/2MS、MS等2種培養(yǎng)基在生根率及根長方面差異性較小,生根狀態(tài)良好。因此,1/2MS及MS培養(yǎng)基均可作為百合生根的基本培養(yǎng)基。
3?結(jié)論與討論
在百合組培繁育過程中,影響百合鱗莖誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)化等的關(guān)鍵培養(yǎng)環(huán)境及激素種類都已有較多的研究[6-8]。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,對培養(yǎng)基、培養(yǎng)環(huán)境等進(jìn)行了綜合研究和優(yōu)化,并根據(jù)實際生產(chǎn)需求合理選擇培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境,優(yōu)化了培養(yǎng)體系,簡化了繁瑣的培養(yǎng)步驟,并沒有像張進(jìn)忠等根據(jù)培養(yǎng)效果篩選最優(yōu)培養(yǎng)基及培養(yǎng)環(huán)境[9-11],而是結(jié)合生產(chǎn)需求及對鱗莖生長的影響程度合理簡化培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)基配方。
本研究以百合鱗片為外植體,在培養(yǎng)溫度和光暗培養(yǎng)環(huán)境過程中,百合鱗莖容易組培成球,這與前人的研究結(jié)果[12-13]較為一致。而在培養(yǎng)基選擇上,通過不同大量元素濃度的培養(yǎng)基篩選,發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基不僅滿足百合鱗莖的發(fā)育,也滿足百合生根的需求,這與Monemi等在生根培養(yǎng)基的選擇上[14-15]不同。作為組培過程中最重要的碳源物質(zhì),蔗糖對鱗莖的膨大具有重要的意義,本研究表明適宜的蔗糖濃度為60 g/L,這與前人研究[16]一致,組培鱗莖能正常生長,沒有形成畸形鱗莖,隨著蔗糖濃度的提高,當(dāng)蔗糖濃度為90 g/L和120 g/L時,組培鱗莖雖比60 g/L蔗糖濃度時要大,但畸形率較高,鱗莖的整體質(zhì)量下降嚴(yán)重。激素對鱗莖的生長發(fā)育具有重要的作用,陳麗靜等通過6-BA和NAA的激素組合篩選了從愈傷到鱗莖生長的全過程[17-18],而本研究則在他們研究的基礎(chǔ)上,通過降低激素濃度組合及優(yōu)化激素配置,篩選出從鱗片誘導(dǎo)成芽到小鱗莖生長膨大的整個過程。本研究不僅簡化了操作步驟及培養(yǎng)基配方,而且也減少了生根培養(yǎng)基的步驟,直接發(fā)育成可以煉苗的百合鱗莖,其效率更高,更適用于企業(yè)的規(guī)?;?、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。
本研究通過優(yōu)化百合培養(yǎng)條件及配方,研究過程中在篩選最優(yōu)的基礎(chǔ)上,從實際生產(chǎn)需求及百合鱗莖品質(zhì)等方面綜合考量,建立了更加簡潔高效的百合組培鱗莖一次性成球技術(shù)體系,即MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖60 g/L,瓊脂 6 g/L,pH值5.8~6.0,在25 ℃和全暗條件下培養(yǎng)45 d。該技術(shù)體系不僅減少了不同培養(yǎng)時期培養(yǎng)基的配方,縮短了鱗莖成球的培養(yǎng)周期,而且所組培的小鱗莖也完全滿足實際生產(chǎn)需求。
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