枸杞實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR內(nèi)參基因篩選與驗(yàn)證

李浩霞 黃穩(wěn)娥 柳西寧 朱馨蕾 任曉月 安巍 周軍 趙建華

摘要：以9種不同基因型枸杞的不同組織（莖、葉、花、果）和不同發(fā)育期（FS1～FS5）的果實(shí)為試材，選取Act-1/Act-3、Ef1a、Gapdh、H3b、Acx4、Pp2a、Rh37、Samc、Tub為候選內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)（RT-qPCR）檢測(cè)了9個(gè)候選基因在不同基因型枸杞的不同組織和不同發(fā)育階段果實(shí)中的表達(dá)水平。并采用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Ct、RefFinder分析方法，評(píng)估候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，并選擇Beat基因驗(yàn)證內(nèi)參基因。結(jié)果表明，Ef1a為不同基因型枸杞的不同組織和5個(gè)發(fā)育時(shí)期果實(shí)中表達(dá)較穩(wěn)定的內(nèi)參基因，Gapdh為表達(dá)最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因；在寧夏枸杞中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镽h37，其次為Ef1a。進(jìn)一步采用Beat基因?qū)Σ煌蛐丸坭降牟煌M織（莖、葉、花、果）和5個(gè)發(fā)育時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)模式進(jìn)行驗(yàn)證，表明Ef1a、Act-1基因可作為枸杞穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞：枸杞；內(nèi)參基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；定量分析

中圖分類號(hào)：S567.1+90.1??文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A??文章編號(hào)：1002-1302（2023）09-0041-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32060359）；寧夏自然科學(xué)創(chuàng)新群體基金（編號(hào)：2021AAC01001）；寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2021BEF02002）；寧夏經(jīng)濟(jì)林遺傳改良創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號(hào)：2022QCXTD04）。

作者簡(jiǎn)介：李浩霞（1977—），女，甘肅景泰人，副研究員，主要從事旱作農(nóng)業(yè)和栽培生理研究。E-mail：lihaoxia0943@163.com。

通信作者：趙建華，博士，副研究員，主要從事林木遺傳改良與功能基因組學(xué)研究。E-mail：zhaojianhua0943@163.com。

枸杞（Lycium）是茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium Linn.）多年生植物，具有抗旱、抗寒、耐鹽堿等特性，是改良土壤的先鋒樹(shù)種［1-3］。我國(guó)枸杞資源較為豐富。近年來(lái)，寧夏農(nóng)林科學(xué)院收集有國(guó)內(nèi)外枸杞屬10個(gè)種、3個(gè)變種以及特異性種質(zhì)資源 2 000 余份，活體保存20 000余株［4-5］。寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）是我國(guó)藥典收錄的唯一枸杞屬植物［6］。研究表明，枸杞多糖、甜菜堿、類胡蘿卜素、黃酮等是枸杞子中重要的功效物質(zhì)，具有促進(jìn)免疫、降低血糖、抗氧化、延緩衰老等生物活性［7-9］。近年來(lái)從枸杞子中分離鑒定出枸杞亞精胺A-O，是一種具有抗阿爾茨海默病、抗氧化、抗衰老和神經(jīng)保護(hù)作用的生物活性成分［10-12］。目前，枸杞的研究報(bào)道主要集中于栽培育種、資源化利用、營(yíng)養(yǎng)活性成分研究［13］、生理及藥理作用［7-9］和逆境條件下的響應(yīng)機(jī)制［14-15］等方面。在功能基因組層面上的研究較少，僅有少量枸杞基因功能和基因表達(dá)模式分析的報(bào)道。關(guān)于枸杞內(nèi)參基因篩選的報(bào)道的研究材料多用黑果和寧杞1號(hào)［16-18］。目前尚未見(jiàn)有關(guān)不同基因型枸杞內(nèi)參基因篩選的報(bào)道。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光作為熒光探針，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程熒光信號(hào)積累，并通過(guò)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本相對(duì)表達(dá)量的一種技術(shù)［19］。它具有靈敏度高、重復(fù)性好、可檢測(cè)大量樣本且比常規(guī)RT-PCR檢出率高等優(yōu)勢(shì)［20-21］，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)水平的分析。但在試驗(yàn)操作過(guò)程中，RNA的質(zhì)量和濃度、cDNA的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程、PCR的擴(kuò)增程序和條件等都會(huì)影響定量結(jié)果［22］。通常需要選取好的內(nèi)參基因，為目標(biāo)基因的表達(dá)量提供科學(xué)參照標(biāo)準(zhǔn)。在植物的RT-qPCR分析中，內(nèi)參基因包括肌動(dòng)蛋白基因Actin（Act-1/Act-3）、18S核糖（18S rRNA）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（Ef1a）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管和β微管蛋白基因（TUA、TUB）、 組蛋白H3b基因（H3b）、4-酰基輔酶A過(guò)氧化物酶基因（Acx4）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶基因（Pp2a）、DEAD-box RNA解旋酶基因（Rh37）、S-腺苷甲硫氨酸合酶基因（Samc）以及親環(huán)蛋白基因（CYP） 等［16-18，23］。在植物內(nèi)參基因的研究中，內(nèi)參基因在不同材料、組織、發(fā)育時(shí)期和試驗(yàn)條件下的表達(dá)穩(wěn)定性存在差異。在小麥中，內(nèi)參基因Ef1a表達(dá)穩(wěn)定性較好［24］。但在番茄的葉片和根組織中卻發(fā)現(xiàn)，Ef1a的表達(dá)量表現(xiàn)出高度的可變性［25］。趙藝蕊等以山核桃的不同組織及不同試驗(yàn)處理為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)山核桃不同組織和處理間的最適內(nèi)參基因存在差異［26］。張芷睿等利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)大豆不同發(fā)育時(shí)期的18個(gè)組織樣本進(jìn)行內(nèi)參基因研究，發(fā)現(xiàn)出苗期、第1張三葉期、始花期、初莢期的內(nèi)參基因各不相同［27］。周琳等在彩色馬蹄蓮的不同品種和組織中也發(fā)現(xiàn)最適內(nèi)參基因是不同的［28］。楊陽(yáng)等則發(fā)現(xiàn)，在不同發(fā)育階段和逆境條件下篩選出的多花黃精塊莖的適宜內(nèi)參基因存在差異［29］。因此，對(duì)于不同植物材料和組織，需根據(jù)具體的試驗(yàn)要求，對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性篩選和驗(yàn)證，以確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

本研究以9個(gè)不同基因型枸杞為試驗(yàn)材料，選取Act-1/Act-3、Ef1a、Gapdh、H3b、Acx4、Pp2a、Rh37、Samc、Tub共9個(gè)候選內(nèi)參基因，以枸杞的不同組織和果實(shí)的不同發(fā)育階段為測(cè)試樣本，分析這些基因的表達(dá)穩(wěn)定性，并通過(guò)分析影響枸杞花香主要物質(zhì)——乙酸芐酯合成的苯甲醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶（Acetyl-CoA：benzylalcohol acetyltransferase，BEAT）基因［30］的表達(dá)量，進(jìn)一步驗(yàn)證9個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?供試枸杞品種及信息?供試枸杞的品種為寧杞1號(hào)、寧杞7號(hào)、北方、寧夏黃果、黑果、中國(guó)、昌吉、蒙杞1號(hào)、白花，均來(lái)自寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞科學(xué)研究所國(guó)家枸杞種質(zhì)資源圃（38°380′N，106°9′E，海拔1 100 m），樹(shù)齡8年，于2021年6—7月盛果期，每個(gè)品種分別選取3棵無(wú)性植株的新枝莖（S）、葉片（L）、未開(kāi)放或剛開(kāi)放的花（F）及5個(gè)發(fā)育階段（FS1～FS5）的果實(shí)，采集樣品后速凍于－80 ℃的液氮中，材料信息詳見(jiàn)表1。果實(shí)5個(gè)發(fā)育階段分別為開(kāi)花后9～12 d（FS1）、14～19 d（FS2）、20～26 d（FS3）、30～37 d（FS4）、34～45 d（FS5）。

1.2.1?儀器設(shè)備與試劑?離心機(jī)，Centrifuge 5424，德國(guó)艾本德股份公司；熒光定量PCR儀，CFX96TM Real-Time System C1000 TouchTM Thermal Cycler，美國(guó) Bio-Rad 公司；超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，NanoPhotometer N60 Mobile，Implen公司； 超低溫冰箱，DW-HL340，中科美菱低溫科技股份有限公司；電泳儀，DYY-11型，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像儀，Gel DocxR+，美國(guó)Bio-Rad公司；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，50次，天根生化科技（北京）有限公司；乙醇，500 ml，徐州天鴻化工貿(mào)易有限公司；巰基乙醇，100 mL，上海士鋒生物科技有限公司；Prime-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （perfect real time）反轉(zhuǎn)錄試劑，100次，日本TaKaRa公司；2×Quanti Nova SYBR Green PCR Master Mix，2 500次，凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司；ddH2O，100 mL。

1.2?方法

1.2.1?枸杞總RNA提取及cDNA合成?采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒分別提取不同基因型枸杞莖、葉、花、果實(shí)的5個(gè)不同發(fā)育階段的RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA于 -20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?內(nèi)參基因的選擇及qRT-PCR引物設(shè)計(jì)?從枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選候選內(nèi)參基因（表2），用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)候選內(nèi)參基因的 qRT-PCR 引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，初步選出9個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因。其中Actin基因設(shè)計(jì)2對(duì)引物，在實(shí)時(shí)熒光定量中，通過(guò)熔解曲線判斷引物的特異性，若熔解曲線為單峰則說(shuō)明引物特異性好。通過(guò)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算各引物的擴(kuò)增效率（E）以及線性相關(guān)系數(shù)（r）。

1.2.3?qRT-PCR反應(yīng)條件?在CFX96TMReal-Time System C1000 TouchTM Thermal Cycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。RT-qPCR反應(yīng)體系（20 μL）：2×QuantiNova SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、cDNA 5 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)；最后 65 ℃ 開(kāi)始以0.5 ℃每步升溫至95 ℃。枸杞莖、葉、花、果實(shí)的5個(gè)發(fā)育時(shí)期，各設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4?引物特異性和擴(kuò)增效率分析?將等量混勻的所有組織樣品的cDNA原液稀釋10倍，共設(shè)置7個(gè)濃度梯度，即100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，測(cè)定RT-qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。程序運(yùn)行完成后計(jì)算擴(kuò)增效率（E）和線性相關(guān)系數(shù)r。取2 μL PCR產(chǎn)物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)合PCR反應(yīng)后的熔解曲線圖確定引物的特異性。

1.2.5?候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)?利用Microsoft Excel、Origin Pro 8.5軟件對(duì)獲得的原始CT值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與處理。使用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Microsoft Excel中的Delta CT方法評(píng)估9個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。geNorm算法確定每個(gè)基因的表達(dá)穩(wěn)定性值（M），具有較低M值的候選內(nèi)參基因具有更穩(wěn)定的表達(dá)［31］。NormFinder使用基于模型的方法來(lái)估計(jì)候選內(nèi)參基因表達(dá)的變化，為每個(gè)候選內(nèi)參基因分配一個(gè)穩(wěn)定性值，因此具有較低值的候選內(nèi)參基因更穩(wěn)定［32］。BestKeeper根據(jù)原始數(shù)據(jù)（CT值）計(jì)算候選內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），SD值越低被認(rèn)為越穩(wěn)定［33］。Delta-CT方法通過(guò)兩兩比較計(jì)算平均SD值；較低的SD值表示基因較穩(wěn)定［34］。最后，RefFinder是一種基于網(wǎng)絡(luò)的綜合算法，用于評(píng)估和篩選候選內(nèi)參基因，它集成了4個(gè)計(jì)算程序（geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta-CT）對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行排序?；诿總€(gè)項(xiàng)目的排名，它為單個(gè)基因分配適當(dāng)?shù)臋?quán)重，并計(jì)算其權(quán)重的幾何平均值，以進(jìn)行總體最終排名［35］。

1.2.6?選定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗(yàn)證?選擇Beat基因評(píng)估內(nèi)參基因。使用表2中的引物Beat-F、Beat-R 擴(kuò)增Beat基因全長(zhǎng)，克隆到pMD18-T載體（TaKaRa，D101A），測(cè)序，再確認(rèn)并提交給GenBank（OM275425）。在各種組織中測(cè)量基因表達(dá)，并通過(guò)最佳內(nèi)參基因（Ef1a、Act-1）和最不穩(wěn)定內(nèi)參基因（Acx4、Gapdh）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。qRT-PCR數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCT方法［36］。

2?結(jié)果與分析

2.1?總RNA質(zhì)量

提取不同基因型枸杞不同發(fā)育階段和不同組織（莖、葉、花、果）的RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，用超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度。各樣品RNA在28S、18S、5S處有單一且明亮清晰的條帶，可見(jiàn)RNA的完整性較好。超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示，各樣品RNA的D260 nm/280 nm為1.8～2.1，說(shuō)明各樣品RNA純度較高，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2?候選內(nèi)參基因引物特異性和擴(kuò)增效率分析

PCR檢測(cè)引物特異性，候選內(nèi)參基因均在90～250 bp擴(kuò)增出與預(yù)期一致的單一條帶。經(jīng)RT-qPCR檢測(cè)，候選內(nèi)參基因均能產(chǎn)生單一的熔解峰（圖1）。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率（E），各候選內(nèi)參基因的E在91.27%～103.85%之間，線性相關(guān)系數(shù)r＞0.99（表2）。結(jié)果表明所篩選的引物特異性及擴(kuò)增效率均良好，可進(jìn)行下一步的RT-qPCR試驗(yàn)。

2.3?候選內(nèi)參基因CT值分析

CT值是PCR擴(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增周期數(shù)［33］。CT值可反映候選內(nèi)參基因的表達(dá)豐度，CT值越小，基因表達(dá)豐度越高，反之亦然。從9個(gè)候選內(nèi)參基因在不同基因型枸杞的不同組織、不同發(fā)育階段、寧夏枸杞、非寧夏枸杞及總樣本中的CT值箱線圖（圖2）可知：Act-1、Ef1a、H3b、Tub的CT值較小，Gapdh-1、Acx4的CT值較大。從分布范圍上來(lái)看，Act-1、Ef1a、H3b、Tub分布較集中，Gapdh-1、Acx4分布較分散；從表達(dá)水平來(lái)看，Act-1、Ef1a、H3b、Tub的表達(dá)水平波動(dòng)范圍窄，Gapdh-1、Acx4波動(dòng)范圍寬。因此可初步判斷Act-1、Ef1a、H3b、Tub的表達(dá)水平較其他基因更穩(wěn)定，可作為候選內(nèi)參基因。

2.4?候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.4.1?比較Delta CT?Delta CT分析結(jié)果顯示，候選內(nèi)參基因在不同基因型枸杞不同組織（圖3-A）和不同發(fā)育階段（圖3-B）中表達(dá)穩(wěn)定的基因分別為Ef1a、Act-1，不穩(wěn)定的基因分別為Acx4、Gapdh。在寧夏枸杞中基因表達(dá)穩(wěn)定性有所不同，即Rh37最為穩(wěn)定，其次為Ef1a；Gapdh穩(wěn)定性最差（圖3-C）。在非寧夏枸杞中表達(dá)最穩(wěn)定的基因?yàn)镋f1a，其次為H3b；Acx4穩(wěn)定性最差，其次為Gapdh（圖3-D）。

2.4.2?geNorm分析?利用geNorm程序，計(jì)算基因的表達(dá)穩(wěn)定值（M），并依據(jù)M值對(duì)基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序，結(jié)果表明，各候選基因穩(wěn)定性在不同基因型枸杞的不同組織（圖3-E）、不同發(fā)育階段（圖3-F）以及寧夏、非寧夏枸杞（圖3-G、圖3-H）中，Ef1a基因表達(dá)穩(wěn)定性均表現(xiàn)最優(yōu)，而表達(dá)穩(wěn)定性最差的基因分別為Gapdh、Axc4。

2.4.3?NormFinder分析?NormFinder根據(jù)表達(dá)穩(wěn)定值（expression stability value，M）衡量基因表達(dá)穩(wěn)定性，M值越小，基因的表達(dá)穩(wěn)定性越好。NormFinder分析結(jié)果表明，各候選基因穩(wěn)定性在不同基因型枸杞的不同組織（圖3-I）、果實(shí)不同發(fā)育階段（圖3-J）以及非寧夏枸杞（圖3-K）中，表達(dá)穩(wěn)定性最好的基因分別為Ef1a、Act-1。表達(dá)穩(wěn)定性最差的基因分別為Gapdh、Axc4。而在寧夏枸杞中表達(dá)最穩(wěn)定的基因?yàn)镽h37，其次為H3b；Gapdh穩(wěn)定性最差（圖3-L）。

2.4.4?BestKeeper分析?采用BestKeeper軟件分析內(nèi)參基因CT的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），且SD值越小，內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性越好，結(jié)果見(jiàn)表3。不同基因型枸杞不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中，內(nèi)參基因Act-3、Gapdh-1、Acx4、Samc的SD值變動(dòng)大（SD＞1），而內(nèi)參基因Act-1、Ef1a、H3b、Pp2a、Rh37、Tub的SD值均小于1，且Rh37、Ef1a的SD值較小，說(shuō)明這2個(gè)基因的穩(wěn)定性較好。

2.4.5?RefFinder內(nèi)參基因穩(wěn)定性綜合排名分析?RefFinder分析結(jié)果如表4所示，對(duì)于不同基因型枸杞不同組織和非寧夏枸杞而言，Ef1a、Act-1的綜合排名為第一、第二。而在寧夏枸杞中，綜合排名第一的是Rh37，Ef1a次之，表明內(nèi)參基因Rh37、Ef1a對(duì)于寧夏枸杞而言是最合適的。在枸杞果實(shí)的不同發(fā)育階段，綜合排名第一的是Ef1a，Rh37次之。說(shuō)明對(duì)于不同基因型枸杞，枸杞的不同組織及枸杞果實(shí)的不同發(fā)育時(shí)期，穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因并不相同。

2.5?內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證

以Beat為目的基因，分別選取2個(gè)穩(wěn)定內(nèi)參基因Ef1a、Act-1，2個(gè)不穩(wěn)定的基因Acx4、Gapdh，進(jìn)行熒光定量試驗(yàn)。以Ef1a、Act-1作為內(nèi)參時(shí)，Beat基因在不同基因型枸杞不同組織中的表達(dá)量如圖4-A、B所示。Beat在枸杞的花和葉中表達(dá)量較高，在果實(shí)中的表達(dá)量最低，且在寧夏枸杞中的表達(dá)量顯著高于在非寧夏枸杞中的表達(dá)量，非寧夏枸杞樣品內(nèi)部之間也存在顯著差異（P<0.05）。以Acx4作為內(nèi)參時(shí)（圖4-C），寧夏枸杞和非寧夏枸杞之間仍然具有顯著性差異（P<0.05），但是非寧夏枸杞內(nèi)部中國(guó)、昌吉、黑果之間的差異未到達(dá)顯著水平。以Gapdh作為內(nèi)參時(shí)（圖4-D），寧夏枸杞花中表達(dá)量最高，但是非寧夏枸杞組織中的表達(dá)變化趨勢(shì)變化不一，且發(fā)現(xiàn)寧夏枸杞和非寧夏枸杞之間沒(méi)達(dá)到顯著差異。

以Ef1a、Act-1作為內(nèi)參時(shí)，計(jì)算Beat基因在不同基因型枸杞不同發(fā)育階段的表達(dá)量。Beat基因在不同發(fā)育階段表達(dá)變化模式較為相似（圖5-A、圖5-B）， 在FS1中表達(dá)呈最高，F(xiàn)S2表達(dá)量相對(duì)較低，F(xiàn)S3～FS5之間表達(dá)量沒(méi)有明顯差異且表達(dá)量最低，不同基因型枸杞間在相同發(fā)育階段內(nèi)存在明顯差異。當(dāng)以Acx4作為內(nèi)參時(shí)（圖5-C），不同發(fā)育階段表達(dá)變化模式不同于穩(wěn)定性較高的Ef1a、Act-1 作為內(nèi)參的表達(dá)量，材料間差異性明顯降低。當(dāng)以Gapdh作為內(nèi)參時(shí)（圖5-D），不同發(fā)育階段的差異顯著水平同樣也降低，且在FS3～FS5階段，寧夏枸杞的表達(dá)量明顯低于非寧夏枸杞的表達(dá)量?？梢?jiàn)，以穩(wěn)定性較高的基因作內(nèi)參基因，目的基因變化趨勢(shì)基本一致或偏差較小；反之，以穩(wěn)定性較低的基因作內(nèi)參基因，會(huì)造成目的基因表達(dá)水平存在較大差異或偏差。進(jìn)一步驗(yàn)證了篩選出的Ef1a、Act-1基因作為內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

3?結(jié)果與討論

隨著RT-qPCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性已成為定量試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵影響因子［31，37］，選擇合適的內(nèi)參基因來(lái)減少RT-qPCR試驗(yàn)中誤差造成的影響是非常有必要的。內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)常用的軟件有g(shù)eNorm、NormFinder、BestKeeper、RefFinder綜合分析等［38-39］，能夠快速系統(tǒng)地分析評(píng)價(jià)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

本研究對(duì)比分析了Act、Ef1a、Gapdh、H3b、Acx4、Pp2a、Rh37、Samc、Tub等9個(gè)常用的內(nèi)參基因在不同基因型枸杞不同發(fā)育階段、不同組織中的表達(dá)水平。其中Act基因使用了2種不同的熒光定量引物。事實(shí)上，筆者所在課題組參考已發(fā)表枸杞內(nèi)參基因文獻(xiàn)［16-18］設(shè)計(jì)了所有的可用內(nèi)參基因引物作為候選，但并非所有內(nèi)參基因在不同基因型枸杞的不同組織部位中均能獲得比較好的擴(kuò)增條帶，最終只選取了本研究所述的10對(duì)引物進(jìn)行候選基因的擴(kuò)增。另外，使用Wang等設(shè)計(jì)的HSP80引物［17］擴(kuò)增后，擴(kuò)增序列比對(duì)結(jié)果為Acx4，因此筆者所在課題組對(duì)其引物及PCR產(chǎn)物進(jìn)行了重新命名。

本研究以9個(gè)不同基因型的枸杞果實(shí)不同發(fā)育階段和不同組織為材料，選用9個(gè)候選內(nèi)參基因，利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、RefFinder 軟件分析這9個(gè)基因在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定性。利用上述4種軟件篩選出枸杞植物中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因Ef1a、Act-1，不穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因Gapdh、Acx4。肌動(dòng)蛋白Actin是高度保守的蛋白質(zhì)，參與各種類型的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，并在所有真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在細(xì)胞形態(tài)建成、生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用［40］。Actin基因在綠豆的不同品種和部位中是最合適的內(nèi)參基因之一［32］，在顯齒蛇葡萄的不同組織中表達(dá)穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因也是Actin［41］，這與本研究的結(jié)果一致。Ef1a在蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中促進(jìn)氨基?；鵷RNA與核糖體A位點(diǎn)的GTP依賴性結(jié)合。Gapdh參與光合還原戊糖磷酸途徑（Calvin-Benson循環(huán)），催化NADPH還原 1，3-二磷酸甘油酯［33］。Ef1a基因在花椰菜的不同組織處理下表達(dá)最為穩(wěn)定，Ef1a基因在甜瓜不同組織器官及不同脅迫條件下均可穩(wěn)定表達(dá)，也是較為合適的內(nèi)參基因［42］，這也與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。齊香玉等以茉莉花的5種組織和4個(gè)發(fā)育階段的花為試驗(yàn)材料，選擇較常見(jiàn)的8個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行引物特異性分析，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育期花的最適內(nèi)參基因?yàn)锳ctin、Ef1α［43］，這與本研究結(jié)果相同。此外，本研究發(fā)現(xiàn)針對(duì)所有樣本最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是Ef1a、Act-1；但是單獨(dú)對(duì)寧夏枸杞內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行分析時(shí)，得到最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镽h37，其次為Ef1a。這就說(shuō)明對(duì)于不同基因型枸杞，內(nèi)參基因表達(dá)也有一定的差異。

雖然利用基因穩(wěn)定性分析軟件篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，但不能確保所篩選出的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，還需利用目的基因?qū)?nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，才能得出可靠的試驗(yàn)結(jié)果。因此，通過(guò)Beat目的基因進(jìn)一步驗(yàn)證了基因的穩(wěn)定性。

本研究結(jié)果還表明，內(nèi)參基因的選擇會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)論。選擇不適合的內(nèi)參基因可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果，最終導(dǎo)致錯(cuò)誤的目的基因表達(dá)模式。當(dāng)選取穩(wěn)定或不穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，Beat基因在各種組織中表現(xiàn)出不一致的表達(dá)模式。綜上所述，本研究擬為不同基因型枸杞中基因表達(dá)的定量分析提供穩(wěn)定的內(nèi)參基因，擬為不同基因型枸杞功能基因組學(xué)的研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

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