CD146在視網(wǎng)膜血管內皮細胞中的功能和機制

林永 楊汝森 閆東升 陳曉燕 呂帆

病理性新生血管是許多致盲性眼病的共同特征之一。目前臨床主要采用激光光凝術和玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子（anti-vascular endothelial growth factor，anti-VEGF）治療相關疾病[1]，其中常用的anti-VEGF藥物包括貝伐單抗、雷尼珠單抗[2]。盡管anti-VEGF的使用能夠有效緩解病情，但部分患者治療無效[3]，以及治療是否會對神經(jīng)發(fā)育造成影響仍然存在爭議[4]。因此，研究治療視網(wǎng)膜新生血管的新靶點具有重大意義。

黑色素瘤細胞黏附分子又稱細胞分化抗原146（Cluster of differentiation 146，CD146）屬于免疫球蛋白超家族，是一種約為113 kDa的細胞表面糖蛋白，最早因在人原發(fā)性黑色素瘤中高表達而被發(fā)現(xiàn)。研究表明，CD146的表達異常還與其他腫瘤有關，如前列腺癌[5]、乳腺癌[6]等。CD146 基因位于人染色體第11號長臂，CD146蛋白結構由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質尾區(qū)組成，其中胞質尾區(qū)具有蛋白激酶的潛在識別位點，與蛋白激酶結合后可參與信號轉導[7]。有研究表明CD146除了是細胞黏附分子，同時也作為血管內皮細胞生長因子受體2（Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）的共受體，在許多生理和病理性血管生成過程中發(fā)揮重要作用[8]。但到目前為止，CD146對視網(wǎng)膜血管內皮細胞的調節(jié)作用及其機制尚未完全明了，故本研究旨在探索CD146 在視網(wǎng)膜血管內皮細胞中的作用和機制，為視網(wǎng)膜新生血管相關疾病的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗細胞

2021 年1—6 月C57BL/6J孕鼠6 只購于上海維通利華公司。實驗動物的飼養(yǎng)遵循溫州醫(yī)科大學動物倫理委員會要求（批號：Wydw-2019-0316）。人視網(wǎng)膜微血管內皮細胞（Human retinal microvascular endothelial cells，HRMEC）購于美國Angio-Proteomie公司。

1.2 實驗試劑與儀器

胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、內皮細胞培養(yǎng)基（Endothelia cell medium,ECM）購于美國Sciencell 公司；0.05%胰酶、轉染試劑（LipofectamineTM RNAi MAX Reagent）購于美國Invitrogen公司；體內轉染試劑（Polyethylenimine，PEI）購于美國Polyplus transfection公司；小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）購于廣州銳博生物公司；細胞活力分析試劑購于美國Promega公司；細胞增殖檢測試劑盒Click-iT? EdU imaging kits購于美國Invitrogen公司；細胞周期檢測試劑盒Cycle test plus購于美國BD公司；Matrigel基質膠購于BD公司；BCA試劑盒購于美國Thermo公司；p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）、磷酸化p38（Phospho-p38 MAPK，P-p38）、Ras同源家族成員A（Ras homolog gene family member A，RHOA）、β-肌動蛋白（β-Actin）抗體購于美國Cell signal technology公司；CD146抗體購于美國Abcam公司；硝酸纖維素膜購于德國GE Healthcare公司。實時定量PCR儀購于美國ABI公司；流式細胞儀購于美國BD公司；SpectraMax M5酶標儀購于美國Molecular Devices公司；激光共聚焦顯微鏡購于日本蔡司公司；手術顯微鏡購于德國徠卡公司；動物氧倉、細胞氧倉和氧氣監(jiān)測器均購于Biospherix公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及細胞缺氧處理 HRMEC培養(yǎng)于含5% FBS、內皮細胞生長因子（Endothelial cell growth supplement，ECGS）、青霉素/鏈霉素的ECM培養(yǎng)液中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)，90%融合時用0.05%胰酶消化，1:4傳代，培養(yǎng)至對數(shù)生長期進行后續(xù)實驗。細胞置于細胞缺氧培養(yǎng)箱，1% O2、5% CO2、37 ℃培養(yǎng)，進行缺氧處理。

1.3.2 siRNA轉染 將細胞接種于12 孔板中，待細胞融合50%～60%時，250 μl OPTI-MEM中加入1.5 μl LipofectamineTM RNAi MAX Reagent和5 μl siRNA，室溫靜置15 min后加入孔板中 。轉染12 h后，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)進行后續(xù)實驗。為防止脫靶效應，設計2條siRNA鏈，siRNA的序列為：CD146-1：5'-CCA TCT CCT GGA ACG TCA A-3'；CD146-2：5'-GCA CCT CCA CAG AGA GAA A-3'。NC：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'。

1.3.3 細胞增殖相關實驗 細胞活力測定：取96孔板，每孔接種3×103個細胞，siRNA轉染培養(yǎng)48 h后，加入細胞活力檢測試劑，37 ℃避光孵育2 h，酶標儀490 nm波長測量每孔的吸光度值（Optical density，OD）。細胞增殖實驗：細胞轉染48 h后用Click-iT?EdU imaging kits試劑對細胞進行免疫熒光染色，檢測細胞的增殖情況。細胞周期實驗：細胞轉染48 h后用0.05%胰酶消化，棄上清，加入Cycle test plus試劑盒中的試劑染色，用細胞流式儀分析細胞周期。以上實驗均重復3次。

1.3.4 細胞遷移相關實驗 劃痕實驗：將細胞接種于12孔板，siRNA轉染48 h后，用100 μl無菌槍頭進行劃痕并改用低濃度血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。顯微鏡下拍照分別記錄0 h和24 h的劃痕寬度，計算細胞遷移面積。Transwell實驗：siRNA轉染細胞48 h后消化并計數(shù)，每個transwell小室內接種2.5×104個細胞，24 h后固定、染色，顯微鏡下拍照記錄遷移的細胞數(shù)。以上實驗重復3次。

1.3.5 血管生成實驗 96孔板內每孔加入Matrigel基質膠，置于37 ℃直到基質膠凝固。將siRNA轉染后的細胞消化并計數(shù)。2×104個細胞每孔加入鋪好膠的96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4～6 h，顯微鏡下觀察血管形成情況，并拍照記錄。以上實驗重復3次。

1.3.6 OIR模型構建 氧誘導視網(wǎng)膜病變（Oxygen induced retinopathy，OIR）模型是視網(wǎng)膜新生血管相關研究的最常用動物模型，C57BL/6J小鼠出生后第7天（Postnatal 7，P7）連同母鼠一起放入75%±2%O2飼養(yǎng)倉飼養(yǎng)，每日更換母鼠，出生后第12 天（Postnatal 12，P12）放置到常氧環(huán)境（21% O2）中繼續(xù)飼養(yǎng)，在出生后第17天（Postnatal 17，P17）小鼠視網(wǎng)膜新生血管數(shù)量達到峰值，取該時期小鼠進行進一步實驗。

1.3.7 免疫磁珠法分離小鼠視網(wǎng)膜血管內皮細胞按照本實驗室分離的方法[9]進行操作。

1.3.8 免疫熒光染色 OIR小鼠及其正常對照小鼠各4只飼養(yǎng)至P17，取眼球包埋、液氮速凍。冰凍切片機切片后進行固定、通透、封閉。CD146（1:100）和GS-ib4（1:100）4 ℃孵育過夜。熒光二抗室溫避光孵育1 h（1:400），PBS清洗二抗，滴上含DAPI的熒光抗淬滅劑，封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.3.9 玻璃體腔注射和視網(wǎng)膜鋪片 取P13的OIR小鼠，用PEI配置siRNA后，在手術顯微鏡下右眼注射siCD146（100 μmol/L）2μl，左眼注射等量無意義小干擾RNA溶液作為對照。小鼠飼養(yǎng)至P17，取眼球，4%多聚甲醛室溫固定1 h，體式顯微鏡下分離視網(wǎng)膜，甲醇通透。PBS清洗后，加入GS-ib4染色劑（1:100），4 ℃避光孵育過夜。PBS清洗后，鋪片、封片、熒光顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管。注射siRNA序列如下：siCD146：5'-CCG AGT TCA TAT CCA GTC A -3'；NC：5'-GGC TCT AGA AAA GCC TAT -3'。

1.3.10 Western blot檢測蛋白 用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞或組織，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，99 ℃變性。10 μg蛋白上樣進行聚丙烯凝膠電泳，300 mA恒流1.5 h轉膜至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，熒光二抗室溫避光孵育1 h，曝光獲得目的條帶。用Image J軟件對條帶進行灰度值分析。抗體和稀釋倍數(shù)如下：CD146（1:1 000）、P-p38（1:1 000）、p38（1:1 000）、RHOA（1:1 000），β-Actin（1:1 000）作為內參。

1.3.11 RNA收集和定量PCR 用Trizol法提取細胞和組織中的RNA，測濃度后，取1 μg RNA進行逆轉錄合成cDNA，取1 μl cDNA作為模板，加入靶基因上下游引物，用定量PCR儀進行擴增。各引物序列見表1。

表1.引物序列Table 1.Sequences of primers

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗研究。采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。各組實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，以表示。組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD146在小鼠視網(wǎng)膜和HRMEC中的表達

P17正常和OIR小鼠的視網(wǎng)膜切片免疫熒光染色結果顯示，CD146和視網(wǎng)膜血管共染，見圖1A。Western blot結果顯示，OIR小鼠視網(wǎng)膜中CD146的蛋白表達是正常小鼠的2倍（t=5.62，P=0.001），見圖1B。用免疫磁珠法分離P17 正常和OIR小鼠視網(wǎng)膜的血管內皮細胞，定量PCR結果顯示，OIR組小鼠視網(wǎng)膜血管內皮細胞中CD146 mRNA表達水平是正常小鼠的2 倍（t=6.57，P=0.003），見圖1C。為了進一步探究缺氧對視網(wǎng)膜血管內皮細胞中CD146 表達的影響，將HRMEC置于1% O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，Western blot結果顯示，缺氧環(huán)境中HRMEC上的CD146 表達是正常組的2 倍（t=5.79，P=0.010），見圖1D。

圖1.CD146在小鼠視網(wǎng)膜和HRMEC中的表達情況A：免疫熒光染色檢測CD146 在正常小鼠和OIR小鼠視網(wǎng)膜上的表達，其中紅色為視網(wǎng)膜血管GS-ib4染色，綠色為CD146染色，藍色為DAPI染色細胞核，比例尺：50 μm。B：Western blot檢測P17正常小鼠和OIR小鼠視網(wǎng)膜中CD146蛋白的表達，β-Actin作為內參。C：定量PCR檢測P17正常小鼠和OIR小鼠視網(wǎng)膜血管內皮細胞中CD146 mRNA的表達情況（n=4；b，與正常小鼠比，P＜0.01）。D：缺氧環(huán)境下Western blot檢測HRMEC中CD146蛋白表達Figure 1.The expression of CD146 in mouse retina and HRMECA: Immunofluorescent staining detected the expression and location of CD146 in retinal sections of OIR and normal mice at P17,red was GS-ib4 stain for vascular,green was CD146 staining,blue was DAPI stain for nucleus,scale bar was 50 μm.B: Western blot assay determined the protein expression of CD146 in OIR and normal mouse retina,β-Actin was used as the internal reference.C: Real-time quantitative PCR detected the mRNA level of CD146 in isolated mouse retinal endothelial cells of OIR and normal mice at P17 (n=4;b,compared with the normal mice,P＜0.01).D:Western blot detected the protein expression of CD146 in HRMEC under hypoxic conditions.OIR,oxygen induced retinopathy;CD146,cluster of differentiation 146;HRMEC,human retinal microvascular endothelial cells.

2.2 CD146對HRMEC的活力、增殖、周期的影響

為了防止脫靶效應，設計2條不同的siRNA鏈（siCD146-1 和siCD146-2）轉染細胞，敲減CD146蛋白表達。Western blot和定量PCR結果顯示，CD146的表達下降60%以上（siCD146-1：t=5.70，P=0.005；siCD146-2：t=5.92，P=0.004），見圖2A—B。MTS、EDU和流式細胞術結果顯示：與NC組相比，siCD146-1和siCD146-2的細胞活力（siCD146-1：t=0.09，P=0.931；siCD146-2：t=0.13，P=0.903）、增殖（siCD146-1：t=0.09，P=0.931；siCD146-2：t=0.29，P=0.781）和細胞周期（G1：siCD146-1：t=0.28，P=0.791；siCD146-2：t=0.35，P=0.741。G2：siCD146-1：t=1.87，P=0.134；siCD146-2：t=2.29，P=0.083。S：siCD146-1：t=0.27，P=0.798；siCD146-2：t=0.20，P=0.845）均無明顯變化，見圖2C—E。

圖2.CD146對HRMEC的細胞活力、增殖和細胞周期的影響A：Western blot檢測CD146在siRNA轉染的HRMEC中的敲減效率。B：定量PCR檢測siCD146在HRMEC中的敲減效率；b，與陰性對照組比，P＜0.01。C：EDU實驗檢測siCD146組和NC組中細胞增殖情況，紅色為EDU染色，藍色為DAPI細胞核染色，比例尺：100 μm。D：MTS檢測細胞活力。E：流式細胞術檢測siCD146組和NC組的細胞周期。G1，DNA合成前期；S，DNA合成期；G2，DNA合成后期Figure 2.The effect of siCD146 on MTS,EDU and the cell cycleA: Western blot assay determined the protein expression of CD146 in HRMEC after CD146 and NC siRNA transfection.B: Real-time quantitative PCR detected the mRNA level of CD146 in siCD146 groups and NC groups.b,compared with the regative control,P＜0.01.C: EDU assay detected the ability of HRMEC proliferation,red was EDU stain for proliferating cells,blue was DAPI stain for nucleus,scale bar was 100 μm.D: MTS assay tested HRMEC viability.E: Flow cytometry determined the cell cycle of siCD146 and siNC groups.G1,first gap;S,synthesis;G2,second gap;CD146,cluster of differentiation 146;HRMEC,human retinal microvascular endothelial cells;OD,optical density;NC,negative control.

2.3 CD146對HRMEC遷移和血管形成的影響

劃痕實驗結果顯示，與NC組相比，siCD146轉染組細胞的遷移面積明顯減少（siCD146-1：t=2.73，P=0.041；siCD146-2：t=4.10，P=0.006），見圖3A；遷移特異性實驗即Transwell實驗進一步顯示，與NC組相比，siCD146 轉染組遷移到下室的細胞數(shù)量明顯減少（siCD146-1：t=6.15，P=0.003；siCD146-2：t=3.88，P=0.005），見圖3B。血管形成實驗結果顯示，與NC組相比，siCD146轉染組血管形成能力明顯減弱（siCD146-1：t=2.81，P=0.048；siCD146-2：t=3.10，P=0.036），見圖3C。

圖3.CD146對HRMEC遷移和血管形成的影響A：劃痕實驗檢測細胞遷移情況；B：Transwell實驗檢測細胞遷移情況；C：血管形成實驗檢測細胞的血管生成能力。比例尺：50 μmFigure 3.The effects of CD146 on the ability of migration and tube formation of HRMECA: Scratch assay tested the effects of CD146 knockdown on HRMEC migration.B: Migratory specific transwell assay further determined the migratory ability in the CD146 siRNA transfected HRMECs.C: The matrigel-based angiogenesis assay tested the effects of CD146 on tube formation.Scale bar was 50 μm.CD146,cluster of differentiation 146;HRMEC,human retinal microvascular endothelial cells;NC,negative control.

2.4 CD146對HRMEC中遷移相關蛋白的影響

CD146 敲減可以明顯抑制HRMEC的遷移和血管形成，故本研究采用定量PCR檢測遷移及血管生成相關的基因，結果顯示VEGF（siCD146-1：t=5.15，P=0.007；siCD146-2：t=5.97，P=0.004）和RHOA（siCD146-1：t=2.95，P=0.042；siCD146-2：t=2.89，P=0.046）的mRNA水平在siCD146 轉染組中明顯下調，見圖4A。Western blot進一步檢測蛋白及相關通路蛋白結果顯示，與NC 組相比，siCD146轉染組中RHOA（siCD146-1：t=3.60，P=0.023；siCD146-2：t=4.12，P=0.015）和P-p38（siCD146-1：t=2.89，P=0.044；siCD146-2：t=3.07，P=0.038）表達均下調，見圖4B。

圖4.CD146對HRMEC中血管生成和遷移相關蛋白的影響A：定量PCR檢測血管內皮細胞遷移、血管生成相關的基因；B：Western blot檢測siCD146轉染后對HRMEC中RHOA和P-p38蛋白的影響。a，與NC組相比，P＜0.05；b，與NC組相比，P＜0.01Figure 4.The effects of CD146 on the expression of angiogenesisrelated proteins in HRMECA: Quantitative PCR determined the expression of angiogenesis-related gene.B: Western blot detected RHOA protein,P-p38 protein expression in HRMEC after CD146 and NC siRNA transfection.P-p38,phospho-p38 MAPK;RHOA,ras homolog gene family member A;CD146,cluster of differentiation 146;HRMEC,human retinal microvascular endothelial cells;NC,negative control.a,compared with the control,P＜0.05;b,compared with the control,P＜0.01.

2.5 玻璃體腔注射siCD146 對小鼠視網(wǎng)膜新生血管的影響

本研究采用小鼠玻璃體腔注射siRNA方法進行視網(wǎng)膜中CD146的敲減。OIR模型制作后，在小鼠P13 對右眼玻璃體腔內注射siCD146，左眼注射無意義小干擾PNA作為對照組NC。定量PCR檢測注射效率顯示，與左眼相比，右眼中CD146 mRNA表達下調50%（t=7.48，P=0.005），見圖5A。視網(wǎng)膜鋪片結果顯示，siCD146注射組的視網(wǎng)膜新生血管明顯減少（t=8.94，P=0.001），無血管區(qū)也減少（t=11.24，P=0.001），見圖5B。視網(wǎng)膜蛋白Western blot顯示，與NC組相比，注射siCD146組中的CD146（t=5.62，P=0.030）、P-p38（t=6.87，P=0.021）、RHOA（t=5.06，P=0.037）表達均下調，見圖5C。

圖5.CD146敲減對OIR小鼠視網(wǎng)膜新生血管的影響A：定量PCR檢測玻璃體腔注射NC組和CD146 siRNA的效率（n=5，b，與對照組相比，P＜0.01）；B：玻璃體腔注射siCD146 后，OIR小鼠P17視網(wǎng)膜血管鋪片圖，比例尺：500 μm；C：Western blot檢測視網(wǎng)膜中RHOA、P-p38和p38蛋白的表達Figure 5.CD146 knockdown alleviated OIR retinal neovascularizationA: Quantitative PCR detected the efficiency of vitreous injection of CD146 siRNA (n=5;b,compared with NC,P＜0.01).B: Retinal flat-mount images,scale bar was 500 μm.C: Western blot detected RHOA protein,P-p38 and p38 protein expression in the retina.P-p38,phospho-p38 MAPK;RHOA,ras homolog gene family member A;CD146,cluster of differentiation 146;OIR,oxygen induced retinopathy;NC,negative control.

3 討論

CD146是已知的腫瘤新生血管的重要標記物，在各種腫瘤新生血管的發(fā)生、發(fā)展中都發(fā)揮著重要的作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)CD146 在視網(wǎng)膜血管中特異性表達，而在視網(wǎng)膜的其他組織中未見表達，且在視網(wǎng)膜新生血管內皮細胞中的表達升高，提示其參與了視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生過程。視網(wǎng)膜血管內皮細胞是新生血管的重要參與者，而缺氧是新生血管的重要誘因[11]。OIR小鼠模型在P7～P12放置于75% O2環(huán)境中，之后在正常氧環(huán)境中飼養(yǎng)，相對于75% O2是缺氧的環(huán)境，從而誘發(fā)了視網(wǎng)膜的新生血管，故本研究進一步采用了視網(wǎng)膜血管內皮細胞在1% O2處理來模擬血管內皮細胞的缺氧環(huán)境，結果發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下HRMEC中CD146 表達升高。與本研究結果一致，Abu El-Asra等[12]研究還發(fā)現(xiàn)CD146在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中表達明顯升高，提示CD146 在缺氧誘導的視網(wǎng)膜新生血管中發(fā)揮重要的作用。

本研究進一步發(fā)現(xiàn)敲減CD146 可以明顯抑制視網(wǎng)膜血管內皮細胞的遷移和血管形成，而對視網(wǎng)膜血管內皮細胞的增殖影響不大。由于在OIR小鼠模型中，同窩小鼠視網(wǎng)膜新生血管情況差異較大，故本研究選擇同一小鼠左眼玻璃體腔注射NC siRNA作為對照，右眼注射CD146 siRNA作為觀察，減少不同小鼠之間引起的差異。本研究顯示，在視網(wǎng)膜中使用體內轉染試劑PEI和siRNA一起轉染，注射2 μl（100 μmol/L）siCD146，可以明顯敲減視網(wǎng)膜中CD146 mRNA和蛋白的表達，并能明顯抑制新生血管。而以往研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞[13]中敲減CD146可以抑制細胞的增殖和遷移，故推測CD146在視網(wǎng)膜血管內皮細胞中對與增殖相關的基因影響不大，主要通過影響細胞遷移從而影響血管生成。

為了探究CD146 對血管內皮細胞遷移的影響機制，在HRMEC上敲減CD146后檢測細胞遷移相關基因，發(fā)現(xiàn)VEGFA mRNA、RHOA mRNA和蛋白表達水平都明顯下調，而VEGF蛋白沒有明顯差異。在視網(wǎng)膜中敲減CD146后主要引起Rhoa蛋白表達下調。Rho小G蛋白在血管內皮細胞的骨架重塑、細胞粘附和細胞間連接中都發(fā)揮著重要作用，從而調節(jié)血管形成。RHOA是其中一員，通過肌動蛋白絲與其運動蛋白非肌動蛋白II的組裝誘導應力纖維形成，從而影響細胞的遷移[14]。以往研究發(fā)現(xiàn)RHOA參與調控視網(wǎng)膜新生血管的形成，并且抑制RHOA通路在體外可以明顯抑制血管生成[15]。本研究在HREMC上敲減CD146，雖然引起VEGF mRNA 水平的稍微下調，但主要是影響RHOA mRNA和蛋白水平的表達。另外，在視網(wǎng)膜中注射siCD146后，主要引起視網(wǎng)膜中RHOA蛋白表達明顯下調。RHOA是細胞遷移的重要參與者，故最終能影響新生血管形成。與本研究結果一致，CD146在黑色素瘤細胞[16]和乳腺癌細胞[17]中可以通過激活RHOA促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。除此之外，許多信號通路都參與新生血管的生成過程，其中p38 是絲裂原活化蛋白激酶，經(jīng)外界刺激而激活，引起細胞內蛋白激酶的連鎖反應。激活p38信號通路可以引起細胞有絲分裂及細胞遷移[18]。本研究發(fā)現(xiàn)在HRMEC和視網(wǎng)膜中敲減CD146后P-p38蛋白表達明顯下調，故可以在體內、體外抑制新生血管。利用CD146敲除的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，CD146缺失的內皮細胞通過抑制p38通路的激活從而抑制細胞的遷移能力和血管生成能力[19]。

綜上所述，敲減視網(wǎng)膜血管內皮細胞上CD146可以通過抑制RHOA/p38信號軸，來進一步抑制血管的遷移從而減少視網(wǎng)膜新生血管的形成，提示CD146 可以作為臨床上治療視網(wǎng)膜新生血管的新靶點，為臨床治療視網(wǎng)膜新生血管相關疾病提供新的理論依據(jù)和策略。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明林永：參與收集數(shù)據(jù)，參與選題、設計及資料的分析和解釋，撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。楊汝森：參與收集數(shù)據(jù)和實施研究，撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。閆東升、陳曉燕：參與選題、設計及資料的分析和解釋；撰寫論文；修改論文中關鍵性結果、結論，根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。呂帆：指導課題設計，修改論文；根據(jù)編輯部的修改意見進行修改