基于基因測(cè)序的有氧運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)CUMS抑郁小鼠作用機(jī)制研究

屈紅林，劉瑞蓮，陳嘉勤，陳 銳

高通量測(cè)序即二代測(cè)序，該技術(shù)可一次性對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA 分子進(jìn)行序列測(cè)定，已經(jīng)成為當(dāng)前科學(xué)研究的重要手段[1]。目前使用最廣、效果最好的是二代測(cè)序方法，即高通量測(cè)序技術(shù)。二代測(cè)序技術(shù)以極低的單堿基測(cè)序成本、超高的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量，避免繁瑣的克隆技術(shù)，具有較高的可靠性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)[2]。二代測(cè)序技術(shù)在全基因重測(cè)序、表達(dá)譜分析、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、SNP 分析、DNA甲基化、mi-croRNA、MBD、Seq、ChIP-Seq等研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。通過(guò)對(duì)比CUMS 抑郁造模小鼠與有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)抑郁小鼠血液和海馬組織進(jìn)行高通量測(cè)序，分析2 種組織中差異表達(dá)基因的異同，為臨床血液檢測(cè)提供借鑒。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與處理

實(shí)驗(yàn)選用健康雄性 C57BL/6 小鼠 42 只，8 周齡，SPF 級(jí)，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（SCXK湘2016-0002）。標(biāo)準(zhǔn)B 級(jí)齒啃類(lèi)動(dòng)物干 燥 飼料 喂 養(yǎng) ，維 持 飼 料 合 格 證 號(hào) ：NO. 43200600003 951，許 可 證 號(hào) SCXK（湘）2014-0002，自由飲食，分籠飼養(yǎng)，6 只/籠，室溫（25±1）℃，濕度（50±10）%，自然晝夜節(jié)律光照。在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周后，隨機(jī)數(shù)字法分為空白對(duì)照組（CG）12 只、造模組（MG）15只、模型運(yùn)動(dòng)組（ME）15 只。

1.2 研究方法

1.2.1 CUMS抑郁小鼠造模及樣本處理 對(duì)13 種應(yīng)激刺激因子采用在線(xiàn)隨機(jī)數(shù)字生成器方法，總造模時(shí)間28 天（4 周），按照隨機(jī)數(shù)的數(shù)目為28，最小值為1，最大值為13，選擇隨機(jī)數(shù)的性質(zhì)為隨機(jī)，生成隨機(jī)數(shù)[3]。同樣方法生成2 次，將2 次配對(duì)組合，并適當(dāng)調(diào)整重復(fù)和相鄰重復(fù)的隨機(jī)數(shù)字，最終確定刺激的具體方案。13 個(gè)應(yīng)激因子分別為晝夜調(diào)整、光照性質(zhì)、禁食、禁水、傾斜45℃鼠籠、潮濕墊料、4℃冰水游泳、45℃高溫游泳、水平震蕩、輕夾鼠尾、束縛、白噪音和間斷（閃光）刺激。

所有小鼠禁食過(guò)夜，次日以 1% 戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，隨機(jī)選取6 只進(jìn)行開(kāi)胸自心臟提取新鮮血液，迅速采取Trizol 法提取總RNA，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｌ幩篮蟮男∈笥诒蟿冸x頭部皮膚，暴露顱骨，眼科鑷自枕骨大孔輕輕撬開(kāi)顱骨，充分暴露腦組織，小心剝離大腦左右皮層后，暴露整個(gè)海馬組織，玻璃分針剝離海馬組織與大腦皮層及周?chē)X組織，取出海馬，冰磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS）液沖洗，濾紙吸掉多余水分，稱(chēng)重后于Trizol 試劑中-80℃凍存?zhèn)溆?。在剩余小鼠中再隨機(jī)選取6 只進(jìn)行腦在體固定，冰上取腦后于4%多聚甲醛固定48 h 以上，石蠟包埋。

1.2.2 中等強(qiáng)度有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)方案 模型運(yùn)動(dòng)組小鼠參考Bedford 訓(xùn)練方案進(jìn)行改進(jìn)，即在造模成功后按照10 m/min、0°坡度，由第1 天的10 min，每天遞增10 min，共計(jì)6 天后，開(kāi)始正式訓(xùn)練，以10 m/min，0°坡度，60 min/天，6 天/周，連續(xù)訓(xùn)練8 周。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)間均安排在上午9:00-11:30 進(jìn)行。訓(xùn)練期間無(wú)小鼠死亡。

1.2.3 造模與干預(yù)效果評(píng)定 （ 1）神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定。最后一次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練結(jié)束當(dāng)天，每組隨機(jī)數(shù)字法選取10只小鼠進(jìn)行糖水偏好試驗(yàn)和強(qiáng)迫懸尾測(cè)定，用于評(píng)價(jià)小鼠快感缺失和絕望行為的程度。（2）小鼠海馬組織Nissl 染色。石蠟包埋組織進(jìn)行全自動(dòng)切片機(jī)切片，厚度為5 μm，嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行海馬組織Nissl染色，每只染色片在電鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野觀察拍照，觀察細(xì)胞形態(tài)，用Image-Pro Plus6.0 軟件分析尼氏體累積光密度值。

1.2.4 總RNA提取 （ 1）血液總RNA 提取?？鼓茏孕呐K提取新鮮血液后，輕輕顛倒8～10 次，按照1:1加入PBS 液稀釋后，再取新的離心管按照稀釋后的溶液1:1 加入白細(xì)胞分離液液面，低速離心20 min。離心后，待吸管小心吸出棄去分離液上層約0.5 cm上清液后，再小心吸取分離液層，即白細(xì)胞層，置于另一新離心管中，加入 2 mLPBS 洗滌液，混勻后室溫 2 000 rpm 離心 10 min，棄上清，加入 1 mLPBS液，移入 EP 管，混勻、室溫4 000 rpm 離心5 min，得沉淀。移液器去除上清液，留下完整管底白細(xì)胞團(tuán)，渦旋或輕彈管壁將白細(xì)胞沉淀完全松散重懸，加入1 mLTrizol至沉淀中，吹打及震蕩管壁，直至沉淀明顯溶解。滴加200 μL 氯仿，震蕩15 s，室溫靜置5 min，4℃12 000 rpm 離心15 min，吸取上層水相移入新的EP 管。加入預(yù)冷的異丙醇 0.5 mL 沉淀總 RNA，震蕩混勻，室溫或-20℃靜置10 min（最好過(guò)夜）。4℃12 000 rpm 離心 15 min 后棄上清。滴加 75% 乙醇（DEPC 處理）1 mL 洗滌1～2 次。4℃ 12 000 rpm離心10 min 后，棄上清液保留沉淀物，倒置于干凈的吸水紙上，空氣自然干燥 10 min。加入20～40μL RNase-free 處理水溶解RNA。

（2）海馬組織總RNA 提取。取出已加入Trizol 試劑的海馬組織，于預(yù)先制冷的電動(dòng)勻漿器冰上勻漿，充分裂解。室溫靜置10 min 后，滴加1/5 體積的氯仿，快速震蕩15 s 后4 ℃12 000 g15 min 離心。將上清層移至新的EP 管滴加1/2 體積異丙醇，充分混勻靜置5min 后4 ℃12 000 g15 min 離心，棄上清，再滴加1 mL75%乙醇，快速震蕩15 s，4 ℃7 500 g5 min離心，棄上清。自然干燥RNA沉 淀 ，加入去RNase水溶解RNA，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

（3）總RNA濃度/純度測(cè)定。每樣取2 μL，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD值，計(jì)算OD260/OD280 的比值，比值位于1.8～2.0 之間，表明樣品純度較高，無(wú)其他雜質(zhì)污染。電泳檢測(cè)：1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。

1.2.5 mRNA 測(cè)序文庫(kù)建立與測(cè)序 所有測(cè)序樣本從超低溫冰箱取出后，為防止樣本反復(fù)凍融，用裝有5～10 kg 干冰的泡沫盒密封運(yùn)送至北京諾禾致源科技股份有限公司，進(jìn)行測(cè)序。用帶有 Oligo（dT）的磁珠通過(guò) A-T 互補(bǔ)配對(duì)、mRNA 的ploy A 尾結(jié)合的方式對(duì)檢驗(yàn)合格的樣品進(jìn)行富集[4]。

1.2.6 差異基因篩選 按照有氧運(yùn)動(dòng)組和模型組基因差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）進(jìn)行篩選，選擇標(biāo)準(zhǔn)為log2（FC）≥1 或log2（FC）≤-1。

（1）GO（Gene Ontology）分析。GO 分為細(xì)胞組成（Cellular Component，CC）、生物過(guò)程（Biological Process，BP）和 分 子 功 能（MolecularFunction，MF）3 部分。按照超幾何分布原理，計(jì)算挑選出的差異基因同GO 分類(lèi)中某幾個(gè)特定分支的超幾何分布關(guān)系，通過(guò)假設(shè)驗(yàn)證得出特定P值，判斷其是否在該GO 中富集[5]。

（2）KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge-nomes）分析。通過(guò)Pathway 將生物體內(nèi)不同基因相互協(xié)調(diào)發(fā)揮其生物學(xué)功能進(jìn)行顯富集分析，可確定差異表達(dá)基因參與最主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或生化代謝途徑。Pathway 應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，以KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中Pathway 為單位，找出整個(gè)基因組差異表達(dá)基因中顯著富集的Pathway[6]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 CUMS抑郁造模與運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果

2.1.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)定 從檢測(cè)結(jié)果看，造模后的MG小鼠比CG 組呈現(xiàn)十分顯著性降低（P＜0.001），但隨著運(yùn)動(dòng)的實(shí)施，ME 組小鼠糖水偏好指數(shù)有較大幅度回升，提示有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可使抑郁小鼠快感缺失的癥狀得以逆轉(zhuǎn)。強(qiáng)迫懸尾不動(dòng)時(shí)間檢測(cè)結(jié)果也驗(yàn)證糖水偏好試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果。ME 組小鼠強(qiáng)迫懸尾不動(dòng)時(shí)間比CG 組低，提示有氧運(yùn)動(dòng)能有效減輕抑郁小鼠的絕望行為，這在前期研究成果中也得以驗(yàn)證[7]。

2.1.2 Nissl染色 海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞尼氏體染色結(jié)果顯示，MG 組染色變淺，神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)減少，出現(xiàn)明顯的尼氏體核固縮，嚴(yán)重的還呈現(xiàn)明顯的空泡樣病變，尼氏體累積光密度值明顯降低（P＜0.05）。與MG 組相比，ME 組神經(jīng)細(xì)胞核固縮現(xiàn)象減少，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目增多，染色清晰，分布趨于均勻，尼氏體累積光密度值明顯增加（P＜0.05），提示有氧運(yùn)動(dòng)能有效減輕抑郁小鼠的絕望行為，呈現(xiàn)較好的細(xì)胞修復(fù)現(xiàn)象。

2.2 高通量測(cè)序結(jié)果的處理與分析

2.2.1 Total RNA的檢測(cè)結(jié)果 經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳純度檢測(cè)[8]，顯示所有樣本均包括28S、18S 和5S條帶，其中28S 和18S 條帶清晰，28S 條帶的亮度較18S 條帶明顯，提示 TotalRNA 完整性較好，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

2.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量結(jié)果 6 個(gè)樣本的測(cè)序結(jié)果通過(guò)過(guò)濾后分別得到 8.28G、8.04G、8.11G、9.15G、9.83G 和7.38G 高 質(zhì) 量 序 列（Clean reads），且測(cè)序錯(cuò)誤率 均 低 于 0.03%，堿 基 質(zhì) 量 值Q20 ≥96.97%，Q30 ≥92.28%，完全符合預(yù)定測(cè)序要求，均可用于進(jìn)一步分析（見(jiàn)表1）。

表1 各組小鼠血液與海馬組織測(cè)序結(jié)果匯總Table 1 Summary of Sequencing Results of Blood and Hippocampus of Mice in Each Group

2.2.3 測(cè)序錯(cuò)誤率分布檢測(cè)結(jié)果 由測(cè)序Phred 數(shù)值通過(guò)公式（Qphred=-10log 10（ e））轉(zhuǎn)化獲取每個(gè)堿基測(cè)序錯(cuò)誤率。結(jié)果顯示，Phred 數(shù)值通過(guò)概率模型計(jì)算堿基識(shí)別（Base Calling）過(guò)程中獲取的單堿基錯(cuò)誤率分布結(jié)果符合樣品測(cè)序要求。

2.2.4 A/T/G/C含量分布檢測(cè)結(jié)果 檢查結(jié)果顯示，Illu-mina 測(cè)序中，反轉(zhuǎn)錄成cDNA 時(shí)6bp 的隨機(jī)引物會(huì)引起前幾個(gè)位置核苷酸組成出現(xiàn)一定偏好性，影響轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的均一程度[9]。理論上，普通文庫(kù)中A 和T 堿基及G 和C 堿基含量在每個(gè)測(cè)序循環(huán)上應(yīng)分別對(duì)等，整個(gè)測(cè)序過(guò)程基本穩(wěn)定不變，但對(duì)于鏈特異性建庫(kù)則會(huì)出現(xiàn)GC分離現(xiàn)象[10]。本實(shí)驗(yàn)樣本檢查結(jié)果顯示，因隨機(jī)引物擴(kuò)增偏差導(dǎo)致Illumina測(cè)序的每個(gè)read前6~7 個(gè)堿基出現(xiàn)較大波動(dòng)，但不影響后續(xù)定量分析。

2.2.5 差異表達(dá)基因篩選 為探究不同組別的不同樣本轉(zhuǎn)錄組間的差異，針對(duì)不同組別小鼠血液與海馬組織間的差異表達(dá)基因篩選閾值按照P＜0.05，|log2（Fold Change）|＞1 為 標(biāo) 準(zhǔn) 進(jìn) 行 篩 選。結(jié) 果顯示，在模型運(yùn)動(dòng)組與模型組血液間共鑒定出693個(gè)差異表達(dá)基因，在上調(diào)的166 個(gè)基因中新基因有7 個(gè)，下調(diào)的527 個(gè)中新基因12 個(gè)。ENSMUSG00000000204（Slfn4，Schlafen family||Schlafen，AAA domain）上調(diào)基因中上調(diào)倍數(shù)最高，位于11 號(hào)染色體上，其表達(dá)相應(yīng)干擾素α，并在Toll 樣受體激動(dòng)劑激活期間被誘導(dǎo)，主要與炎癥反應(yīng)相關(guān)。在下調(diào)基因中，下調(diào)倍數(shù)最高的是ENSMUSG00000049775（Tmsb4x thy-mosin，beta 4，Xchromosome），位于 X 染色體上，與細(xì)胞遷移直接相關(guān)。模型運(yùn)動(dòng)組與模型組海馬組織間共鑒定390個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)基因266 個(gè)（含新基因1 個(gè)），下調(diào)基因 124 個(gè)（含新基因 1 個(gè)）。在上調(diào)基因中，ENS-MUSG00000027447（Cst3，Cystatin C）上調(diào)倍數(shù)最高，位于2 號(hào)染色體上，其基因編碼的蛋白質(zhì)是參與神經(jīng)變性和心血管過(guò)程的半胱氨酸蛋白酶抑制劑，可抑制β-淀粉樣蛋白的聚集。在下調(diào)基因中，下調(diào)倍數(shù)最高的是ENSMUSG00000092341（Malat1，metastasis asso-ciated lung adenocarcinoma transcript 1（non-codingRNA）），位 于19 號(hào)染色體上，其基因產(chǎn)生長(zhǎng)的非編碼RNA，被切割成成熟的功能性轉(zhuǎn)錄物以及小的細(xì)胞質(zhì)RNA（mascRNA），成熟的轉(zhuǎn)錄物通過(guò) 3’結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并保留與細(xì)胞核內(nèi)，可調(diào)控基因的表達(dá)與增殖。為評(píng)估各差異表達(dá)基因在不同組別小鼠血液與海馬組織中的整體分布，以-log10（p-value）為縱坐標(biāo)、log2（foldchange）為橫坐標(biāo)構(gòu)建差異表達(dá)基因火山圖（見(jiàn)圖1）。

圖1 各組小鼠學(xué)血液與海馬組織差異基因火山圖Figure 1 Volcanic Maps of Differential Genes in Blood and Hippo-campus of Mice in Each Group

考慮到表達(dá)模式類(lèi)似的基因可能共同參與同一代謝過(guò)程、細(xì)胞通路或具有相似功能[11]，測(cè)序通過(guò)將相同或相近表達(dá)模式的基因聚集成類(lèi)，推測(cè)已知基因新功能與未知基因功能。本實(shí)驗(yàn)測(cè)序結(jié)果顯示，在不同的處理?xiàng)l件下同一cluster 中的基因具有相似的表達(dá)水平和變化趨勢(shì)。

2.2.6 差異表達(dá)基因的GO分析 （ 1）血液組織差異表達(dá)基因的GO 分析。為更好地探究差異表達(dá)基因涉及的生物學(xué)過(guò)程，采用GOseq 方法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析。通過(guò)富集分析，以ME vs MG 組血液組織中的差異表達(dá)基因?yàn)槔?，所有差異表達(dá)基因中共有634 個(gè)基因被富集到7 548 條GO terms 中，其中5 733 條富集到生物過(guò)程，716 條富集到細(xì)胞組成，1 099 條富集到分子功能。按照富集分析統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平，P＜0.05 進(jìn)一步進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果顯著性差異表達(dá)基因被富集到2 272 個(gè)GO terms中，占所有terms 的30.10%，其中1 705 條富集到生物過(guò)程，287條富集到細(xì)胞組成，280 條富集到分子功能。在顯著差異表達(dá)富集到相應(yīng)條目的基因中，有484 個(gè)下調(diào)基因，富集于2 094 條GO terms 中，150 個(gè)上調(diào)基因富集于179 條GO terms 中。其中，下調(diào)基因中 1 562 條富集到 BP 中，281 條富集到CC 中，250 條富集到MF中；上調(diào)基因中143 條富集到BF 中，6 條富集到CC中，30 條富集到MF 中。

（2）海馬組織差異表達(dá)基因的GO 分析。富集分析結(jié)果顯示（以MEvsMG 為例），所有差異表達(dá)基因中共有333 個(gè)基因被富集到977 條GO terms 中，其中639 條富集到 BP 中，197 條富集到 CC 中，141 條富集到MF 中。按照富集分析統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平，P＜0.05進(jìn)一步進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果顯示顯著性差異表達(dá)基因被富集到403 個(gè)GO terms 中，在顯著差異表達(dá)富集到相應(yīng)條目中的基因，有115 個(gè)基因下調(diào)，顯著富集于21 條 GO terms 中，218 個(gè)基因上調(diào)，顯著富集于 283 條GO terms 中。其中，在下調(diào)基因中7 條富集于BP，12 條富集于CC，2 條富集于MF；上調(diào)基因中154 條富集于BP，90 條富集于CC，39 條富集于MF。

（3）小鼠血液與海馬組織GO 顯著富集結(jié)果對(duì)比分析。對(duì)比 2 種組織的 GO terms 發(fā)現(xiàn)，在分子功能中，血液與海馬組織的7 個(gè)基因涉及β-淀粉樣蛋白沉淀（GO：0001540，beta-amyloid binding），分 別 是Itm2b、Atp1a3、Cst3、Apoe、Scarb1 和Msr1 等，這些基因多與機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)病變、血管病變等相關(guān)。在生物 過(guò) 程 中 ，涉 及 到 運(yùn) 動(dòng) 調(diào) 控 的 GO terms（GO：0040012，regulation of locomotion）中 包 括10 個(gè) 上調(diào)基因 與 42 個(gè) 下 調(diào) 基 因 。 下 調(diào) 基 因 分 別是 Ccr7、DUSP10、Ddx58、IL-1β、Mcam、Sdc4 和S1pr1[12-16]，大多是參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等[17]。上調(diào)基因分別是Ccr2、Ceacam1、Apoe、Angpt1、Lgals3、Gsn、Rtn4 和Nfkbid[18-24]等，大多參與神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性疾病[25]，并與運(yùn)動(dòng)關(guān)系密切。

2.2.7 差異表達(dá)基因KEGG分析 （ 1）小鼠血液差異表達(dá)基因KEGG 富集分析結(jié)果。對(duì)各組小鼠血液和海馬組織的所有差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 通路分析，結(jié)果顯示（以ME vs MG 為例），共計(jì)199 個(gè)基因富集到14 個(gè)KEGG 通路上，其中，26 個(gè)基因富集到血小板活化，29 個(gè)基因富集到吞噬，24 個(gè)基因富集到帕金森病的發(fā)病機(jī)制，26 個(gè)基因富集到阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制，22 個(gè)基因富集到氧化磷酸化過(guò)程，16 個(gè)基因富集到ECM-受體相互作用，15 個(gè)基因富集到造血細(xì)胞譜系，14 個(gè)基因富集到心肌收縮，4 個(gè)基因富集到長(zhǎng)期抑郁病理改變，6 個(gè)基因富集到NF-kB 信號(hào)通路，6個(gè)基因富集到Toll 樣受體信號(hào)通路，6 個(gè)基因富集到TRP 通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)，3 個(gè)基因富集到TGF-β信號(hào)通路，2 個(gè)基因富集到 PPAR 信號(hào)通路。其他KEGG 富集通路還包括5-羥色胺能突觸、膽堿能突觸、多巴胺能突觸和雌激素等富集通路的差異基因表達(dá)，雖不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但基因表達(dá)的富集通路也具有一定意義。

（2）小鼠海馬組織差異表達(dá)基因KEGG 富集分析結(jié)果。海馬組織中共有 340 個(gè)基因富集于 16 個(gè)KEGG通路，其中82 個(gè)基因富集到核糖體，44 個(gè)基因富集到氧化磷酸化，41 個(gè)基因富集到帕金森病的發(fā)病機(jī)制，42 個(gè)基因富集到阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制，58 個(gè)基因富集到代謝途徑，3 個(gè)基因富集到PPAR 信號(hào)通路，6 個(gè)基因富集到cAMP 信號(hào)通路，3 個(gè)基因富集到雌激素信號(hào)通路，5 個(gè)基因富集到過(guò)氧化物酶體，6 個(gè)基因富集到吞噬，4 個(gè)基因富集到谷氨酸能突觸，2 個(gè)基因富集到膽堿能突觸，1 個(gè)基因富集到5-羥色胺能突觸，1 個(gè)基因富集到多巴胺能突觸，1 個(gè)基因富集到TRP 通道的炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)。其他富集的KEGG通路還包括Wnt 信號(hào)通路、ECM-受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路和PI3K-Akt 信號(hào)通路等，雖然未達(dá)到P＜0.05 的顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但信號(hào)通路相關(guān)基因差異表達(dá)顯著。

（3）小鼠血液與海馬組織KEGG 顯著富集結(jié)果對(duì)比分析。對(duì)比2 種組織KEGG 通路分析顯示，在氧化磷酸化、帕金森病和阿爾茨海默病的發(fā)病過(guò)程、吞噬、多巴胺能突觸、TRP 通道的炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)等關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。對(duì)比其差異表達(dá)基因有所區(qū)別。對(duì)比分析結(jié)果顯示，KEGG 顯著富集的通路與神經(jīng)元退行性病變、炎癥等有關(guān)。

3 結(jié) 論

高通量測(cè)序技術(shù)及其生物信息學(xué)發(fā)展為臨床疾病和動(dòng)植物病變的診斷與康復(fù)治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在肯定測(cè)序技術(shù)優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，在人與動(dòng)物急慢性疾病的研究仍不夠成熟，尤其是在靶向調(diào)控關(guān)系的預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方面存在諸多挑戰(zhàn)。本實(shí)驗(yàn)采用CUMS抑郁造模成效顯著，運(yùn)動(dòng)干預(yù)后的康復(fù)效果突出。實(shí)驗(yàn)測(cè)序樣本錯(cuò)誤率、堿基含量、差異表達(dá)基因篩選結(jié)果可靠，預(yù)測(cè)分析其靶基因位點(diǎn)，KEGG和GO分析結(jié)果驗(yàn)證了顯著富集的差異表達(dá)基因主要與長(zhǎng)期抑郁、抑郁炎癥、細(xì)胞凋亡與自噬及其相關(guān)信號(hào)通路關(guān)系密切，確定炎癥、凋亡與自噬誘發(fā)小鼠抑郁的病理機(jī)制，證實(shí)了血液與海馬組織高通量測(cè)序結(jié)果顯著富集的高度一致性，為臨床采用血液檢測(cè)結(jié)果反應(yīng)海馬組織疾病及其干預(yù)效果提供借鑒。同時(shí)，由于實(shí)驗(yàn)研究測(cè)序選擇的實(shí)驗(yàn)組別僅限于空白鼠、模型鼠和運(yùn)動(dòng)干預(yù)鼠，且實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法并未采取基因干擾或基因敲減等技術(shù)，因此，缺乏具體信號(hào)通路誘導(dǎo)作用機(jī)制的深入探討，但為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究拓寬了思路，奠定良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。