TLR4/MyD88非依賴信號通路在強(qiáng)直性脊柱炎患者中的表達(dá)及臨床意義

楊大偉,臧歡歡,楊慧敏,孫 旭,李 瑩,袁伶俐

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,安徽 蚌埠 233000;2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科,安徽 蚌埠 233004;3.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院骨科,安徽 蚌埠 233000)

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種慢性自身炎癥性疾病,以中軸關(guān)節(jié)受累為主,主要累及骶髂關(guān)節(jié)、脊柱骨樣突、脊柱旁軟組織等,也可伴有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)(如葡萄膜炎或虹膜炎),嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生脊柱畸形和關(guān)節(jié)強(qiáng)直[1-2],對患者生活質(zhì)量造成很大影響。但AS的病因和發(fā)病機(jī)制目前仍不十分明確。有研究表明,γ-干擾素(IFN-γ)與多種自身炎癥和免疫疾病相關(guān),如免疫球蛋白A腎病、多發(fā)性硬化癥等[3-4]。也有研究表明,在中國漢族人群中IFN-γrs2069727基因多態(tài)性與AS起病顯著相關(guān)[5]。袁躍興等[6]發(fā)現(xiàn),AS患者血清IFN-γ表達(dá)水平顯著升高,且與C 反應(yīng)蛋白(CRP)呈正相關(guān)。提示IFN-γ可能作為致炎因子參與了AS的起病及病情活動。而IFN-γ為細(xì)胞Toll樣受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(MyD88)非依賴信號通路重要的末端炎癥因子[7],提示TLR4/MyD88非依賴信號通路也可能參與了AS的發(fā)生。本研究通過檢測AS患者血清及滑膜組織TLR4/MyD88非依賴信號通路中重要上游節(jié)點(diǎn)分子——TLR4、Toll樣受體相關(guān)分子(TRAM)、TIR域含適配器誘導(dǎo)β-干擾素(TRIF)、核因子-κB(NF-κB)及末端炎癥因子——IFN-γ的表達(dá),探討了TLR4/MyD88非依賴信號通路在AS起病及病情活動中所起的作用,旨在為治療AS提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 (1)試驗(yàn)1:選取2019年1月至2021年12月在蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的AS患者46 例作為AS組,其中男31 例,女15例;年齡15～61歲,平均(37.50±11.19)歲;平均身高(169.76±5.59)cm;平均體重指數(shù)(23.06±2.35)kg/m2。選取同期健康體檢者30例為健康對照組,其中男25例,女5例;年齡27～57 歲,平均(38.90±7.70)歲;平均身高(171.43±5.37)cm;平均體重指數(shù)(23.85±1.57)kg/m2。2組研究對象性別、年齡、身高、體重指數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(2)試驗(yàn)2:選取13例行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)AS患者滑膜組織作為AS手術(shù)組,其中男9例,女4例;年齡36～56歲,平均(47.53±7.16)歲;平均身高(169.15±5.79)cm,平均體重指數(shù)(23.85±1.83)kg/m2。選取10例同期髖關(guān)節(jié)創(chuàng)傷性骨折患者滑膜組織作為對照組,其中男7例,女3例;年齡28～56歲,平均(42.0±8.79);平均身高(168.8±4.59)cm;平均體重指數(shù)(24.22±1.85)kg/m2。2組患者性別、年齡、身高、體重指數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AS手術(shù)組及對照組滑膜組織均為患者手術(shù)時(shí)取得。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批(倫理編號:蚌埠醫(yī)學(xué)院倫科批字[2021]第247號)。樣本收集均取得研究對象知情同意,均簽署本研究知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清紅細(xì)胞沉降率(ESR)、CRP、 IFN-γ檢測 ESR、CRP均于蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科完成檢測。IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司(貨號:ZK-H1171),嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2AS病情活動度評分(ASDAS)-CRP 采取ASDAS-CRP評價(jià)AS疾病活動度。ASDAS-CRP=0.12×腰背痛+0.06×晨僵持續(xù)時(shí)間+0.1×患者總體評價(jià)+0.07×外周關(guān)節(jié)疼痛/腫脹+0.58×Ln(CRP+1)。腰背痛、晨僵持續(xù)時(shí)間、患者總體評價(jià)、外周關(guān)節(jié)疼痛/腫脹均采用疼痛視覺模擬疼痛量表進(jìn)行評價(jià),0分為不存在不適感,10分為嚴(yán)重不適。ASDAS作為新型AS疾病活動度指標(biāo)由國際脊柱關(guān)節(jié)炎評價(jià)工作組于2009年首先提出[8]。

1.2.3TLR4 /MyD88非依賴信號通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平測定 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法測定TLR4/MyD88非依賴信號通路相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平。嚴(yán)格按RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用TP800 PCR擴(kuò)增儀按實(shí)時(shí)熒光定量PCR說明書采用探針法對cDNA進(jìn)行PCR檢測、擴(kuò)增,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,以95 ℃預(yù)變性30 s,然后進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增,95 ℃變性5 s,60 ℃退火加延伸30 s,共40個(gè)循環(huán),反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。RNA抽提試劑盒(Code No.9767)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Code No.RR036A)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒(Code No.RR391A)、熒光定量PCR擴(kuò)增儀(TP800)均購自日本TaKaRa公司,TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ、內(nèi)參GAPDH引物均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成。采用2-ΔΔCt法分析目的基因的相對表達(dá)水平。各信號分子引物見表1。

表1 各信號分子引物

2 結(jié) 果

2.12組研究對象血清ESR、CRP、IFN-γ水平比較 AS組患者血清ESR、CRP、IFN-γ水平均明顯高于健康對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組研究對象血清ESR、CRP、IFN-γ水平比較

2.2AS患者血清IFN-γ水平與CRP、ESR、ASDAS-CRP 的相關(guān)性 AS患者血清IFN-γ水平與ESR、CRP、ASDAS-CRP水平均呈正相關(guān)(r=0.762、0.776、0.405,P<0.001、<0.001、0.005)。

2.32組患者滑膜組織TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ mRNA表達(dá)水平比較 與對照組滑膜組織比較,AS手術(shù)組患者滑膜組織TLR4/MyD88非依賴信號通路重要節(jié)點(diǎn)分子——TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ mRNA 表達(dá)水平均明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

3 討 論

TLR4是膜蛋白家族中的一員,可識別不同病原體的病原相關(guān)分子模式(包括格蘭陰性菌脂多糖、熱休克蛋白、磷壁酸等),激活體內(nèi)胞內(nèi)信號通路,并誘發(fā)免疫相關(guān)基因和促炎基因的表達(dá),引起炎性反應(yīng)。根據(jù)是否需要MyD88分子介導(dǎo)分為MyD88依賴和MyD88非依賴兩種信號通路。TLR4經(jīng)MyD88依賴通路誘發(fā)腫瘤壞死因子-α的釋放,引起早期炎性反應(yīng),而經(jīng)Myd88非依賴通路則激活晚期NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF-3)的轉(zhuǎn)錄。有研究表明,TRAM特異性介導(dǎo)了TLR4/MyD88非依賴信號通路,是激活TRIF,活化IRF3、NF-κB信號蛋白必不可少的重要銜接分子,而對TLRs中的其他受體無作用[9]。NF-κB是調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、惡性轉(zhuǎn)化及浸潤的重要的核轉(zhuǎn)錄因子,當(dāng)細(xì)胞受到炎性細(xì)胞因子刺激后激活κB抑制因子激酶(IKK)復(fù)合體等特定的蛋白激酶,κB抑制因子磷酸化、泛素化后立即被蛋白酶體降解,導(dǎo)致NF-κB釋放,核易位進(jìn)入細(xì)胞核,啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[10]。在TLR4/MyD88非依賴信號通路中TLR4通過TRAM激活TRIF,TRIF與接頭蛋白募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6綁定,使下游TRNK結(jié)合激酶1分子磷酸化,TRNK結(jié)合激酶1緊接著激活絲裂原激活的蛋白激酶和NF-κB,而NF-κB 可激活I(lǐng)RF3[7,9,11],釋放大量IFN-γ,而IFN-γ作為TLR4/MyD88非依賴信號通路重要的末端炎癥因子具有多種生物學(xué)作用:(1)可激活巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等一系列具有免疫活性的細(xì)胞,并促進(jìn)其功能。(2)也可促進(jìn)包括抗原呈遞細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子和Ⅱ類分子[12]。(3)促進(jìn)輔助性T淋巴細(xì)胞0分化為輔助性T淋巴細(xì)胞1,并抑止輔助性T淋巴細(xì)胞2增殖。(4)促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞成熟及活化。(5)促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化,產(chǎn)生抗體及免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)化;此外,其還可通過上調(diào)某些趨化因子和自身受體的表達(dá),降低上皮細(xì)胞屏障功能,促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移,引發(fā)炎性反應(yīng)[13]。

欽丹萍等[14]研究表明,在三硝基苯磺酸/乙醇聯(lián)合灌腸的方法建立三硝基苯磺酸 /乙醇潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的腸黏膜中TLR4 /MyD88非依賴信號通路相關(guān)分子——TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB、IFN-γ無論在mRNA 還是蛋白表達(dá)水平均明顯高于健康對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示MyD88非依賴信號通路參與了潰瘍性結(jié)腸炎大鼠炎癥活動的調(diào)控。同時(shí),也有研究表明,IFN-γ在炎癥性腸病患者腸黏膜上的表達(dá)也明顯增加[15]。DOLHAIN等[16]發(fā)現(xiàn),類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者血清及滑膜組織IFN-γ水平明顯高于骨性關(guān)節(jié)炎患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MANOURY-SCHWARTZ等[17]對RA小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),IFN-γ可損傷關(guān)節(jié),引起關(guān)節(jié)炎癥,RA小鼠注射IFN-γ單抗后不僅能減輕關(guān)節(jié)炎程度,還能降低關(guān)節(jié)炎發(fā)生率。付曉敏等[18]應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對AS 患者滑膜組織TLR4及其信號通路中主要分子,如MyD88、NF-κB-p65 進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),AS患者滑膜組織TLR4、NF-κB-p65表達(dá)陽性,MyD88表達(dá)陰性,提示經(jīng)由TLR4/MyD88非依賴信號通路引起免疫炎性反應(yīng),從而參與了AS發(fā)病及病情活動。

本研究結(jié)果顯示,AS患者血清IFN-γ水平明顯高于健康對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且IFN-γ與CRP、ASDAS-CRP均呈正相關(guān),提示IFN-γ可能作為促炎性細(xì)胞因子參與了AS發(fā)病及病情活動。本研究進(jìn)一步對AS患者滑膜組織TLR4/MyD88非依賴信號通路中的重要上游節(jié)點(diǎn)分子——TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65及末端炎癥因子——IFN-γ檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,AS手術(shù)組患者滑膜組織TLR4、TRAM、TRIF、NF-κB-p65、IFN-γ mRNA表達(dá)水平均明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述,TLR4/MyD88非依賴信號通路可能在AS起病及病情活動中起到重要作用。后期將進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)及Western blot等方法檢測AS患者治療前后TLR4/MyD88非依賴信號通路相關(guān)分子表達(dá)情況,為TLR4/MyD88非依賴信號通路參與AS起病及病情活動提供更充分的證據(jù),從而為治療AS提供新思路。