超臨界CO₂萃取桑枝黃酮工藝的研究

李文馨 殷勇 孫惠桉 陳菊 陸敏 王雪雅

摘 要：以桑枝為研究對象，采用超臨界CO2萃取技術(shù)，以桑枝總黃酮得率為指標(biāo)，通過單因素試驗和正交試驗考察了萃取溫度、萃取時間、萃取壓力和夾帶劑流速對桑枝總黃酮得率的影響，優(yōu)化超臨界CO2萃取桑枝黃酮工藝。結(jié)果表明，在萃取溫度40 ℃、萃取時間45 min、萃取壓力45 MPa以及夾帶劑流速0.750 mL·min-1的條件下，桑枝總黃酮得率為2.481 7 mg·g-1，其中夾帶劑流速對桑枝總黃酮得率的影響最為顯著，萃取壓力次之，萃取溫度和萃取時間的影響相對較小。

關(guān)鍵詞：桑枝；黃酮；超臨界CO2萃??；工藝優(yōu)化

Abstract： With Ramulus mori as research object， using supercritical CO2 extraction technology， with extracting rate of the total flavonoids as indicator， the effects of extraction temperature， extraction time， extraction pressure， and entrainer flow rate on the extraction yield of total flavonoids from Ramulus mori were studied by using single factor experiment and orthogonal array design， so as to optimize the extraction conditions. The result showed that the optimal supercritical CO2 extraction conditions were as follows： extraction temperature 40 ℃， extraction time?45 min， extraction pressure 45 MPa， and entrainer flow rate 0.750 mL·min-1. The extracting rate of total flavonoids from Ramulus mori can reach 2.481 7 mg·g-1 under the above condition. With the systematical research， it was found that the entrainer flow rate were the main factors to influence supercritical CO2 extraction， sequencing as entrainer flow rate>extraction pressure>extraction temperature>extraction time.

Keywords： Ramulus mori; flavonoids; supercritical CO2 extraction; optimization of process

桑枝（Ramulus mori）屬于?？粕僦参锷＃∕orus alba L.）的一年生干燥嫩枝，屬于原衛(wèi)生部于2002年發(fā)布的《關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕51號）中《可用于保健食品的物品名單》，收錄在《中國藥典》中，具有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、益肺氣等作用[1-2]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，桑枝富含多種生物活性成分，如黃酮、香豆素、多糖以及生物堿等，其中黃酮類成分是主要成分之一[3-4]。

根據(jù)其基本結(jié)構(gòu)黃酮可分為黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類、二氫黃酮醇類以及其他黃酮類等，廣泛分布于植物的葉片、花和果實中，部分與糖結(jié)合成苷類形式存在，少部分以游離形式存在[5]。近幾年，黃酮類物質(zhì)的研究相對較多，對心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等具有藥理作用[6-7]。

超臨界萃取技術(shù)是以超臨界流體的性質(zhì)為基礎(chǔ)，在高壓下，使需要萃取的溶質(zhì)溶解于超臨界流體中，再進(jìn)行降壓，或者升溫，降低溶質(zhì)的密度，從而降低在超臨界流體中的溶解度，使其從流體溶液中析出，實現(xiàn)萃取指定溶質(zhì)的技術(shù)[8]。近年來被普遍應(yīng)用于醫(yī)藥、生物、食品和化學(xué)等領(lǐng)域，具有處理溫度低、提取率高、對人體無害和安全穩(wěn)定等特點[9-11]。與其他提取方法相比，存在明顯優(yōu)勢[12]。目前，關(guān)于桑枝中總黃酮的提取方法主要是浸提法和超聲波提取法[13-14]。

本文以桑枝為研究對象，采用超臨界CO2萃取技術(shù)，以桑枝總黃酮得率為指標(biāo)，通過正交試驗確定桑枝黃酮萃取的工藝參數(shù)，可為桑枝黃酮的綜合利用和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

桑枝：市售，采收地為安徽省亳州地區(qū)，將干燥后的桑枝粉碎過篩，取30～40目為桑枝粉，冷藏備用；CO2：純度≥99.9%；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、無水乙醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

SFE-4超臨界CO2萃取儀：美國應(yīng)用分離公司；Multiskan GO酶標(biāo)儀：Thermo Fisher Scientific公司；Centrifuge 5424離心機：Eppendorf公司；BSA224S-CW電子分析天平：德國賽多利斯公司；DHG-9240A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海煜南儀器有限公司；FW135粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 超臨界CO2萃取

準(zhǔn)確稱取桑枝粉2 g裝入萃取釜中，達(dá)到設(shè)定溫度時，加壓調(diào)至設(shè)定值，設(shè)定CO2流速為3 L·min-1，以無水乙醇作為夾帶劑，調(diào)整夾帶劑流速，循環(huán)萃取。待萃取完畢，收集萃取液，過濾定容，待測。分別考察不同的萃取溫度、萃取壓力、萃取時間和夾帶劑流速對于桑枝總黃酮得率的影響。

1.3.2 單因素試驗

分別考察萃取溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃）、萃取壓力（40 MPa、45 MPa、50 MPa、55 MPa和60 MPa）、萃取時間（30 min、45 min、60 min、75 min和90 min）、夾帶劑流速（0.500 mL·min-1、0.625 mL·min-1、0.750 mL·min-1、0.875 mL·min-1和1.000 mL·min-1）對桑枝總黃酮得率的影響。

1.3.3 正交試驗

為全面考察超臨界CO2萃取中各因素的影響，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上開展正交試驗，以萃取溫度、萃取壓力、萃取時間和夾帶劑的流速為考察因素，以桑枝總黃酮的得率為指標(biāo)，采用4因素3水平正交試驗進(jìn)行優(yōu)化，確定超臨界CO2萃取桑枝黃酮的最佳工藝條件，試驗的各因素水平見表1。

1.3.4 總黃酮得率的測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加入無水乙醇定容到50 mL，搖勻，即為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL，置于10 mL容量瓶中，加入5% NaNO2溶液0.5 mL，混合均勻后靜置5 min，加入10% Al（NO3）3溶液0.5 mL，混合均勻后靜置5 min，再加入4% NaOH溶液4 mL，以50%乙醇溶液定容，搖勻后放置15 min，測定OD510 nm，橫坐標(biāo)為蘆丁濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]。

（2）桑枝總黃酮含量的測定。準(zhǔn)確吸取待測樣品液1 mL，按照上述步驟測定吸光度值，總黃酮含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算。

（3）桑枝總黃酮得率的計算。根據(jù)總黃酮含量計算桑枝中總黃酮得率，計算公式為

式中：c為提取液總黃酮含量，mg·mL-1；v為提取液定容后的體積，mL；m為桑枝粉的質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程與系數(shù)如圖1所示。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 萃取溫度對桑枝總黃酮得率的影響

由圖2可知，隨著溫度的升高，桑枝總黃酮得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時，桑枝總黃酮得率最大。在超臨界CO2萃取過程中，溫度的影響主要表現(xiàn)在兩個方面。①隨著溫度的升高，CO2流體密度降低，溶解能力下降，不利于萃??；②在一定壓力條件下，溫度的升高可提高溶質(zhì)在CO2中的熱運動，從而增大相應(yīng)的溶劑蒸汽壓，使得萃取物的揮發(fā)性擴散系數(shù)增強，有利于萃取[16-17]。因此，確定最佳萃取溫度為40 ℃。

2.2.2 萃取壓力對桑枝總黃酮得率的影響

由圖3可知，隨著壓力的升高，桑枝總黃酮得率總體呈上升趨勢，且在50 MPa時得率最高，一般認(rèn)為增加壓力，在增加CO2的密度的同時還會減少傳質(zhì)距離，有利于傳質(zhì)效率的增加[18]。當(dāng)壓力升高到55 MPa時，總黃酮得率出現(xiàn)下降趨勢，隨著壓力的升高，流體對流性和擴散性下降，傳質(zhì)速率降低[19]。壓力的增大也會促進(jìn)基質(zhì)的溶脹，從而加快有效成分向外擴散的速率，促進(jìn)萃取過程中的傳質(zhì)[20]。同時，萃取壓力較高，組織會發(fā)生形變、疏松，細(xì)胞壁受到破壞，通透性提高，使總黃酮溶出性增強，這也可能是壓力達(dá)到60 MPa時，總黃酮得率出現(xiàn)小幅度上升的原因[21]。因此，確定最佳萃取壓力為50 MPa。

2.2.3 萃取時間對桑枝總黃酮得率的影響

由圖4可知，桑枝總黃酮得率隨著萃取時間的延長而增加。萃取時間從30 min增加到45 min，總黃酮得率增加得比較快，萃取時間大于45 min，得率增加得比較緩慢，這是因為萃取剛開始，CO2流體與桑枝粉顆粒接觸不充分，總黃酮得率較低，隨著萃取時間的延長，CO2流體與桑枝粉顆粒的混合越來越充分，傳質(zhì)速率提高，桑枝粉中被萃取的總黃酮含量快速增加，從而總黃酮得率增加較快；當(dāng)萃取達(dá)到一定時間后，由于桑枝粉顆粒中剩余的未被萃取的總黃酮含量較少，總黃酮得率不會隨著萃取時間的進(jìn)一步延長而明顯增加。因此，確定最佳萃取時間為45 min。

2.2.4 夾帶劑流速對桑枝總黃酮得率的影響

由圖5可知，當(dāng)夾帶劑無水乙醇流速在0.750 mL·min-1時，桑枝總黃酮得率最高。夾帶劑流速在一定范圍內(nèi)的增快，有利于總黃酮得率的增加，可推斷是在此濃度范圍內(nèi)，夾帶劑流速的變快有利于桑枝粉中黃酮類化合物的溶出。但當(dāng)夾帶劑流速達(dá)到一定數(shù)值后，會縮短桑枝粉與夾帶劑的接觸時間，影響黃酮類化合物在溶劑中的溶解，降低夾帶劑的使用效率，從而降低了總黃酮得率。CO2是非極性物質(zhì)，這導(dǎo)致其在某些分離過程中存在很大的局限性[22]：對于烴類物質(zhì)和弱極性的脂溶性物質(zhì)溶解能力較好，但對于具有強極性的有機化合物則需增大萃取壓力或使用夾帶劑來實現(xiàn)分離，因而單純的超臨界CO2萃取只適合極性較低的親脂性物質(zhì)，黃酮類物質(zhì)一般極性較大[23]。實驗表明，在不加夾帶劑的條件下只能得到少量易揮發(fā)性的小分子物質(zhì)，黃酮類化合物的得率極低，因此針對黃酮類化合物的提取，夾帶劑的添加十分必要[24]。綜上，確定最佳夾帶劑流速為0.750 mL·min-1。

2.3 正交試驗結(jié)果

由表2可知，每個因素對桑枝總黃酮得率的影響程度都有所差別，且影響程度大小分別為夾帶劑流速（D）＞萃取壓力（C）＞萃取溫度（A）＞萃取時間（B），根據(jù)各因素影響水平選取各因素的最佳水平A2B2C1D2，即萃取溫度40 ℃、萃取時間45 min、萃取壓力45 MPa以及夾帶劑流速0.750 mL·min-1。

由表3可知，萃取溫度、萃取時間、萃取壓力和夾帶劑流速對桑枝總黃酮得率均有極顯著影響，由F值可得出各因素對桑枝總黃酮得率顯著性影響的順序為夾帶劑流速、萃取壓力、萃取溫度和萃取時間，這與極差分析的結(jié)果一致。

按優(yōu)選的工藝進(jìn)行驗證實驗，平行操作3次，桑枝總黃酮得率平均值為2.4817 mg·g-1，RSD值為3.491%，高于表2中的其他組合，表明該工藝能較好地提取桑枝總黃酮，為最佳萃取條件。

3 結(jié)論

本文選擇超臨界CO2萃取桑枝總黃酮，采用正交試驗進(jìn)行工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，超臨界CO2萃取桑枝黃酮的最佳工藝條件為萃取時間45 min、萃取溫度40 ℃、萃取壓力45 MPa和夾帶劑流速0.750 mL·min-1，

在此條件下，桑枝總黃酮得率為2.481 7 mg·g-1，其中夾帶劑流速對桑枝總黃酮得率的影響最為顯著，萃取壓力次之，萃取溫度和萃取時間的影響相對較小。

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