枸杞子治療干眼癥的作用靶點及相關(guān)機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

高青 龐慶寶 孫河

干眼癥又被稱為角結(jié)膜干燥癥，是以淚膜失衡和伴隨眼部癥狀為特征的多因素眼表疾病，其中淚膜不穩(wěn)定和高滲透性，眼表炎癥和損傷及感覺神經(jīng)異常在發(fā)病機制中起重要作用[1]。臨床表現(xiàn)主要有眼部干澀、燒灼感、異物感、刺激感、畏光、眼紅、視力下降、視物模糊、視力波動、視久疲勞、眼癢、流淚或視物的清晰度下降等。國際調(diào)查顯示干眼發(fā)病率為7%～33%，其中女性、老年人、亞洲人均為高發(fā)人群[2]，干眼癥已被列為全球流行性疾病[3]，在我國的發(fā)病率也達21%～30%[4]。目前西醫(yī)治療干眼癥主要有人工淚液、抗炎和免疫抑制劑、性激素替代、抗生素、手術(shù)等方法，但是均可產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)或依賴性[5]。因此越來越多的學(xué)者關(guān)注中醫(yī)治療干眼癥。

枸杞子作為藥食同源的一味中藥，已有3 千多年的歷史，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“味平、性甘，歸肝、腎、肺經(jīng)”，具有養(yǎng)肝滋腎，益精明目，潤肺止咳的功效。枸杞子含有枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）、類胡蘿卜素、甜菜堿、枸杞總黃酮（Total flavonoids of Lycium barbarum，TFLB）、氨基酸、微量元素及其他成分。研究發(fā)現(xiàn)枸杞子具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗炎殺菌、降壓、降脂、降糖、保肝、明目、保護神經(jīng)等作用，甚至還能雙向調(diào)節(jié)免疫[6]。枸杞子對干眼癥的治療效果可能是通過控制一系列血清蛋白和信號通路來調(diào)節(jié)淚腺分泌和淚液生成[6]。盡管枸杞子含有多種已知成分，但其治療干眼癥的有效物質(zhì)和作用機制尚未清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要應(yīng)用生物學(xué)、生物信息技術(shù)、生物網(wǎng)絡(luò)分析等知識揭示藥物多成分、多靶點、多疾病之間的有效作用機制。它強調(diào)藥物與疾病之間的系統(tǒng)和整體關(guān)系，與古代中醫(yī)基礎(chǔ)理論的“整體觀念”一致[7]。本研究主要利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)尋找枸杞子治療干眼癥的有效物質(zhì)、關(guān)鍵靶點和信號通路的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 枸杞子活性成分和靶點的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫中（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），將“枸杞子”作為關(guān)鍵詞，篩選條件設(shè)為“藥物靶點”，篩選口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30.00%且類藥性（Drug like，DL）≥0.18的成分，獲得枸杞子中的活性成分及相關(guān)靶點。

1.2 枸杞子治療干眼癥相關(guān)靶點篩選

在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中，將“Dry eye”作為關(guān)鍵詞，挖掘與干眼癥相關(guān)的基因靶點，刪除重復(fù)值后整理數(shù)據(jù)，通過Venny工具將枸杞子與干眼癥的相關(guān)靶點取交集并繪制Venny圖，交集基因即關(guān)鍵基因。

1.3 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析

將干眼癥和枸杞子的交叉靶點數(shù)據(jù)輸入Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建“疾病-中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。不同的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點分別代表干眼癥、中藥枸杞子、枸杞子的有效成分以及干眼癥和枸杞子的共同靶點；節(jié)點之間的連接線代表相互關(guān)系和影響。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點篩選

將干眼癥和枸杞子的共同靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org），限定物種為“Homo sapiens”，其余均為默認設(shè)置，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件進行可視化分析：去除游離節(jié)點，使用CentiScape 中“度中心性（Degree centrality，DC）”算法計算degree值（D值）評估網(wǎng)絡(luò)中基因節(jié)點的重要性，篩選 PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點，選取D值前9位的基因作為核心基因并進行可視化。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

使用R編程語言對上述過程中獲得的交叉靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，選取閾值P＜0.05的結(jié)果。根據(jù)輸出結(jié)果，分析枸杞子治療干眼癥的可能機制。

2 結(jié)果

2.1 枸杞子中有效成分的篩選

經(jīng)過嚴格篩選，共檢索到31 個枸杞子活性成分。其中15個活性成分見表1。

表1.枸杞子的15個活性成分Table 1.Fifteen active ingredients of Lycium barbarum

2.2 枸杞子治療干眼癥相關(guān)靶點的預(yù)測結(jié)果

總共收集到50個枸杞子活性成分靶點和875個干眼癥靶點，獲得枸杞子和干眼癥靶點之間的交集，并構(gòu)建了一個維恩圖，其中包含總共45個相交靶點。

2.3 “疾病-中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

如圖1所示，圖中紫色三角形代表中藥枸杞子，紅色菱形代表干眼癥，綠色方形代表枸杞子的有效成分，藍色圓形代表中藥枸杞子和干眼癥的共同靶點。枸杞子主要通過31種有效成分作用于45個靶點，反映了枸杞子治療干眼癥的多成分、多靶點作用。其中槲皮素、β-谷甾醇、黃豆黃素和豆甾醇的D值最高，是枸杞子治療干眼癥的主要活性成分。

圖1.枸杞子治療干眼癥“疾病-中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖紫色三角形代表中藥枸杞子，紅色菱形代表干眼癥，綠色方形代表枸杞子的有效成分，藍色圓形代表中藥枸杞子和干眼癥的共同靶點。連接每個節(jié)點的直線表示節(jié)點之間存在調(diào)節(jié)關(guān)系Figure 1.＂Disease-herbal-component-target＂ network diagram of Lycium barbarum for dry eyeThe purple triangle represents the herbal Lycium barbarum,the red diamond represents the dry eye disease,the green square represents the active ingredient of Lycium barbarum,and the blue circle represents the common target of the herbal Lycium barbarum and the dry eye disease.The straight line connecting each node indicates the existence of a regulatory relationship between the nodes.

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果

在STRING數(shù)據(jù)庫中輸入45 個共同靶點，獲得蛋白相互作用的關(guān)系，并繪制關(guān)鍵基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2），PPI網(wǎng)絡(luò)最終包含45個節(jié)點和403條邊緣，節(jié)點平均度值為17.9。有20 個節(jié)點度值高于平均水平，應(yīng)將其視為關(guān)鍵核心靶點。根據(jù)“接近中心”原則，用Cytoscape 3.9.0繪制45個節(jié)點；節(jié)點的顏色與節(jié)點對網(wǎng)絡(luò)的貢獻呈正相關(guān)。從圖3 可以看出，接近中心的高值靶蛋白包括缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-inducible factors，HIF1A）、表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、骨髓細胞瘤病病毒性腫瘤基因（Myelocytomatosis viral oncogene，MYC）、血管內(nèi)皮生長因子 A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、半胱天冬酶-3（Cystathione-3，CASP3）、細胞周期蛋白D1（Cell cycle protein D1，CCND1）、受體酪氨酸蛋白激酶erbB-2（Receptor tyrosine protein kinase erbB-2，ERBB2）、過氧化物酶體增殖物激活的受體γ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、低聚果糖（Fructo oligosaccharide，F(xiàn)OS）、NF-kappa-B 抑制劑α（NF-kappa-B inhibitor alpha，NFKBIA）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cysteine aspartate protease，CASP8）等。這些是PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵核心靶點，因此可能在枸杞子治療干眼癥中發(fā)揮重要作用。圖3中節(jié)點表示蛋白，邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián)性。D值排名靠前12的蛋白，依次為HIF1A、EGFR、IL-6、MYC、VEGFA、CASP3、CCND1、ERBB2、PPARG、FOS、NFKBIA、CASP8（見表2）。

圖2.枸杞子治療干眼的關(guān)鍵基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2.Protein interactions network map of key genes in Lycium barbarum for the treatment of dry eyes

圖3.枸杞子治療干眼的關(guān)鍵靶點度值網(wǎng)絡(luò)圖節(jié)點的顏色和大小反映度值。圖中的節(jié)點越大、顏色越紅，DC值越大Figure 3.Network diagram of the degree values of the key targets of Lycium barbarum for the treatment of dry eyesThe color and size of the nodes reflect the degree value.The larger and redder was the node in the graph,the larger was the DC value.DC,degree centrality.

表2.靶蛋白的網(wǎng)絡(luò)拓撲特性（D≥24）Table 2.Network topology properties of target proteins(D≥24)

2.5 GO功能富集分析

通過GO功能富集分析，共獲得生物過程71個，主要涉及DNA轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性，RNA聚合酶II特異性、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性、box結(jié)合蛋白過程、凋亡過程的負調(diào)控、細胞增殖的正調(diào)控、炎性反應(yīng)、基因表達的正調(diào)控等，其中表3所示為靶點數(shù)＞5的生物過程。以上結(jié)果表明，枸杞子通過對這些生物分子的調(diào)節(jié)來治療干眼癥。

表3.“枸杞子-干眼癥”的GO分析結(jié)果Table 3.Results of GO analysis for “Lycium barbarum-dry eye disease”

2.6 KEGG通路富集分析

枸杞子與干眼癥的45個相關(guān)靶點涉及97條信號通路，包括脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路、化學(xué)致癌-受體激活通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路、PI3K-Akt信號通路、癌癥中的蛋白多糖通路、人巨細胞病毒感染通路、微小RNA與癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、p53信號通路等。因此，枸杞子可能通過相關(guān)靶點調(diào)節(jié)這些信號通路對干眼癥產(chǎn)生影響（見表4）。

表4.枸杞子KEGG靶點通路富集結(jié)果（靶點＞10）Table 4.KEGG target pathway enrichment results (targets＞10)

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析中藥枸杞子治療干眼癥的藥理機制，發(fā)現(xiàn)枸杞子的45 種活性成分當中有31 種活性成分與干眼癥有關(guān)，其中關(guān)鍵活性成分為總黃酮類化合物和類固醇化合物，包括槲皮素、黃豆黃素、β-谷甾醇、豆甾醇等。本研究采用PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)進行核心網(wǎng)絡(luò)的篩選，收集到枸杞子治療干眼癥的29 個關(guān)鍵靶點，包括HIF1A、EGFR、IL-6、MYC、VEGFA、CASP3、CCND1、ERBB2、PPARG、FOS、NFKBIA、CASP8 等。其中HIF1A、EGFR、IL-6、VEGFA、CASP3、PPARG可能在治療中發(fā)揮主要作用。同時，本研究通過GO功能富集分析，共獲得生物過程71個，分析得出枸杞子可能是通過對激素的反應(yīng)、細胞凋亡、上皮細胞增殖、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細胞對應(yīng)激的反應(yīng)、對細胞因子的反應(yīng)等生物學(xué)過程治療干眼癥，大多數(shù)基因可富集到癌癥通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、化學(xué)致癌-受體激活、卡波西肉瘤相關(guān)性皰疹病毒感染、PI3K-Akt、NF-kappa-B、VEGF、AGE-RAGE等信號通路。

研究已發(fā)現(xiàn)黃酮醇類物質(zhì)主要有免疫調(diào)節(jié)、降血糖（抑制α-葡萄糖苷酶等）、抗菌、抗炎、降血脂、抗氧化[8-9]、快速清除體內(nèi)自由基等生物活性，可有效抑制IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌[10]，還可以抗衰老（抑制膽堿酯酶）、抗病毒[11]。槲皮素作為黃酮醇類物質(zhì)的代表之一，還能抗新生血管生成，抗菌以金黃色葡萄球菌（引起眼表炎癥的重要細菌之一）為主[12]，是一種治療干眼癥的有效成分。徐小娟等[13]認為槲皮素在體內(nèi)外均可抑制腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移，從而誘導(dǎo)發(fā)生凋亡、自噬。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素除了能夠直接抑制mTOR的活性，還能激活PI3K-Akt信號通路起到抗癌效果[14]。而PI3K-Akt是參與細胞的增殖、分化、凋亡的重要通路，在腫瘤、心血管、糖尿病等方面均有影響[15]；該通路還參與細胞轉(zhuǎn)化過程，能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以及炎癥反應(yīng)。類固醇化合物β-谷甾醇也能抑制腫瘤生長、促腫瘤細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫和抗氧化[16-18]。豆甾醇可以調(diào)節(jié)血脂，降低循環(huán)系統(tǒng)疾病的風(fēng)險，還可抑制NF-KB信號通路而起到抗炎作用[19]。

HIF1A是缺氧信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中樞，可影響細胞的增生、自噬、凋亡過程，還可調(diào)控免疫細胞和促炎性因子（如白介素）的表達[20]。EGFR通過調(diào)控細胞的增殖、分化，在淚液中穩(wěn)定眼表的內(nèi)環(huán)境，可影響干眼的發(fā)生、發(fā)展[21]。IL-6作為一種促炎性因子，可加劇炎癥反應(yīng)，破壞上皮細胞蛋白的表達，誘導(dǎo)上皮細胞凋亡，升高淚液滲透壓[22]，使得淚膜不穩(wěn)定或破壞。有研究發(fā)現(xiàn)干眼患者淚液中和角膜上皮均測出IL-6等炎性因子的水平增加[23]，因此IL-6 的大量釋放可誘發(fā)炎癥反應(yīng)，引起干眼癥狀。VEGFA作為影響角膜損傷[24]的重要蛋白，可因糖尿病晚期糖基化而發(fā)生角膜神經(jīng)病變[25]，淚腺分泌受到抑制，患者出現(xiàn)干眼癥狀，由此可推測枸杞子治療干眼癥可能與抑制角膜上皮損傷相關(guān)。另外，VEGFA能影響血管通透性、炎癥刺激和產(chǎn)生新生血管，促使炎癥反應(yīng)形成并形成惡性循環(huán)[26]。王超群等[27]實驗檢測發(fā)現(xiàn)CASP3和CASP8在干眼模型的結(jié)膜上皮細胞中均升高，說明這2個指標可能與干眼癥的發(fā)生有關(guān)。由此可推斷枸杞子能夠通過抑制細胞凋亡而治療干眼癥。RAGE分布于眼部組織的巨噬細胞及內(nèi)皮細胞中，在應(yīng)激狀態(tài)下，AGE與RAGE結(jié)合，激活多種細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激，破壞相關(guān)蛋白，可引起更大的炎癥反應(yīng)[28]。

目前干眼癥的發(fā)生主要是各種刺激（應(yīng)激反應(yīng)、激素失衡和神經(jīng)機能障礙）影響正常的眼表修復(fù)和防御功能，導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)定、淚腺和眼表組織呈慢性炎癥狀態(tài)[29]。各種炎性因子釋放，激活不同的信號通路，細胞核接收訊號，從而調(diào)控相關(guān)基因、蛋白的表達，最終影響細胞的生長、發(fā)育和功能。本研究通過查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻，構(gòu)建成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，對枸杞子治療干眼癥的關(guān)鍵靶點及通路進行了初步歸納、分析，推測枸杞子可能是通過對EGFR、IL-6、VEGFA、CASP3等基因的影響，以及對癌癥通路、PI3K-Akt、NF-kappa-B、VEGF、AGE-RAGE等信號通路的調(diào)控，抑制炎癥因子釋放，減少細胞凋亡，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，改善血液循環(huán)及氧代謝，改善干眼癥患者的主觀癥狀及臨床指標。根據(jù)對干眼癥關(guān)鍵基因的富集，發(fā)現(xiàn)在諸多通路中，NF-kappa-B通路起到重要作用，核轉(zhuǎn)錄因子（Nuclear transcription factor-kB，NF-kB）激活后可抑制因為各種不良因素損傷細胞而產(chǎn)生的促細胞凋亡過程。該通路能影響細胞的無限增殖和抗凋亡，調(diào)控炎癥及免疫表達，另外激活NF-KB可抑制TNF-α引起的細胞凋亡[30]。當NF-KB激活后，調(diào)控細胞因子轉(zhuǎn)錄，反過來炎性因子表達的增強又進一步增強NF-KB活性，引起炎癥加重[31]。此外，眼表上皮結(jié)構(gòu)破壞，也可引起細胞凋亡的發(fā)生，故干眼癥的發(fā)生可能與炎癥及細胞凋亡均有關(guān)系。

通過本研究可知中藥枸杞子能夠通過其活性成分針對多靶點、多通路聯(lián)合作用的機制來治療干眼癥。本研究可為枸杞子治療干眼癥提供一定依據(jù)，為將來的進一步實驗研究提供方向，也可為臨床治療干眼癥的復(fù)方配伍提供思路。后續(xù)基于本研究結(jié)果，將對篩選出的相關(guān)靶點和信號通路繼續(xù)開展細胞及動物水平的研究驗證。

利益沖突申明無任何利益沖突

作者貢獻聲明高青：收集數(shù)據(jù)；參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。龐慶寶：參與選題、設(shè)計、資料的分析和解釋；修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論；根據(jù)編輯部的修改意見進行核修。孫河：參與選題、設(shè)計和修改論文的結(jié)果、結(jié)論