兩株生防菌對華重樓主要病害的防效試驗

廖承樹，羅曉鋒，岳 濱，黃燕梅，葉 煒，喬 鋒，周建金*

（1.三明市農(nóng)業(yè)科學研究院，福建三明 365509；2.寧化縣林業(yè)局，福建三明 365400）

華重樓[Paris polyphyllavar.Chinensis（Franch.）Hara]主產(chǎn)于我國長江以南海拔500～1000 m 山區(qū)，喜陰涼濕潤氣候，是片仔癀、宮血寧、云南白藥等名貴中成藥的主要成分。隨著重樓止血、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用的不斷挖掘，應用范圍越來越廣，以致野生資源供不應求。人工種植由于生境改變，密度大，定植后灰霉病、根腐病、莖腐病等病害發(fā)生嚴重，常造成種植戶的巨大損失。傳統(tǒng)的化學農(nóng)藥防治，存在農(nóng)藥殘留影響中藥材品質(zhì)和安全、環(huán)境污染和病菌易產(chǎn)生抗藥性等問題。生防菌防治植物病害，具有安全綠色等特點，但常用的生防菌劑多為單株菌劑，容易出現(xiàn)防效不穩(wěn)定的情形[1]，且鮮見應用于華重樓病害防治的報道。本試驗擬用2 株生防菌復配，用于華重樓主要病害的防治，以期取得較好的防治效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株和華重樓品種

生防菌株T2-1、生防菌株HG、灰霉病病原灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）菌株CLG1、根腐病主要病原尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）菌株N3-1、莖腐病病原胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovorum）菌株C1-1 均由三明市農(nóng)科院藥用植物研究所分離保存；供試華重樓品種分別為福建省永安市大坪、寧化縣牙梳山野生馴化華重樓。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基用于細菌培養(yǎng)；LB液體培養(yǎng)基，pH 值7.0～7.2，用于細菌擴繁和生防菌株的分子生物學鑒定。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），用于真菌培養(yǎng)和對峙試驗（pH 值7）；PDA（冷卻到45 ℃左右）中添加（0.05 g 鏈霉素+0.25 g 氯霉素）·L-1培養(yǎng)基，用于分離土壤真菌[2]；PD 液體培養(yǎng)基用于真菌擴繁。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌的分離與鑒定

生防菌株T2-1、HG 從華重樓根系土壤分離獲得，方法為采集病害較重田塊里長勢良好的華重樓距離畦面5～10 cm深的根系土壤，混合拌勻。采用10倍稀釋法，即取10 g土樣加入90 mL無菌水中，以160 r·min-1在搖床上振蕩30 min，制備10-1的土壤初懸液，吸取1 mL初懸液于9 mL 無菌水中，制成稀釋度為10-2的土壤懸浮液，以此類推，逐級制備稀釋度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤懸液。用移液槍分別吸取100 μL 稀釋度為10-1、10-2、10-3的土壤懸液，分別均勻涂布在添加鏈霉素和氯霉素的PDA 培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，3 d 后分別挑取菌落邊緣的菌絲，接種至新的PDA 培養(yǎng)基上，重復5～6次，得到純化菌落，4 ℃保存?zhèn)溆?；分別吸取100μL稀釋度為10-4、10-5、10-6的土壤懸液，分別均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，挑取生長完整的單菌落進行純培養(yǎng)得到單菌株，4 ℃保存?zhèn)溆?。以上分離到的菌株，再分別與灰葡萄孢菌株CLG1、尖孢鐮刀菌株N3-1、胡蘿卜軟腐果膠桿菌菌株C1-1 進行平皿對峙試驗，選取抑菌性能良好的菌株，進行華重樓離體葉片創(chuàng)傷感染試驗，無致病性的菌株進一步進行形態(tài)學觀察、分子生物學鑒定。

形態(tài)學鑒定：拮抗細菌參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[3]，初步鑒定并保藏；拮抗真菌光學顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、子實體形態(tài)、顏色等特征，參照《真菌鑒定手冊》[4]，初步確定菌株的分類地位并保藏。

分子生物學鑒定：將純化后的T2-1、HG 菌株分別接種于LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，采用CTAB 法提取菌株DNA，菌株T2-1利用細菌通用引物27 F(序列5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492 R(序 列5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進行16S rDNA 的ITS 片段PCR 擴增；菌株HG 利用真菌通用引物ITSl（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ ），ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR 擴增真菌18S rDNA 的ITS 片段。20 μL PCR 反應體系為：2 ×Taq MIX 10μL，上、下游引物各1μL，菌株DNA 2μL，雙蒸水補至20μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 S，引物54 ℃退火溫度下復性30 s，72 ℃延伸40 s，共40 個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，PCR 產(chǎn)物于4 ℃下保存。利用濃度為1%瓊脂糖電泳，分別回收1400 bp、500 bp 左右的條帶，送鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對。利用MEGA 6.0 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用最大似然法（Maximum Likelihood）、鄰接距離法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 菌種擴繁與種子液、生防菌劑制備

挑取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基活化后的菌株T2-1 單菌落，在LB 液體培養(yǎng)基中28 ℃160 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，制成種子液。種子液按1∶10接種到LB 液體培養(yǎng)基中28 ℃160 r·min-1震蕩培養(yǎng)36h，調(diào)整成濃度為2×109cfu·mL-1的菌懸液；菌株HG 在PDA 活化，取直徑6 mm 的菌落邊緣菌餅5 個，加入裝有100 mL PD 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，28 ℃130 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，制成種子液。種子液按1∶10 接種到PD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃130 r·min-1振蕩培養(yǎng)7～10 d，雙層紗布濾去菌絲，血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子濃度，制成2×109個·mL-1的孢子懸液。上述菌株T2-1 菌懸液、菌株HG 孢子懸液按1∶1 等體積混勻，制備成兩種生防菌含量均為1×109cfu·mL-1的生防菌混合液（以下簡稱“生防菌劑”）。

1.2.3 生防菌菌株相容性試驗

菌株T2-1 菌懸液用無菌水稀釋10 倍，用無菌小噴壺把均勻噴至PDA 平板（pH 值7）表面，用移液槍吸取菌株HG 孢子懸液10μL，分別點接在距平板中心2 cm 的對稱兩點，28 ℃培養(yǎng)，設3 個重復，觀察抑菌圈等情況。

1.2.4 生防菌劑抑制病原菌平皿對峙試驗

取直徑6 mm 剛活化的病原菌灰葡萄孢菌CLG1 菌落邊緣菌餅，接種于PDA（pH 值7）平板中央，用移液槍在距菌餅2 cm的4個點等距離各點接生防菌劑50μL，以不加生防菌劑為對照，每個處理3 次重復，倒置培養(yǎng)。4 d后用“十”字交叉法測量菌落直徑，計算各處理的抑菌率。

尖孢鐮刀菌N3-1的試驗方法同灰葡萄孢菌CLG1。

用移液槍吸取胡蘿卜軟腐果膠桿菌C1-1 菌懸液200μL，滴至PDA（pH 值7）平板中央，用無菌玻璃涂布棒均勻涂布在PDA 平板表面。用移液槍在距平板中央2 cm 的等距離4 個點各點接生防菌劑50 μL，每個處理3 次重復，以不加生防菌劑為對照，倒置培養(yǎng)5 d，測生防菌菌落抑菌圈大小。

1.2.5 生防菌劑抑制病原菌防效小區(qū)試驗

由于華重樓是中高海拔多年生植物，盆栽試驗難度較大，一般不做。小區(qū)試驗自2021 年2 月15 日至6月15日，在永安市洋峰華重樓示范基地進行。該基地海拔1020 m，種植面積1.33 hm2，品種為永安市大坪野生馴化華重樓，土壤改良及底肥、追肥處理方法為：上述生防菌劑2 L 稀釋，均勻噴灑到1 t 華重樓專用肥（腐熟羊糞、腐熟菌渣1∶1 混合）中，混勻。底肥按3 t/667 m2撒到田土表面，混耕；追肥為0.5 t/667 m2，每年12月、4月兩次施用。將生防菌劑稀釋成一定濃度后噴施、沖施。處理1為生防菌劑濃度3×106cfu·mL-1，全株噴施，每10 d 根基部沖施10 mL/株1 次；處理2 為生防菌劑濃度5×106cfu·mL-1，全株噴施，每15 d 根基部沖施10 mL/株1 次；處理3 為生防菌劑濃度8×106cfu·mL-1，全株噴施，每20 d 根基部沖施10 mL/株1 次；以不施生防菌（基肥、追肥不添加生防菌劑，不噴施、不沖施生防菌劑）作為對照。以上每處理3 m2，重復3次，觀察結(jié)果。

1.2.6 生防菌劑抑制病原菌田間試驗

田間試驗自2022 年3 月1 日至5 月19 日，在寧化縣安遠鎮(zhèn)蘭秀家庭林場進行。該場海拔530 m，華重樓種植面積20 hm2，品種為寧化縣牙梳山野生馴化華重樓，土壤未改良，不施肥。2020 年該場曾發(fā)生嚴重的灰霉病，導致種子基本絕收，根腐病、莖腐病較為嚴重。2021年用多菌靈+百菌清噴霧，效果不夠理想，仍有近20%的發(fā)病率；通過挖深畦溝，促進排水，根腐病有一定程度緩解。由于病害較為嚴重，試驗設計為：在該場隨機選取2021 年發(fā)病情況基本類似的4 地塊，分別作為生防菌處理1、生防菌處理2、農(nóng)藥處理組、不處理（對照），每個處理33 m2，重復3 次。處理1 以生防菌劑按5×106cfu·mL-1濃度全株噴施，根基部沖施10 mL·株-1，3 月1 日起每15 d 沖施1 次，共4次；處理2 以生防菌劑按5×107cfu·mL-1濃度全株噴施，根基部沖施10 mL·株-1，3 月1 日起每15 d 沖施1次，共4 次；農(nóng)藥處理組用25%嘧菌酯60 mL/667 m2葉片、花器噴霧，4 月1 日起每15 d 沖施1 次，共2 次（除試驗地塊外，其余地塊均為此方法處理）；以不施生防菌劑作為對照（CK）。觀察、統(tǒng)計以上處理結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016 進行整理，采用SPSS 23.0軟件的Duncan新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌的鑒定結(jié)果

形態(tài)學鑒定結(jié)果：菌株T2-1菌落邊緣整齊，表面凸起有褶皺，奶白色，半透明，革蘭氏染色陽性，桿狀，內(nèi)有芽孢，卵圓形，位于菌體中央或稍偏，需氧，吲哚試驗陽性，可還原硝酸鹽，硫化氫試驗、V.P試驗陰性，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[3]，初步判定為芽孢桿菌；HG 菌株培養(yǎng)7 d 后，菌落由白色變?yōu)榘稻G色，菌絲有分隔，分生孢子梗無色，2～3 次分枝，第1分枝近直角，小梗著生分生孢子的小梗瓶形，分生孢子圓形，淡綠色，參照《真菌鑒定手冊》[4]，初步判定為木霉菌。

分子生物學鑒定結(jié)果：T2-1進行PCR擴增，得到了長度為1455 bp 的16S rRNA 基因片段，將序列在NCBI 上進行核苷酸同源性比對，結(jié)果顯示，與Bacillus_ methytrophicus_zzx25 同源性最高為99.93%，用最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1 所示，與Bacillus_methytrophicus_zzx25共聚為一支。

圖1 菌株T2-1的系統(tǒng)進化樹

HG擴增得到長度為620 bp的18S rDNA基因片段，序列NCBI 比對結(jié)果，與Triichoderma harzianum isolate AHRS 同源性最高為99%，用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2 所示，與Triichoderma harzianum isolate AHRS共聚為一支。結(jié)合形態(tài)學和分子生物學鑒定結(jié)果，T2-1為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，HG為哈茨木霉菌。

圖2 HG的系統(tǒng)進化樹

2.2 生防菌菌株相容性試驗結(jié)果

哈茨木霉菌HG 菌落與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌T2-1菌落相容性好，未見抑菌圈。這一結(jié)果表明，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌T2-1 和哈茨木霉菌HG 具有良好的相容性，可以發(fā)揮各自的特點，協(xié)同抑制病原菌。

2.3 平皿對峙試驗結(jié)果

平皿對峙試驗結(jié)果顯示，生防菌劑對華重樓主要病原真菌灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌的抑菌率在78%以上（見表1）；對重樓主要病原細菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌的抑菌圈直徑為15.5 mm，孔徑為6 mm，抑菌直徑為9.5 mm。試驗結(jié)果表明，生防菌劑在室內(nèi)平皿對峙試驗中，對華重樓主要病害的病原均具有較好的抑制作用。

表1 生防菌劑對灰霉病菌、尖孢鐮刀菌的平皿對峙結(jié)果

2.4 小區(qū)試驗結(jié)果

各小區(qū)處理防效達50%以上（見表2），與對照之間差異顯著，說明生防菌劑對華重樓主要病害防治有效；處理1、2 與處理3 結(jié)果差異顯著，說明防治效果與生防菌劑濃度具有相關(guān)性，濃度較高，效果較好；處理1 與處理2 結(jié)果差異不顯著，可能是生防菌濃度較低，雖然施用生防菌劑時間間隔更短，防效并沒有較大提升。

寵物貓在宋人生活中就更為常見了。吳自牧《夢粱錄》記載：“貓，都人畜之捕鼠。有長毛，白黃色者稱曰‘獅貓’，不能捕鼠，以為美觀，多府第貴官諸司人畜之，特見貴愛?！彼稳藢⒓邑埛譃閮纱箢悾翰妒笾垺⒉徊吨?。貓不捕鼠而受主人“貴愛”，當然是將貓當成寵物養(yǎng)了。

表2 生防菌劑不同濃度、不同施用時間間隔的防治效果

2.5 田間試驗結(jié)果

試驗結(jié)果顯示處理1、處理2與對照之間差異顯著（見表3），表明在病害較為嚴重的田間，生防菌防治華重樓主要病害仍然具有較好效果；兩個處理之間防效差異顯著，表明在病害較為嚴重的田間，加大生防菌濃度，可顯著提高防效。生防菌劑濃度差距如果縮小，或濃度減小、間隔時間同時縮短，是否仍有較好效果，值得探討。但與新型農(nóng)藥嘧菌酯對灰霉病的防效相比，新型農(nóng)藥嘧菌酯的防效明顯好于生防菌，差異顯著，且用量、施用次數(shù)少，具有明顯優(yōu)勢，這也是生防菌防治在農(nóng)戶中較難推廣的原因之一。

表3 不同濃度生防菌劑的田間防效比較

與小區(qū)試驗結(jié)果相比，田間試驗處理中，根腐病發(fā)病率較高，相同濃度處理兩者結(jié)果相差將近3 倍，可能與田間試驗土壤未經(jīng)改良處理有關(guān)。與小區(qū)對照相比，田間對照發(fā)病率較低?？赡苁墙?jīng)過兩年的流行，植株獲得一定程度的抗性。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

華重樓灰霉病為半知菌亞門灰葡萄孢屬灰葡萄孢菌引起的病害，低溫高濕季節(jié)高發(fā)（20～25 ℃、濕度90%以上易暴發(fā)，＞32 ℃或＜2 ℃不易發(fā)病[5]），以4月、5 月初為害最為嚴重?；颐共鞑パ杆?，分生孢子隨風、雨、昆蟲和農(nóng)事操作等傳播擴散，從傷口、自然孔口感染或從表皮直接侵入，病部產(chǎn)生的分生孢子可再侵染，循環(huán)多次，加重病害。外輪花被、果實、葉、莖稈均能受害，以外輪花被片、果實的癥狀最為明顯，常導致花器腐爛，種子絕收。該病病原以菌絲、分生孢子、菌核在病殘體或土壤中越冬，翌年條件合適時，菌核萌發(fā)產(chǎn)生菌絲體和分生孢子，開始新的侵染周期。

華重樓根腐病主要由尖孢鐮刀菌所致的病害，高溫高濕多發(fā)，雨水、積水可促進傳播，根莖創(chuàng)傷（線蟲、昆蟲、農(nóng)事操作等引起）后易感。發(fā)病早期地上部無癥狀，發(fā)病中期根部開始腐爛，導致植株吸收水分和養(yǎng)分的功能逐漸減弱，地上部葉片出現(xiàn)萎蔫，夜間又能恢復。后期隨著根莖腐爛加劇，地上部逐漸枯死。華重樓莖腐病是由胡蘿卜軟腐果膠桿菌引起的華重樓細菌性病害，高溫多雨季節(jié)多發(fā)。發(fā)病初期莖基部出現(xiàn)水漬狀病灶，并外溢黏稠汁液，后期液化，有惡臭。病原可由維管束傳輸，引起莖稈倒伏，葉片萎蔫，塊莖腐爛。傳統(tǒng)上使用化學農(nóng)藥防治植物病害，但化學農(nóng)藥易產(chǎn)生抗藥性。嘧霉胺（施佳樂）1994 年在法國獲得登記，僅僅兩年后就發(fā)現(xiàn)了抗藥菌株[6]。此外，農(nóng)藥施用后在土壤中的殘留量高達50%～60%，且不易降解，造成環(huán)境污染與生態(tài)破壞，影響人類健康[7]。

土壤有益微生物，尤其是根表有益微生物可作為植物抵抗土壤病原菌侵染的第一道防線，也是植物免疫系統(tǒng)的重要組成部分[14]。生防菌快速定殖，是提高其對土傳病害防治效果的重要因素之一[15]。土壤的理化性狀和微生態(tài)環(huán)境對生防菌定殖和生長具有重要影響。在小區(qū)試驗中，由于結(jié)合土壤改良，對根腐病的防治效果較田間試驗結(jié)果理想。分析其原因，可能是充分腐熟的羊糞和菌糠富含有機質(zhì)等營養(yǎng)，具有很好的疏松透氣性和保肥、保水性，能有效地改善土壤理化性狀和微生態(tài)環(huán)境，利于需氧生防菌在土壤中定殖，形成優(yōu)勢菌群，提高植株防御病害能力；而在田間試驗中，土壤未經(jīng)改良處理，不利于生防菌的定殖和擴繁，因此防治效果低于經(jīng)土壤改良的小區(qū)。

同時，還應注意到，生防菌防效會隨時間遞減。殷幼平等用菌株CQBSO3-pHY43G 在柑橘葉片噴霧接種后的0～15 d，生防菌在葉片上的數(shù)量呈現(xiàn)急劇下降趨勢，然后逐漸穩(wěn)定在較低水平[16]。原因可能是地上部定殖易受外界環(huán)境影響，如紫外線照射、氣溫、空氣濕度等，以及人工噴淋霧滴粒徑大，易從蠟質(zhì)葉面淋失，葉背（自然孔口多于葉面）不易噴施到，影響定殖效率。

3.2 結(jié)論

從小區(qū)試驗和田間試驗結(jié)果可以看出，雖然生防菌防治病害取得一定成效，但與新型化學農(nóng)藥相比，效果和使用的方便性仍有差距，會直接影響到農(nóng)戶的接受度。華重樓人工種植普遍使用遮陽棚架，是否可以把生物防治與促進華重樓生長結(jié)合起來，把噴淋系統(tǒng)（水滴大）改成在遮陽棚架上設置自動噴霧系統(tǒng)（霧滴小，懸浮性好），在晴天夜晚定時噴霧促進華重樓生長，并定期用生防菌噴霧，促進生防菌與葉背、葉面充分接觸，提高定殖效率，向葉片和土壤補充生防菌，避免人工噴施作業(yè)易損傷莖葉、封壟后操作困難、不易定殖（霧滴粒徑過大易滑落，與葉片接觸時間短）等弊端，還可在生防菌劑中加入紫外線保護劑、穩(wěn)定劑等，以及結(jié)合土壤改良、減少環(huán)境不良因素影響，防止生防菌遞減過快，以期保證防效的穩(wěn)定性和提高施用的便利性，可在相關(guān)研究中進一步探討。

生防菌哈茨木霉菌HG和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌T2-1 具有協(xié)同作用，對華重樓主要病害具有較好的防治效果，可用于中藥材病害的綠色防控，減少農(nóng)藥使用和殘留，提高中藥材的質(zhì)量，保障人類使用中藥的安全。如結(jié)合土壤改良等措施，可取得更為理想的防效，具有應用于生物防治華重樓主要病害的潛力。