應(yīng)用二次PCR檢測草莓炭疽病菌

唐冬蘭 蔣立奔 唐泉 宋芹芹 曹榮祥

摘要：開發(fā)了一種基于PCR的草莓炭疽病致病菌暹羅炭疽菌（Colletotrichum sisamense）檢測方法。通過分析暹羅炭疽菌及24種真菌的ITS區(qū)序列，設(shè)計了1條反向特異引物CsiaR，結(jié)合引物CgInt可僅從暹羅炭疽菌中擴(kuò)出約 400 bp 片段。對不同濃度暹羅炭疽菌DNA溶液進(jìn)行檢測，第1輪和第2輪PCR的最低檢出限分別為50 pg/μL和 5 fg/μL；對接種不同濃度暹羅炭疽菌分生孢子懸浮液的草莓樣本（接種48 h，癥狀未出現(xiàn)）進(jìn)行檢測，低于1.0×104個孢子/mL的處理無法檢出；對田間隨機(jī)采集的草莓樣本檢測時，PCR檢測陽性的樣本（含有癥狀和無癥狀）中均可分離到暹羅炭疽菌。總體來說，本方法可用于草莓中暹羅炭疽菌的早期、快速及準(zhǔn)確檢測，從而為草莓炭疽病的及時有效防控提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：草莓；炭疽??；暹羅炭疽菌；ITS序列；PCR檢測

中圖分類號：S436.68+4??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??文章編號：1002-1302（2023）09-0125-06

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金［編號：CX（20）3017］；亞夫科技服務(wù)項目［編號：KF（20）1021］；江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（編號：JATS［2021］008）。

作者簡介：唐冬蘭（1983—），女，江蘇淮安人，博士，副研究員，主要從事果樹病理學(xué)及種質(zhì)資源研究。TE-mail：dofthmlhm@163.com。

通信作者：曹榮祥，男，江蘇揚(yáng)州人，副研究員，主要從事草莓栽培與生理研究。E-mail：3060601887@qq.com。

草莓作為一種果形美觀、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)價值豐富的水果，不僅深受消費者青睞，還為莓農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，種植面積逐年提升，但由于品種單一、國內(nèi)大部分采用設(shè)施栽培導(dǎo)致草莓病害防不勝防，給草莓產(chǎn)業(yè)帶來的損失也是不容忽視的。其中，炭疽病首當(dāng)其沖，凡有草莓種植的地方，如湖北、浙江、陜西、江蘇等，幾乎均有該病報道［2-6］。草莓生長的各階段，地上部各部位包括葉片、匍匐莖、果實、葉柄及莖基部等均可被該病病原菌侵染，其中，以侵染莖基部危害最大，嚴(yán)重時可導(dǎo)致整個植株死亡，防治難度與土傳病害無異。

國內(nèi)目前已知可引起草莓炭疽病的致病菌主要有3種：尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）、膠孢炭疽菌［C. gloeosporioides］、草莓炭疽菌（C. fragariae）。其中，膠孢炭疽菌復(fù)合種中的暹羅炭疽菌（C. siamense）被鑒定為多地優(yōu)勢種［7-9］。

草莓炭疽病菌的防治目前主要采用化學(xué)防治的方法，生產(chǎn)中莓農(nóng)通常在出現(xiàn)肉眼可見的癥狀后針對性地用藥，或是在癥狀出現(xiàn)前，隨意大量用藥，不僅成本高，而且長期大量用藥會造成病原菌產(chǎn)生抗藥性導(dǎo)致防治難度逐漸加大，同時也對環(huán)境造成巨大污染［10］。事實上，在出現(xiàn)癥狀后再進(jìn)行防治，病害往往已侵入植株內(nèi)部，即使用藥也很難控制。因此，通過檢測技術(shù)盡早、準(zhǔn)確地掌握植株帶菌情況對炭疽病的控制及草莓的安全生產(chǎn)至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的病害檢測，通常采用分離培養(yǎng)和形態(tài)觀察的方式，這種方法步驟多，鑒定環(huán)節(jié)需要操作者有很豐富的真菌形態(tài)分類鑒定經(jīng)驗，一系列的操作至少需要5～7 d，往往已錯過最佳防治時期［11］。

近年，分子檢測技術(shù)逐漸普及，基本原理通常是利用種內(nèi)保守、種間多態(tài)的區(qū)域設(shè)計特異引物對病原菌的基因組進(jìn)行特異擴(kuò)增，其中，ITS區(qū)（核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）又因其在基因組中通常表現(xiàn)為多拷貝狀態(tài)，可以提高擴(kuò)增效率而更常被使用。國內(nèi)外已有研究人員開發(fā)出了多種病原菌的特異引物，如向日葵黑莖病菌（Phoma macdonaldii）［12］、柑橘黃龍病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）［13］、橄欖黃萎病菌（Verticillium dahliae）［14］等，在草莓上也有尖孢炭疽菌（C. acutatum）、草莓炭疽病菌（C. fragariae）［15］、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysproum f. sp. fragariae）［16］、腐皮鐮刀菌（F. solani）［17］等病原菌的快速檢測技術(shù)研究，但對草莓炭疽病常見致病菌暹羅炭疽菌尚無相關(guān)報道。本研究將通過多重序列比對，分析暹羅炭疽菌與其他多種草莓植株中及植株周圍常見真菌的ITS序列，找出暹羅炭疽菌與其他真菌保守型較低的區(qū)域，設(shè)計可用于暹羅炭疽菌特異檢測的引物，實現(xiàn)草莓組織中暹羅炭疽菌的早期、快速及準(zhǔn)確檢測，從而為草莓炭疽病的及時有效防控提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗時間與地點

本試驗于2020年6月至2021年6月在江蘇省南京市完成。

1.2?供試菌株

本研究共采用3個暹羅炭疽菌菌株，和24個其他真菌菌株（表1），所有菌株均分離自南京不同草莓園的炭疽病病株及健株的植物組織或生長介質(zhì)（土壤或基質(zhì)）。植株組織中的真菌采用組織分離法獲得，土壤或基質(zhì)中的真菌采用稀釋平板法獲得［18］。所有菌株經(jīng)單孢純化后，保存于25%甘油中，存于江蘇丘陵地區(qū)南京農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所-80 ℃冰箱備用。所有暹羅炭疽菌菌株均采用活體（注射法和噴霧法）與離體的接種方法進(jìn)行過致病性鑒定［19］，確定可引起草莓炭疽病典型癥狀。

1.3?菌絲收集和DNA提取

將供試菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)數(shù)日，待菌絲長滿，收集300 mg新鮮菌絲，裝于2 mL離心管中，管中加入3～5顆鋼珠，然后放入Tissuelyser-L系列多樣品組織研磨儀中（上海靜信實業(yè)發(fā)展有限公司），50 Hz研磨30 s用于DNA提取?？侱NA的提取采用商業(yè)試劑盒，方法參考說明書。DNA的濃度及質(zhì)量，采用NanoDrop ND-1000超微量分光光度計（美國，Thermo Fisher科技公司）查驗。DNA保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.4?ITS片段擴(kuò)增、測序和引物設(shè)計

所有菌株的ITS片段用正向引物ITS5/ITS4進(jìn)行擴(kuò)增。由表2可知，擴(kuò)增體系50 μL，各成分終濃度分別為：1×Es Taq Master Mix（含染料；北京，康為世紀(jì)生物科技股份有限公司），50～100 ng DNA，引物各0.25 μmol/L 不足部分用ddH2O補(bǔ)足。用無菌水代替DNA模板作為陰性對照。反應(yīng)條件如下：96 ℃ 5 min；96 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；72 ℃ 8 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，使用0.8%質(zhì)量濃度的瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液為1×TAE，染料使用Sparkred思科捷生物技術(shù)有限公司），并用Tannon-1600全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）拍照。對有擴(kuò)增片段的PCR產(chǎn)物使用擴(kuò)增引物進(jìn)行雙向直接測序，測序工作委托擎科生物科技有限公司進(jìn)行。

將試驗中測得的暹羅炭疽菌與其他真菌的ITS序列，采用DNASTAR軟件包（DNASTAR，Inc.）中的EditSeq和SeqMan進(jìn)行多序列比對，分析暹羅炭疽菌與其他菌株ITS序列間同源性較低的區(qū)域，采用Primer Premier 5.0軟件（Premier Biosoft International）設(shè)計了一系列反向引物。

1.5?引物特異性的驗證

從草莓植株與生長介質(zhì)中分離到其他真菌被用于驗證針對暹羅炭疽菌的引物的特異性。正向引物為CgInt，反向引物為自行設(shè)計。為減少藥品用量，PCR反應(yīng)總體積改為10 μL，各成分終濃度及反應(yīng)條件同前述，DNA用量由2.5 μL改為0.5 μL。以無菌水代替DNA作為陰性對照。PCR擴(kuò)增結(jié)果通過電泳的方式呈現(xiàn)。

1.6?檢測限判定

用無菌水以10倍梯度將暹羅炭疽菌基因組DNA稀釋成一系列濃度梯度的溶液，共7個濃度，從10 ng/μL到10 fg/μL，然后進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)，陰性對照中采用無菌水代替DNA。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序與前述引物特異性驗證相同。進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)時，取0.5 μL前一輪擴(kuò)增產(chǎn)物代替DNA，用相同體系和程序進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。

1.7?人工接種樣本中暹羅炭疽菌檢測

采用從南京仙林分離到的1株暹羅炭疽菌菌株（T3-2）對健康草莓苗進(jìn)行人工接種。接種前將菌株接種在PDL液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5～7 d，待產(chǎn)生足夠多的分生孢子后，用3～4層紗布將菌絲過濾掉，留下孢子液，12 000 r/m離心2 min，棄上清，采用無菌水重懸浮，再離心，如此反復(fù)2～3次，統(tǒng)計最終得到的菌懸液的分生孢子濃度，然后配成5個濃度：5×105、1×105、1×104、1×103、1×102個孢子/mL。每個處理接種6株，重復(fù)3次。采用噴霧法接種，每株接種20 mL菌懸液，對照采用等量的無菌水，采用噴霧器接種，保證草莓地上各個部位均噴灑菌液或無菌水，隨后將植株放入加水20 mL的自封袋中置于28 ℃、光照—黑暗為 12 h—12 h的人工氣候箱中（RXZ-280B，寧波江南儀器廠，中國），密封24 h后打開自封袋［22］，并于接種 48 h 后取葉片提取總DNA（多糖多酚植物DNA提取試劑盒，上海浦迪生物科技有限公司），使用CgInt/CsiaR特異引物進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)檢測暹羅炭疽菌。PCR反應(yīng)同上，總體積10 μL，2輪PCR模板用量稍有不同。第一輪取4.5 μL DNA溶液，反應(yīng)前只需要檢測DNA的D260 nm/D280 nm比值即可，確保DNA質(zhì)量滿足試驗需求即可，無需稀釋；二次PCR時，僅取0.5 μL前一輪產(chǎn)物為模板。擴(kuò)增程序同前述。能擴(kuò)增至約400 bp單一片段的樣品視為陽性樣本。

1.8?田間樣本中暹羅炭疽菌檢測

隨機(jī)選擇田間自然發(fā)?。ň呖梢娞烤也〔“撸┡c無癥狀的草莓植株各15株，采集葉片，盡快帶回實驗室，將每份樣品分成2部分，一部分用于提取DNA進(jìn)行PCR檢測，一部分用于分離培養(yǎng)鑒定。用于PCR檢測的樣品提取總DNA后用引物CgInt/CsiaR對各樣品進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同前述人工接種樣本檢測。能擴(kuò)增至約 400 bp 單一目的片段的視為陽性樣本。用于分離培養(yǎng)的樣品，經(jīng)70%乙醇處理數(shù)秒，3% NaClO浸泡3 min，無菌水漂洗3～4次后切成3～5 mm的小塊，置于含有0.25 g/L氨芐青霉素和0.10 g/L鏈霉素的PDA平板上，5～7 d后根據(jù)菌落特征和分生孢子及菌絲形態(tài)進(jìn)行鑒定。

1.9?陽性樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序及分析

為確定在田間和人工接種的樣本中檢測到約400 bp的片段確實來自暹羅炭疽菌，對陽性樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，采用對PCR產(chǎn)物雙向直接測序的方式，測序引物為CgInt/CsiaR，得到的序列拼接后，在NCBI中進(jìn)行BLAST分析，以驗證PCR的特異性。

2?結(jié)果與分析

2.1?ITS序列擴(kuò)增與引物設(shè)計

利用引物ITS5/ITS4，獲得了草莓中的暹羅炭疽菌及24種草莓植株及根際介質(zhì)中常見真菌的ITS序列，對這些序列進(jìn)行多重比對后，發(fā)現(xiàn)暹羅炭疽菌ITS序列的355～494 bp堿基范圍內(nèi)的同源性與其他常見真菌較低，利用該區(qū)域設(shè)計了針對草莓中暹羅炭疽菌的反向特異引物。

2.2?引物的特異性

本研究利用3個暹羅炭疽菌菌株及草莓植株與生長介質(zhì)中分離到的其他24種真菌DNA進(jìn)行了引物特異性驗證。在設(shè)計的一些反向引物中，通過條帶亮度、引物二聚體形成情況及在非目的菌株中是否有條帶等最終選出引物CsiaR，該引物與前人發(fā)表的正向引物CgInt相結(jié)合的擴(kuò)增結(jié)果最理想。利用該引物組合，僅有當(dāng)DNA模板為暹羅炭疽菌時，才能擴(kuò)增出約400 bp的片段。由圖1可知，提示該引物組合針對暹羅炭疽菌具有較高的特異性 與其他真菌基因組無穩(wěn)定的結(jié)合位點，無法實現(xiàn)擴(kuò)增。

2.3?檢測限驗證

2輪PCR對暹羅炭疽菌純培養(yǎng)物提取的DNA最低檢測限結(jié)果見圖2。由圖2可知，第一輪PCR擴(kuò)增，最低檢測限為反應(yīng)體系中DNA濃度為 50 pg/μL（圖2-A）。進(jìn)行二次PCR后，檢測下限降低至反應(yīng)體系中DNA濃度僅有5 fg/μL也可觀察到條帶（圖2-B）。

2.4?人工接種樣品檢測

利用引物組合CgInt/CsiaR對人工接種不同濃度暹羅炭疽菌分生孢子懸浮液48 h后的草莓葉片進(jìn)行檢測，通過二次PCR，得到最低檢出限是1×104個孢子/mL，這一濃度下部分樣品可檢出暹羅炭疽菌，高于該濃度可100%檢出；低于該濃度，則無法檢出（圖3）。

2.5?田間樣品檢測

為驗證本方法對隨機(jī)采集的樣本的檢驗效果，從田間隨機(jī)選擇了30份草莓葉片，采用引物CgInt/CsiaR對其檢驗表明，當(dāng)用具炭疽病癥狀的草莓葉片中提取的DNA作為模板時，觀察到預(yù)期約400 bp的電泳條帶，部分無癥狀的樣品中也可觀察到同樣大小的條帶（圖4）。樣品分離培養(yǎng)的結(jié)果表明，所有具癥狀及部分無癥狀的草莓葉片組織邊緣有暹羅炭疽菌樣菌落形成，這些菌落初為灰白色，氣生菌絲蓬松、較致密，后顏色逐漸變成灰色，菌落背面灰黑色，5～7 d后形成橘色的分生孢子堆，在顯微鏡下觀察，絲狀菌絲具分隔、分枝，分生孢子橢圓形、透明單胞、兩端鈍圓、有些具明顯的油胞?？膳囵B(yǎng)出暹羅炭疽菌樣菌落的樣品與PCR檢測為陽性的樣品結(jié)果基本一致。

2.6?PCR產(chǎn)物測序

對人工接種和田間自然發(fā)病和無癥狀樣品中檢測出的陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果（圖5）表明，這3種樣品中檢測到的PCR產(chǎn)物與從暹羅炭疽菌純培養(yǎng)菌株中檢測到的PCR產(chǎn)物擁有相同序列，且與GenBank中的暹羅炭疽菌（登錄號LC684901.1）序列同源性達(dá)100%。因此，它們同為暹羅炭疽菌。

3?討論與結(jié)論

眾所周知，病害防治的基本原則是“預(yù)防為主，綜合防治”。癥狀一旦出現(xiàn)，病原菌已侵入植物組織內(nèi)部且大量繁殖，防治的難度和成本均大幅提高，并且往往收效甚微。在病害發(fā)生之前采取保護(hù)措施，可以起到最好的防治效果，既可有效防止病害蔓延，又可減少農(nóng)藥的用量。

草莓炭疽病的發(fā)生與傳播有幾個特點：第一，草莓炭疽病菌雖在全年各階段均可對草莓造成危害，但該病通常在育苗期（6—8月）和定植初期（8月底至9月）發(fā)病最重，而在其他季節(jié)一般均是零星發(fā)生，不會造成重大危害，生產(chǎn)上也不會重點防治。第二，草莓炭疽菌有潛伏侵染的特性。在不適宜該病發(fā)生的氣候與環(huán)境條件下，病原菌可形成無癥狀侵染，也就是病原菌可在植株上存活，但不會讓植株發(fā)病，當(dāng)條件適宜時，攜帶病菌的無癥狀組織可成為初感染源導(dǎo)致病害傳播。第三，草莓通常采用匍匐莖進(jìn)行無性繁殖，母苗的質(zhì)量會直接影響到子苗的質(zhì)量。綜上，根據(jù)炭疽病的傳播與發(fā)病特點，為炭疽病的提前防治提供了可爭取的時機(jī)?？梢栽诓葺绾投ㄖ驳膸讉€關(guān)鍵時期和環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)控，如母苗及育苗地帶菌情況檢測、定植前抽樣調(diào)查，可起到減少用藥和有效防控的效果。

在本研究中，開發(fā)了一種基于PCR的檢測草莓炭疽病致病菌暹羅炭疽菌的方法。該方法與傳統(tǒng)的組織分離法相比，具有快速、準(zhǔn)確、易于掌握的優(yōu)點，甚至可以在癥狀出現(xiàn)前的侵染早期監(jiān)測草莓組織中暹羅炭疽菌的攜帶情況。傳統(tǒng)的方法通常要經(jīng)過表面消毒、培養(yǎng)、鏡檢甚至是回接等流程，不僅費時、費力，且有很強(qiáng)的專業(yè)依賴性，要求操作者熟悉致病菌及常見真菌的培養(yǎng)形態(tài)與顯微特征，而炭疽菌的分生孢子通常要在培養(yǎng)5～7 d后才有可能形成產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子［23］，在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)有些菌株在固體培養(yǎng)基上基本不產(chǎn)孢，需要在液體培養(yǎng)基中經(jīng)過振蕩培養(yǎng)才能形成孢子，這無疑增加了鑒定的復(fù)雜程度及檢測周期。本方法只要掌握DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳等常規(guī)分子操作手段，無需操作者有分類學(xué)基礎(chǔ)，現(xiàn)在大部分科研機(jī)構(gòu)，只要可進(jìn)行常規(guī)分子檢測，均可在較短時間內(nèi)診斷出批量樣品中攜帶暹羅炭疽菌的情況。

這一技術(shù)的核心是引物特異性和檢出下限。為了得到針對草莓中暹羅炭疽菌的特異引物，用草莓植株及生長介質(zhì)中分離到的20余種真菌作為對照，之所以選擇這些菌株作為對照，是因為只有出現(xiàn)在草莓植株或生長介質(zhì)中的真菌才有可能出現(xiàn)在實際檢測樣品的總DNA中，成為得到正確檢測結(jié)果的干擾。通過分析它們與暹羅炭疽菌的ITS序列的差異位點，本研究設(shè)計了1條反向特異引物CsiaR，結(jié)果證明，將該引物與前人發(fā)表的針對膠孢炭疽病菌的正向引物CgInt相組合，可從草莓中特異地檢測到暹羅炭疽菌，且在草莓基因組DNA、其他對照菌株或無菌水中均不會擴(kuò)增出預(yù)期的約 400 bp 片段。為降低檢測下限，采取了2個設(shè)計：第一，將從草莓組織中得到的DNA原液不經(jīng)稀釋，直接用于PCR擴(kuò)增，在第一輪反應(yīng)體系中除了引物和DNA聚合酶，剩余部分全部用DNA溶液補(bǔ)足，這樣可以盡可能提高反應(yīng)體系中目的菌株的DNA含量；第二，用第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行二次PCR，實際證明檢出下限降低了99.99%，反應(yīng)體系中DNA濃度僅有5 fg/μL也可觀察到條帶，利用二次PCR提高目的片段的擴(kuò)增效率已在其他研究中被多次證實是有效的［24-26］。

雖然本研究在無癥狀的樣品中檢測到了目的片段，通過測序也確定屬于暹羅炭疽菌，但仍無法確定通過PCR沒有擴(kuò)增到預(yù)期的約400 bp DNA片段的樣品中是否無暹羅炭疽菌的存在。本研究對人工接種不同濃度暹羅炭疽菌分生孢子懸浮液的草莓苗進(jìn)行了后續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)濃度為1×104個/mL孢子是發(fā)病臨界值，在這一濃度，只有部分接種的植株表現(xiàn)較重的癥狀；當(dāng)高于這一濃度時，植株可以整體出現(xiàn)炭疽病典型癥狀，當(dāng)?shù)陀谶@濃度時，僅產(chǎn)生個別病斑甚至完全不表現(xiàn)癥狀，而且在生長一段時間后，病斑通常不會擴(kuò)大，這說明植株本身的免疫系統(tǒng)可抵抗較低濃度的病原菌入侵。本研究實際檢測結(jié)果是只有接種濃度高于1×104個/mL孢子的樣品，及部分接種了1×104個/mL孢子樣品中可得到陽性條帶。提示這套方法雖然不能在植株攜帶極少量病菌的情況下得到陽性結(jié)果，但檢測限與真菌致病濃度是有對應(yīng)關(guān)系的，可用于病害的早期預(yù)報。

總的來說，本研究中開發(fā)的基于PCR的方法較傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法更高效、準(zhǔn)確。該方法適用于檢測有、無癥狀草莓組織中的暹羅炭疽菌，以期對病害預(yù)測，深入了解病害流行，有助于制定有效的病害控制策略。

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