仿生再礦化肽及衍生物提高牙本質(zhì)粘接耐久性的研究進(jìn)展

馮杉杉 陳 歡 丁景瑜 侯妍妍 金毅夫 朱 松

牙本質(zhì)粘接依靠粘接劑滲透到脫礦的膠原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和牙本質(zhì)小管內(nèi)并原位聚合，形成混合層和樹脂突獲得主要粘接固位力[1]。牙本質(zhì)因有機(jī)物含量高和粘接劑中聚合物降解等因素難以形成高質(zhì)量的混合層[1～4]。粘接界面是牙本質(zhì)粘接的薄弱環(huán)節(jié)，其混合層質(zhì)量及抗老化性能是影響粘接耐久性的關(guān)鍵。

誘導(dǎo)牙本質(zhì)粘接界面混合層裸露的膠原纖維再礦化，可恢復(fù)牙本質(zhì)硬度和減少膠原纖維的收縮塌陷和水解，重建牙本質(zhì)粘接劑滲透不良區(qū)域的結(jié)構(gòu)與功能，增強(qiáng)其封閉性，提升牙本質(zhì)-粘接界面的穩(wěn)定性[5]。

一、牙本質(zhì)再礦化的作用機(jī)制

牙本質(zhì)的生物礦化包括分泌有機(jī)基質(zhì)和晶體礦化，膠原纖維在礦化過程中充當(dāng)生物礦化的支架和模板，在牙本質(zhì)基質(zhì)中富含酸性氨基酸結(jié)構(gòu)域的非膠原蛋白（non-collagenous proteins，NCPs）可以螯合大量鈣離子形成無定形磷酸鈣（amorphous calcium phosphate，ACP），并誘導(dǎo)其進(jìn)入膠原纖維孔區(qū)，調(diào)控羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAp）晶體在膠原纖維內(nèi)外有序沉積[6，7]。生物礦化過程主要利用殘留在膠原基質(zhì)中的HAp，鈣磷離子在脫礦的牙本質(zhì)中以此作為成核位點異相成核[8，9]、成長，但此方式形成的晶體多在膠原纖維間，取向混亂[9]。

酸蝕后牙本質(zhì)有機(jī)基質(zhì)中幾乎無殘留的礦物晶體和HAp 種晶，無法誘導(dǎo)HAp 異相成核。此時再礦化分子通過靜電吸引或建立滲透壓平衡使類液態(tài)性質(zhì)的礦化前驅(qū)體-ACP 向膠原纖維內(nèi)納米間隙定向沉積[10，11]，形成高度有序的有機(jī)基質(zhì)-無機(jī)復(fù)合物結(jié)構(gòu)，恢復(fù)其生物力學(xué)性能和機(jī)械性能。

二、仿生再礦化肽及衍生物在牙本質(zhì)粘接中的應(yīng)用

研究顯示脫礦牙本質(zhì)用再礦化劑預(yù)處理可以改善其潤濕性和提升微拉伸粘接強(qiáng)度[12]。體外實驗中，再礦化肽8DSS、酪蛋白磷酸肽等可在脫礦牙本質(zhì)表面誘導(dǎo)HAp 有序沉積，封閉牙本質(zhì)小管，有效降低牙本質(zhì)的滲透性，但目前主要用于治療牙本質(zhì)過敏癥。

由于天然的NCPs 來源有限，提取和純化過程復(fù)雜，研究主要針對NCPs 的仿生功能類似物，Ma[13]和Xiang[14]等發(fā)現(xiàn)在體外研究中聚電解質(zhì)能夠穩(wěn)定ACP 并誘導(dǎo)其在膠原纖維內(nèi)有序沉積。目前，仿生再礦化肽及衍生物提升牙本質(zhì)粘接界面粘接耐久性是研究熱點。本文將對釉原蛋白衍生多肽、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1 衍生肽、相鄰含相反電荷殘基的促礦化肽等的應(yīng)用及研究進(jìn)展進(jìn)行介紹。

1.釉原蛋白衍生多肽P26

釉原蛋白衍生多肽P26，是富含天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）酸性磷酸化多肽[15]，包含磷灰石結(jié)合區(qū)和自組裝區(qū)，能促進(jìn)HAp 在脫礦牙本質(zhì)表面定向沉積，與底層牙體組織結(jié)合，增強(qiáng)機(jī)械性能[16]。圓二色譜和透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，P26 將HAp 自組裝呈球狀，緊密排列在膠原纖維軸線上[16]，P26 處理后，開放的牙本質(zhì)小管被致密的羥基磷灰石堵塞封閉，管間牙本質(zhì)基質(zhì)中的膠原纖維沉積礦物晶體增多。在體外實驗中P26 介導(dǎo)HAp 晶體在脫礦牙本質(zhì)原位成核，有效地促進(jìn)膠原纖維礦化，顯著增強(qiáng)淺層牙本質(zhì)的硬度和彈性模量，將其生物力學(xué)性質(zhì)恢復(fù)到接近天然水平[16，17]，這有助于緩解牙本質(zhì)敏感，減少繼發(fā)齲以及提高牙本質(zhì)粘接耐久性。

2.牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1 衍生肽pA 和pB

NCPs 主要包括牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1（dentin matrix Protein 1，DMP 1）和牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）等[18]，其中DMP 1 與牙本質(zhì)的生物礦化關(guān)系最密切，它不僅對膠原具有高度親和力能，提供礦物成核位點促進(jìn)膠原纖維內(nèi)礦化，還可穩(wěn)定調(diào)控ACP 的尺寸[8，19]。George 等將Ⅰ型膠原親和序列DSESSEEDR 分別與DMP-1 中HAp結(jié)合域序列ESQES 和QESQSEQDS 連接[20，21]，合成DMP-1 衍生肽pA（DSESSEEDR-Ahx-ESQES）和pB（DSESSEEDR-Ahx-QESQSEQDS）[22]。體外實驗結(jié)果顯示pA 和pB 可成功結(jié)合到膠原蛋白的特定區(qū)域，多肽pB 的再礦化效果優(yōu)于pA，掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察發(fā)現(xiàn)，用1:4 的pA 和pB 處理20 分鐘后，在牙本質(zhì)基質(zhì)中礦物晶體在膠原纖維內(nèi)沿軸線生長，誘導(dǎo)纖維內(nèi)部和纖維間再礦化[22]。

3.含相反電荷殘基的促礦化肽MPP3

天然礦化多肽或NCPs 的結(jié)構(gòu)中都含有大量酸性氨基酸，其聚陰離子特性可螯合大量鈣離子，形成礦化前驅(qū)體最后完成膠原纖維內(nèi)礦化。近期研究發(fā)現(xiàn),在兩個結(jié)構(gòu)無序、長度相同、序列相似的肽段中，相鄰的帶相反電荷殘基的肽段比只有酸性殘基的肽段再礦化速度更快,結(jié)晶礦物更多[23]。

促礦化多肽MPP3（PGEKADRAEKADRA)由相反電荷的氨基酸對組成，能吸引納米級成核前驅(qū)體ACP 產(chǎn)生局部過飽和點，促進(jìn)成核[24，25]。盡管MPP1和MPP3 具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)，但帶相反電荷殘基對數(shù)較多的MPP3 更易形成針狀晶體[24]。在牙本質(zhì)粘接前，學(xué)者用促礦化肽MPP3 預(yù)先處理1 分鐘，SEM 觀察發(fā)現(xiàn)，10 分鐘后脫礦膠原纖維周圍有針狀顆粒沉積，60 分鐘后牙本質(zhì)表面形成連續(xù)的礦物層，可完全覆蓋并封閉牙本質(zhì)小管[24，25]。在體外模型中，MPP3 的礦化效果優(yōu)于氟化物，人工乳牙齲模型應(yīng)用10%MPP3+5% NaF 的清漆后，再礦化效果顯著優(yōu)于商品化清漆Durashield 和Embrace[26]。此外，在粘接前用MPP3 預(yù)處理牙本質(zhì)能提升酸蝕-沖洗和自酸蝕模式粘接劑的粘接性能，其中在酸蝕-沖洗模式下，預(yù)處理10 分鐘效果尤為顯著[27]。這表明MPP3 顯著快速礦化動力學(xué)，可促進(jìn)牙本質(zhì)膠原纖維間快速部分再礦化，增加牙本質(zhì)中脫礦膠原的硬度，減少膠原的崩塌和降解。

何[27]設(shè)計兩種帶正負(fù)電荷非膠原蛋白仿生肽，研究發(fā)現(xiàn)SR-14 和NS-7 均可誘導(dǎo)膠原纖維內(nèi)礦化，這也表明酸性氨基酸SR-14 或堿性氨基酸NS-7 都可通過靜電吸引與膠原纖維的帶電孔區(qū)結(jié)合，其中由于NS-7 的序列中正電荷位點數(shù)多，結(jié)合能明顯大于SR-14，膠原纖維內(nèi)礦化速度和效果更高。

4.多巴衍生再礦化肽DOPA-Ahx-（Gly)3-（Glu)5

貽貝粘附蛋白具有獨特的抗潮濕粘接性能，并且富含大量兒茶酚基團(tuán)氨基酸，3，4 二羥基苯丙氨酸（3，4-dihydroxyphenylalanine，DOPA）[28]。受貽貝粘附蛋白啟發(fā)，Zhou[29]等在脫礦的牙本質(zhì)上應(yīng)用聚多巴胺涂層，發(fā)現(xiàn)聚多巴胺能與膠原纖維結(jié)合，有效封閉牙本質(zhì)小管。研究表明多巴的兒茶酚基團(tuán)能通過化學(xué)鍵與膠原纖維作用[30]，谷氨酸具有較強(qiáng)螯合鈣離子的能力[31]。為提升谷氨酸與鈣離子的親和力，學(xué)者在谷氨酸中設(shè)計一段含甘氨酸的剛性間隔域，構(gòu)造出多巴衍生再礦化肽DOPA-Ahx-（Gly）3-（Glu）5[32，33]。脫礦的牙本質(zhì)標(biāo)本分別用1 mg/ml 的DOPA-Ahx-（Gly）3-（Glu）5、聚多巴胺、聚多巴等處理后置于再礦化液中10 天，SEM 顯示，聚多巴胺、聚多巴和DOPA-Ahx-（Gly）3-（Glu）5 等均能部分封閉牙本質(zhì)小管，其中DOPA-Ahx-（Gly）3-（Glu）5還能誘導(dǎo)內(nèi)壁部分礦化[33]。多巴衍生再礦化肽的體外礦化效果已得到驗證，有望緩解牙本質(zhì)敏感。此外DOPA-Ahx-（Gly）3-（Glu）5 在牙本質(zhì)仿生礦化研究應(yīng)尋找持續(xù)的鈣磷供應(yīng)途徑，并進(jìn)一步縮短礦化時間，提高牙本質(zhì)礦化度和仿生度，為其在牙本質(zhì)底涂劑和粘接劑中應(yīng)用,提升牙本質(zhì)粘接耐久性的奠定基礎(chǔ)。

5.抗菌-再礦化雙功能肽

牙本質(zhì)粘接界面處的繼發(fā)齲是修復(fù)失敗的主要原因之一，在粘接界面應(yīng)用抗菌-再礦化雙功能肽，可抑制致齲菌的定植和代謝，并顯著提高粘接界面封閉性和完整性,提高牙本質(zhì)粘接體系粘接質(zhì)量?？咕腉H12 可抑制變形鏈球菌生物膜的形成，降低生物膜的生物量和生物活性[34]，Wang 等[35]利用GH12 優(yōu)異的抗菌效果，將再礦化肽TD7 與GH12的N-端結(jié)合，合成雙功能多肽TDH19、TNH19 和TVH19，其中TVH19 的最低抑菌濃度為64μM，體外抗菌和再礦化能力最優(yōu)。

研究表明，多肽與聚合物之間的非特異作用會限制肽的生物活性[36]，在多肽序列中設(shè)計間隔域，不僅保留肽的活性構(gòu)象，還為甲基丙烯酸酯（methacrylic acid，MA）單體提供偶聯(lián)位點，粘接劑中聚合物在固化后還可保持再礦化性質(zhì)[37]。有研究將添加間隔域10%羥基磷灰石親和肽MA-HABP（GSGGGCML PHHGAC）混入親水性粘接劑，拉曼光譜顯示MA-HABP 處理試件區(qū)域形成新礦物結(jié)晶度更高[38]，顯著提升粘接界面處封閉性和完整性[39]。Yuca 等[40]在羥基磷灰石親和肽HABP 和抗菌肽AMPM7 上分別添加間隔域GSGGG 和GGG，形成K-GSGGG-HABP和AMPM7（KGGGKWKRWWWWR-NH2）后，與MA偶聯(lián),添加到粘接劑中構(gòu)建雙功能粘接體系。當(dāng)AMPM7 與K-GSGGG-HABP 結(jié)合后，最小抑菌濃度為31.3 μg/mL，多肽的活性間隔域顯示出顯著抗菌性。此外，SEM 和能量色散X 射線光譜對再礦化物表征發(fā)現(xiàn)當(dāng)K-GSGGGHABP：AMPM7 為3:7 時，樣本表面有大量球狀晶體沉積，Ca/P 比為1.49 與磷酸三鈣最接近[40，41]，礦化物的穩(wěn)定性高，溶解度低?？咕?再礦化雙功能肽的應(yīng)用頗有前景，但在未來的研究中還應(yīng)注重縮短臨床操作時間，延長抗菌肽在抗菌時效，提升再礦化的效率，在致齲菌定植前迅速實現(xiàn)部分礦化，增強(qiáng)界面的抗菌性。

三、總結(jié)與展望

近年在優(yōu)化混合層質(zhì)量提高牙本質(zhì)界面粘接耐久性方面取得較好成果，仿生再礦化肽及衍生物能促進(jìn)礦物離子在膠原纖維內(nèi)外有序沉積，有效誘導(dǎo)纖維間和纖維內(nèi)膠原礦化，但膠原纖維內(nèi)外再礦化對粘接界面處粘接強(qiáng)度和機(jī)械性能影響較大。根據(jù)“分子尺寸排斥理論”相對分子量小于6 kDa 的分子易擴(kuò)散進(jìn)入膠原原纖維內(nèi)，相對分子量大于40 kDa的分子則無法進(jìn)入[42]，故再礦化肽及衍生物的形態(tài)和尺寸，以及在脫礦膠原基質(zhì)中磷灰石沉積物的尺寸和結(jié)構(gòu)層次都是需要特別關(guān)注的。

此外，聚合物誘導(dǎo)的液相前驅(qū)體（polymer induced liquid precursor，PILP）理論[43]認(rèn)為聚陰離子化合物可使礦物離子形成穩(wěn)定的、具有液態(tài)性質(zhì)的ACP 液相前驅(qū)體，通過毛細(xì)作用ACP 滲入膠原纖維孔區(qū)，在特定位置成核，轉(zhuǎn)化為HAp[44]。盡管仿生再礦化肽具有一定的聚電解質(zhì)的特性，但相較于高度負(fù)電性的成核抑制劑有些再礦化肽在膠原表面誘導(dǎo)形成ACP 極不穩(wěn)定，可能再礦化早期轉(zhuǎn)化成HAp 而無法進(jìn)入膠原纖維內(nèi)部，所以對于成核抑制劑是否需要添加，種類選擇和添加比例也是要探索的。

無論是在體內(nèi)還是體外研究，再礦化肽都在水溶液中應(yīng)用[45，46]，未來還可以嘗試將再礦化肽與較溫和的酸蝕劑配合使用，并結(jié)合體內(nèi)外實驗指導(dǎo)修飾仿生再礦化多肽的序列，探索其在不同溶劑、不同的牙本質(zhì)粘接系統(tǒng)中應(yīng)用，確定最佳的應(yīng)用形式，最適濃度以及處理時間，快速高效實現(xiàn)粘接界面處再礦化提高牙本質(zhì)粘接的穩(wěn)定性和耐久性，簡化操作程序，提高臨床應(yīng)用的可行性。