HMGB1在牙周炎中作用研究進(jìn)展

馮鈺皓 齊 霞 沈益名 楊冬茹

牙周炎是一種導(dǎo)致牙齒支持組織（牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨）進(jìn)行性破壞的慢性炎癥。從全球的狀況來看，大約有11%的世界人口可能患有嚴(yán)重的牙周炎，影響到7.43 億人[1]。牙周炎的主要臨床表現(xiàn)為牙齦出血，臨床附著喪失（CAL），牙周袋形成，牙槽骨吸收[2]。它以牙菌斑為始動因子，由宿主免疫炎癥反應(yīng)、遺傳和環(huán)境等多種因素造成。然而，牙周炎的病理機(jī)制尚未完全明確。近年來，諸多研究證實：高遷移率族蛋白B1（high mobility group B1,HMGB1）在牙周炎病理過程中同時具有促進(jìn)炎癥及組織再生的雙重作用,并參與伴吸煙、糖尿病牙周炎的發(fā)生發(fā)展[3，4]。HMGB1 作為真核細(xì)胞中高度保守的、廣泛表達(dá)的非組蛋白核蛋白，在炎癥及感染刺激下可由壞死、受損細(xì)胞被動釋放或免疫細(xì)胞主動分泌至胞外。HMGB1 作用于靶細(xì)胞表面Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor of advanced glycation end-product,RAGE），釋放損傷信號，參與炎癥和免疫反應(yīng)，還可刺激細(xì)胞增殖及分化，啟動組織修復(fù)及再生[5～7]。HMGB1 的復(fù)雜生物學(xué)功能與其分子結(jié)構(gòu)與定位、氧化還原狀態(tài)、分泌途徑、受體等相關(guān)。本文就HMGB1 在牙周炎作用的最新研究進(jìn)展做一綜述。

一、HMGB1 的生物學(xué)特性

1.HMGB1 的結(jié)構(gòu)：HMGB1 含有兩個以三個α螺旋和兩個環(huán)以“L”形排列的近端同源DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，稱為A-box（9-79aa）和B-box（95-163aa），一個帶有重復(fù)的谷氨酸和天冬氨酸的C-末端酸性尾（186-215aa），以及一個短但具有重要功能的N末端結(jié)構(gòu)域[8]。B-box 具有促炎活性，而A-box 為HMGB1 拮抗劑，能競爭性與B-box 結(jié)合，發(fā)揮抗炎修復(fù)作用，與C-末端酸尾融合后，A-box 的抗炎活性進(jìn)一步增強(qiáng)[9]。細(xì)胞核中，HMGB1 參與核小體及染色體穩(wěn)定與維持、基因轉(zhuǎn)錄及損傷修復(fù)、端粒酶的功能及活性。HMGB1 在細(xì)胞核中的穩(wěn)定定位是與兩個核定位信號（nuclear localization signals，NLSs）有關(guān)：NLS1（28-44aa）和NLS2（179-185aa）。NES 和NLSs 的表觀遺傳修飾介導(dǎo)了HMGB1 亞細(xì)胞位置及功能改變[5]。

2.HMGB1 的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)：HMGB1 的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和功能與翻譯后表觀遺傳修飾密切相關(guān)，其中最重要的是可逆性乙酰化修飾。HMGB1 對DNA 的親和力取決于NLS1 及NLS2 的乙?；潭?。缺氧、缺血、細(xì)胞因子、感染等氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)NLSs 賴氨酸殘基突變?yōu)楣劝滨０?，促進(jìn)HMGB1 的核胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌[10]。此外，Lys42 甲基化修飾可改變HMGB1 蛋白構(gòu)象，降低其DNA 結(jié)合活性[11]；C-末端酸性尾的ADP核糖化促進(jìn)HMGB1 的分泌[12]；發(fā)生于N37、N134、N135N-糖基化修飾，減弱HMGB1 與DNA 的結(jié)合，促進(jìn)HMGB1 的釋放[13]。目前普遍認(rèn)為，HMGB1 的氧化還原修飾與其炎癥促進(jìn)或者組織修復(fù)功能密切相關(guān)。HMGB1 的第23、45 和106 位半胱氨酸對氧化還原敏感，可產(chǎn)生三種異構(gòu)體：完全還原型HMGB1，二硫化型HMGB1 和磺酰型HMGB1。完全還原HMGB1 在C23 和C45 之間形成二硫化鍵C23-S-S-C45，被氧化為二硫化型HMGB1，位于具有促炎活性B-box 的硫醇C106 通過TLR4/髓系分化因子2（myeloid differentiation factor-2，MD-2）復(fù)合體及RAGE 誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等，從而發(fā)揮促炎作用[6，14，15]。

目前，不同氧化還原狀態(tài)HMGB1 在體內(nèi)的分布尚不完全明確。生理情況下，完全還原型HMGB1存在于細(xì)胞核中，再生肌纖維細(xì)胞核中高表達(dá)完全還原型HMGB1[16]。然而，HMGB1 氧化可發(fā)生在小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和HEK293 細(xì)胞核中，由細(xì)胞中高表達(dá)的抗氧化酶家族過氧化物還原蛋白（peroxiredoxins，Prxs）介導(dǎo)形成二硫鍵，是HMGB1 核質(zhì)易位和分泌所必需的[17]。Michele 等也證實健康人白細(xì)胞裂解液中檢測出高表達(dá)二硫化型HMGB1[16]。

3.HMGB1 的釋放：由于缺乏前導(dǎo)信號序列，HMGB1 不能通過經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑分泌。感染或炎癥狀態(tài)下，HMGB1 可由壞死細(xì)胞、靶細(xì)胞程序性、促炎性的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡釋放[8]，或進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的HMGB1 被包裝到細(xì)胞內(nèi)囊泡，如溶酶體或自噬體中，囊泡與細(xì)胞質(zhì)膜融合后通過胞吐作用主動釋放。此外，HMGB1 還可以外泌體的形式釋放。脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）結(jié)合肝細(xì)胞表面TLR4，導(dǎo)致含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶11（cysteinyl aspartate specific proteinase-11,caspase-11）的表達(dá)增加，并裂解焦孔素（gasdermin D，GSDMD），引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca 離子流增加，激活磷酸化鈣調(diào)素激酶B 使HMGB1 以外泌體的形式釋放[18]。胞外HMGB1 可與多種細(xì)胞外受體結(jié)合，例如RAGE、TLR4、α-突觸核蛋白絲等，目前證據(jù)比較充分的受體為TLR4 及RAGE。HMGB1 通過特定結(jié)構(gòu)域與受體相互作用：TLR4 結(jié)合位點(diǎn)位于HMGB1 序列89-108aa，RAGE 結(jié)合位點(diǎn)位于23-50aa 及150-183aa[19，20]（圖1）。

圖1 HMGB1 的分泌途徑

二、HMGB1 在牙周炎中的作用

1.HMGB1 對慢性牙周炎致病的作用：致病菌及其代謝產(chǎn)物引起過度的宿主免疫炎癥反應(yīng)是造成慢性牙周炎的主要原因。在牙周微環(huán)境中，HMGB1 表現(xiàn)為雙重作用：加重炎癥反應(yīng)、促進(jìn)組織修復(fù)。

多項臨床研究證實：慢性牙周炎患者齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF）及血清中HMGB1高表達(dá)，且牙周基礎(chǔ)治療后HMGB1 表達(dá)降低，HMGB1 水平與菌斑指數(shù)、出血指數(shù)、牙周袋深度、附著喪失正相關(guān)[21]。此外，實驗性牙周炎動物牙周組織免疫組化分析發(fā)現(xiàn)：HMGB1 在牙齦、牙周膜、根分叉區(qū)及下頜骨中表達(dá)均顯著升高。慢性牙周炎患者牙齦組織中HMGB1 主要表達(dá)在溝內(nèi)上皮基底層、固有層炎性浸潤細(xì)胞及成纖維細(xì)胞中，牙槽骨中成骨細(xì)胞表達(dá)多于破骨細(xì)胞，在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)均顯著高于細(xì)胞核[16]。此外，TLR2、TLR4、RAGE 在慢性牙周炎患者牙齦組織表達(dá)顯著高于健康對照組[17]。

牙齦卟啉單胞菌（porphyromonas gingivalis，Pg）是慢性牙周炎病變區(qū)或活動部位最主要的優(yōu)勢菌，其毒力因子參與逃避宿主免疫防御機(jī)制，破壞牙周組織。其中，Pg-LPS 是TLR4 及RAGE 的有效配體，Pg 脂蛋白可作為TLR2 配體，均可激活NF-κB 通路，釋放HMGB1、TNF-α、IL-1β 等促炎因子[22]。牙齦卟啉單胞菌浸潤的結(jié)扎線誘導(dǎo)小鼠實驗性牙周炎模型，免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，牙齦上皮細(xì)胞中HMGB1從細(xì)胞核移位至細(xì)胞外，促進(jìn)IL-1β 和C-X-C 基序趨化因子配體1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）表達(dá)、中性粒細(xì)胞遷移和牙槽骨吸收，全身給藥抗HMGB1 抗體的可顯著抑制HMGB1 的易位，抑制牙周炎癥[4]。

2.HMGB1 對糖尿病牙周炎致病的作用：糖尿病是牙周炎的系統(tǒng)性危險因素，糖尿病患者牙周炎發(fā)病率是非糖尿病人的2～3 倍，表現(xiàn)為更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，且依靠局部治療難以控制的牙周組織破壞。糖尿病牙周炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確。

高血糖促進(jìn)牙周組織中HMGB1、RAGE 表達(dá)增加[23]，體外構(gòu)建伴糖尿病牙周炎小鼠模型，免疫組化研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HMGB1、RAGE 在糖尿病牙周炎牙齦組織中表達(dá)均顯著高于牙周炎組。該結(jié)果提示HMGB1、RAGE 參與了糖尿病牙周炎的發(fā)展[24]。高血糖可通過HMGB1/RAGE 信號軸持續(xù)激活NF-κB信號通路，釋放IL-6、TNF-α，加重糖尿病牙周炎病理過程。

持續(xù)的高糖環(huán)境能夠誘發(fā)炎癥反應(yīng)的發(fā)生并引起氧化應(yīng)激水平增高,HMGB1 是一種重要的炎性介質(zhì)。二甲雙胍是Ⅱ型糖尿病的一線用藥，也是HMGB1 的抑制劑之一，其可直接結(jié)合HMGB1 并抑制其促炎活性。二甲雙胍和鹽酸二甲雙胍負(fù)載聚乳酸-乙醇酸納米顆?？蓽p輕大鼠牙周炎癥反應(yīng)和骨吸收[25]，這表明二甲雙胍不僅可以降低血糖水平，還有阻斷HMGB1 的抗炎作用，可能對糖尿病牙周炎有效。研究表明，高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)牙齦上皮細(xì)胞，與對照組比較，HMGB1、RAGE、氧化應(yīng)激指示劑8-OHdG 表達(dá)增加，抗氧化酶SOD 表達(dá)降低，毛蕊花苷通過抑制PKC/HMGB1/RAGE/NF-κB 信號通路，促進(jìn)SOD 表達(dá)，抑制8-OHdG 的表達(dá)，并上調(diào)PGC1-α 和NRF1，促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生，降低氧化應(yīng)激水平。HMGB1 在糖尿病和牙周炎之間的雙向關(guān)系中起到了重要作用。

3.HMGB1 對伴吸煙牙周炎的作用：在環(huán)境因素中，吸煙作為獨(dú)立危險因素導(dǎo)致慢性牙周炎加重已經(jīng)成為共識，有研究發(fā)現(xiàn)，吸煙者患牙周炎的可能性高,是非吸煙者的4 倍[26]，且牙周病情重,有更嚴(yán)重的牙槽骨吸收,更深的牙周袋,而且治療效果差,但牙齦探診出血程度卻比不吸煙者輕,且戒煙后牙齦出血反而加重[27]。有實驗收集了伴吸煙慢性牙周炎患者、非吸煙慢性牙周炎患者和非吸煙牙周健康者的齦溝液樣本。ELISA 分析HMGB1 的水平發(fā)現(xiàn)，非吸煙慢性牙周炎患者齦溝液HMGB1 中值水平顯著高于伴吸煙慢性牙周炎患者和非吸煙牙周健康者，且伴吸煙慢性牙周炎患者和非吸煙牙周健康者間沒有顯著差異[3]。尼古丁抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中HMGB1 胞質(zhì)易位，保留其核定位，表明尼古丁抑制HMGB1 釋放到細(xì)胞外。

孫立眾等對比吸煙及非吸煙慢性牙周炎患者的牙齦組織中HMGB1 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，HMGB1mRNA 在牙周炎組及健康對照組中，吸煙者表達(dá)均高于不吸煙者，且以吸煙牙周炎組的表達(dá)水平最高[28]。因此我們推測，吸煙及炎癥使HMGB1 的基因水平表達(dá)增加，而煙草中成分抑制其核移位。

目前吸煙對于牙周炎中HMGB1 的影響仍存在爭議。需進(jìn)一步實驗證實吸煙通過何種特殊病理機(jī)制加重牙周炎癥，同時導(dǎo)致HMGB1 表達(dá)異常。

三、HMGB1 與牙周組織再生

牙周組織包括牙槽骨、牙周韌帶和牙骨質(zhì)。牙周感染刺激HMGB1 的釋放，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的分泌，導(dǎo)致牙齦出血，臨床附著喪失，牙周袋形成，牙槽骨吸收等。釋放的炎癥因子進(jìn)一步促進(jìn)HMGB1的分泌，引起炎癥的級聯(lián)放大反應(yīng)，加重牙周炎癥及牙槽骨的吸收。

生理情況下，HMGB1 在大鼠下頜骨中破骨細(xì)胞表達(dá)較成骨細(xì)胞多，主要位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中，牙齦卟啉單胞菌誘導(dǎo)牙周炎下頜骨組織中，成骨細(xì)胞表達(dá)多于破骨細(xì)胞，與對照組相比，2～6 周內(nèi)HMGB1 在成骨細(xì)胞表達(dá)均升高，破骨細(xì)胞中2、3周HMGB1 高于正常組。HMGB1 在骨折血腫區(qū)域高表達(dá)，可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）成骨分化，成骨細(xì)胞增殖及遷移，以及相關(guān)細(xì)胞因子的釋放，促進(jìn)骨折愈合[29]。

牙周膜成纖維細(xì)胞的持續(xù)增殖、定向遷移和功能分化，是實現(xiàn)牙周組織再生修復(fù)的關(guān)鍵。Wolf 等研究證實，HMGB1 促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)其堿性磷酸酶（ALP）、血清骨橋蛋白（OPN）、骨鈣素（osteocalcin,OC）、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）的表達(dá)及礦化結(jié)節(jié)的形成，從而促進(jìn)成骨分化[30]。此外，HMGB1 作為趨化因子對間充質(zhì)干細(xì)胞具有趨化性。抗體陣列分析研究發(fā)現(xiàn)HMGB1 作用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，表皮生長因子受體（epidermal growth factor Receptor，EGFR）的表達(dá)上調(diào)，并激活下游Ras/MAPK 信號通路，促進(jìn)其成骨分化[31]。TLR2、TLR4 及RAGE 在牙周組織再生中具有重要意義。rHMGB1 能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的遷移而不抑制其增殖。靶向構(gòu)建TLR2 或TLR4特異性siRNA 可以顯著抑制HMGB1 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞遷移[32]。除此以外，HMGB1/RAGE 信號在口腔組織修復(fù)中也發(fā)揮重要作用。體外培養(yǎng)RAGE-/-牙齦成纖維細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其增殖、遷移在再上皮化進(jìn)程中被延遲。Biguettiet 等報道，HMGB1/RAGE 信號參與干細(xì)胞遷移，巨噬細(xì)胞M1/M2 極化和純鈦種植體成骨過程骨整合，抑制HMGB1 或RAGE 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移并向M1 極化，影響骨沉積及骨基質(zhì)成熟[33]。此外，HMGB1 可通過TLR2、TLR4 和RAGE 介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活、血管生成[34,35]。據(jù)此我們推測，HMGB1 可能在牙周組織再生中起促進(jìn)作用。

四、阻斷HMGB1 對牙周炎的治療作用

多項臨床研究證實：牙周炎患者齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF）及血清中HMGB1 高表達(dá)，且牙周基礎(chǔ)治療后HMGB1 表達(dá)降低，HMGB1 水平與菌斑指數(shù)、出血指數(shù)、牙周袋深度、附著喪失正相關(guān)[3,21,36]。有大量研究表明，應(yīng)用HMGB1 阻斷劑對牙周炎有抑制作用。甘草酸作為一種天然的三萜糖綴合物，天然分子甘草甜素是甘草根的一種成分，也已被測試以阻斷HMGB-1 效應(yīng)，因為它直接與HMGB-1 結(jié)合，阻止其與配體受體的相互作用[37]。其廣泛應(yīng)用于牙膏等口腔清潔用品中，Takeuchi-Hatanaka 等[38]通過隨機(jī)雙盲臨床試驗證實含有甘草酸的清潔用品可有效控制口腔炎癥。Ideguchi 等[39]通過組織學(xué)分析，牙周炎小鼠骨表面有大量的破骨細(xì)胞，骨表面有吸收腔，牙周組織有嗜中性粒細(xì)胞浸潤。甘草酸不僅能顯著降低破骨細(xì)胞的數(shù)量，而且還能顯著降低中性粒細(xì)胞的數(shù)量，說明甘草酸對牙周炎的發(fā)生有抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)[40]甘草酸可以抑制HMGB1 的釋放，從而保護(hù)造影劑損傷的HK-2細(xì)胞。由此我們可以推斷，甘草酸有可能是通過抑制HMGB1 的釋放從而控制牙周炎的進(jìn)展?？笻MGB1 抗體是最有效的HMGB1 抑制劑之一，有研究表明[41]，抗HMGB1 抗體可以減弱GM-CSF、IL-1β等細(xì)胞因子的分泌，阻止了破骨細(xì)胞的長時間免疫刺激和骨吸收活性，從而抑制牙周炎的進(jìn)展。咬合創(chuàng)傷是牙周炎重要的局部促進(jìn)因素，Mika 等人在小鼠左下第一磨牙上制作咬合創(chuàng)傷模型，免疫組化研究證實：根分叉區(qū)骨吸收和破骨細(xì)胞形成逐漸增加，HMGB1、TLR4 和核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factors-κB ligand,RANKL）表達(dá)均增加。注射抗HMGB1 中和抗體，顯著減少分叉區(qū)破骨細(xì)胞的數(shù)量以及RANKL 和TLR4 的表達(dá)[42]。

牙周致病菌釋放毒性產(chǎn)物作用于宿主免疫防御系統(tǒng)，直接或間接促進(jìn)HMGB1 的釋放，釋放的HMGB1 作用于鄰近細(xì)胞表面TLR2/4 及RAGE，產(chǎn)生促炎因子及趨化因子，如IL-8 及GM-CSF，遷移并分化免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 及HMGB1，放大局部炎癥反應(yīng)，加重的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成及牙槽骨的吸收。吸煙、糖尿病作為牙周炎的獨(dú)立危險因素，參與HMGB1 介導(dǎo)的牙周組織破壞。此外，HMGB1 可促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞遷移及成骨、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化及血管再生。

雖然關(guān)于HMGB1 在牙周炎中雙重作用已有諸多研究，但其調(diào)控牙周炎免疫炎癥反應(yīng)及牙周再生具體分子機(jī)制尚不完全明確。HMGB1 的不同結(jié)構(gòu)域、不同氧化還原形式、分泌機(jī)制、刺激類型（有菌、無菌）如何通過相關(guān)細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其生物學(xué)效應(yīng)參與牙周炎的發(fā)生及發(fā)展，將是未來研究的重點(diǎn)。