等溫擴增熒光技術快速檢測沙門氏菌的研究

梁振瑞 張薇 許紹坤 李鮮鮮 馮紅 自武全

摘 要：本文研究并建立等溫擴增熒光技術快速檢測沙門氏菌的方法。通過對沙門氏菌的SSAQ基因序列保守區(qū)設計引物，采用最佳引物組搭配其他配套試劑建立一種針對沙門氏菌的等溫擴增熒光技術快速檢測方法；采用直擴法提取DNA，通過等溫擴增熒光技術與常規(guī)PCR法對不同濃度沙門氏菌進行擴增檢測，檢測最低檢測限，對其靈敏度進行評價。結果表明，所建立的針對沙門氏菌等溫擴增熒光檢測的方法與常規(guī)PCR法相比，等溫擴增熒光檢測的方法靈敏度更高，且根據(jù)干擾實驗結果可知該方法對沙門氏菌具有良好的特異性，所建立的針對沙門氏菌的等溫擴增熒光技術檢測方法具有操作快捷、簡便、反應時間較短、良好的特異性和較高的靈敏度的特點，能夠用于沙門氏菌的快速檢測。

關鍵詞：等溫擴增熒光技術；沙門氏菌；特異性；靈敏度

Abstract： A method for rapid detection of Salmonella by isothermal amplification fluorescence was developed. By designing primers for the conserved region of SSAQ gene sequence of Salmonella， an isothermal amplification fluorescence method for rapid detection of Salmonella was established by combining the best primers with other supporting reagents. The direct expansion method was used to extract DNA， and the isothermal amplification fluorescence technique and conventional PCR method were used to detect Salmonella with different concentrations. The minimum detection limit was detected， and the sensitivity was evaluated. The results showed that the established method for isothermal fluorescence amplification detection of Salmonella is more sensitive than the conventional PCR method， and it has good specificity for Salmonella based on interfering experimental results. The characteristics of this method are fast， simple， short reaction time， good specificity， and high sensitivity. It can be used for rapid detection of Salmonella.

Keywords： isothermal fluorescence amplification technology; Salmonella; specificity; sensitivity

沙門氏菌是革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科，是常見的食源性致病菌，目前已知血清型有2 500個以上[1-3]。人一旦攝入了含有大量沙門氏菌的食品，就會引起細菌性感染，進而導致食物中毒、急性腸胃炎等疾病，因此，沙門氏菌檢測是各個國家檢驗機構的必檢項目之一[4]。目前，檢測沙門氏菌的方法有很多，如酶聯(lián)免疫法[5]、PCR法等[6]，但這些檢測方法都存在檢測過程煩瑣、檢測周期長的弊端[7]。近年來，隨著新技術的不斷發(fā)展與完善，以分子生物學技術為基礎的分析檢測方法迅速發(fā)展[8-9]。因此，建立一種快速簡便的沙門氏菌檢測方法具有重要意義。

等溫擴增熒光技術是核酸等溫擴增和熒光技術結合的新型核酸診斷POCT技術，針對目的片段設計4～6條特異引物。使用DNA聚合酶，通過添加熒光染料實時監(jiān)控整個擴增過程，分析實時擴增曲線和產(chǎn)物熔解曲線對產(chǎn)物進行定性或半定量。等溫擴增熒光技術對溫度精準度要求低，只需要恒定溫度就能完成擴增反應，不需要預先進行雙鏈DNA的變性，大大縮短了反應時間。由于該方法具有操作簡單、反應快速、靈敏度和特異性強等優(yōu)勢，已被廣泛用于病原體的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 病原菌

沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌、惡臭假單胞菌（簡稱：SM、DC、JP、ZH、EC）由云南國際旅行衛(wèi)生保健中心（昆明海關口岸門診部）提供。

1.2 主要儀器

電泳儀、電泳槽、電子天平、微波爐、凝膠成像儀、OPG GENIE Ⅱ系統(tǒng)等溫擴增熒光系統(tǒng)（OptiGene公司）、恒溫水浴鍋、大龍移液器等。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

采用菌液直接擴增法提取DNA，按1∶1的比例加入裂解液與菌液混合，95 ℃水浴或金屬浴加熱5 min，備用。

1.3.2 引物的設計

利用美國NCBI提供的BLAST在線軟件分析沙門氏菌中的SSAQ基因目標序列，結合快速熒光PCR法對目標片段的要求，篩選出長度為1 079 bp穩(wěn)定的保守區(qū)域，作為引物設計的目標片段，并利用目標片段序列作為引物探針，針對保守區(qū)使用Lamp Designer軟件設計引物SM-1，其包括1對內引物（FIP，BIP）和1對外引物（F3，B3）。

1.3.3 等溫擴增熒光法的建立

向擴增反應管中加入2.5 μL沙門氏菌DNA，18.5 μL反應液，4 μL引物，陰性對照加2.5 μL ddH2O，混勻。用GENIE Ⅱ設置擴增程序65 ℃反應40 min，熔解程序98～80 ℃，0.05 ℃為1個循環(huán)，根據(jù)擴增曲線和熔解曲線判定實驗結果。

（1）特異性檢測試驗。用等溫擴增熒光法對沙門氏菌和其他非沙門氏菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌和惡臭假單胞菌）菌株提取的DNA分別進行擴增。

（2）靈敏度檢測實驗。將沙門氏菌核酸樣本（初始濃度為528 ng·μL-1）10倍比依次稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10濃度檢測最低檢測限。取八連管，每管分裝18.5 μL Mix，

4 μL引物組，2.5 μL樣本，用ddH2O作陰性對照。65 ℃反應40 min；熔解程序為98～80 ℃進行上機擴增。

1.3.4 常規(guī)PCR檢測沙門氏菌

（1）重復性實驗。向擴增反應管中加入1 μL沙門氏菌DNA（未稀釋），12.5 μL反應液，2 μL引物（上游引物、下游引物各1 μL），9.5 μL ddH2O，混勻，設置一個空白對照，以ddH2O代替，重復7次，設置程序開始運行。完成電泳后，將凝膠塊放置凝膠成像儀中，觀察電泳條帶。

（2）靈敏度檢測實驗。將沙門氏菌核酸樣本（初始濃度為528 ng·μL-1）10倍比依次稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6濃度檢測最低檢測限。設置一個原液濃度、一個空白對照，分別對擴增后不同濃度的沙門樣本進行電泳分析，根據(jù)其條帶的亮度和清晰度分析其最低檢測限。

2 結果與分析

2.1 引物設計

引物設計完成后，使用BLAST軟件比對，結果發(fā)現(xiàn)，引物序列與沙門氏菌基因高度重合，且未匹配到其他病原的序列信息，初步證明SM-1引物有比較高的特異性。

2.2 等溫擴增熒光法

2.2.1 特異性檢測試驗

對沙門氏菌和其他4種非沙門氏菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌和惡臭假單胞菌）同時進行檢測，其結果只有沙門氏菌出現(xiàn)了特異性擴增，起峰時間在30 min以內，將時間延長至1 h后其他樣本也未出現(xiàn)擴增，說明該試劑盒只針對沙門氏菌進行特異性檢測。

2.2.2 靈敏性檢測實驗

由表1可知，當樣本檢測濃度大于等于10-4時，本試驗所建立的等溫擴增熒光檢測方法均能在30 min內檢出；當檢測濃度低于10-4時未出現(xiàn)完整的擴增曲線，說明建立的等溫擴增熒光技術能快速檢測沙門氏菌的濃度為10-4，檢測限為5.28×10-2 ng·μL-1。

2.3 常規(guī)PCR檢測沙門氏菌的結果

2.3.1 PCR方法檢測沙門氏菌的重復性

對沙門氏菌的DNA（未稀釋）進行PCR擴增，重復10次，均可見清晰明顯的288 bp大小的條帶，與預期結果吻合，說明該引物重復性好。

2.3.2 PCR方法檢測沙門氏菌的靈敏度

菌液稀釋到10-3時候擴增效果不穩(wěn)定，有微弱的條帶但時常不會顯現(xiàn)，因此判斷10-2為常規(guī)PCR的最穩(wěn)定的最低檢測濃度，檢測限為5.28 ng·μL-1，詳見圖1。與等溫擴增熒光法相比，檢測的靈敏度弱于等溫擴增熒光法。

3 結論與討論

傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法整個過程需4～5 d，且過程煩瑣[10]。聚合酶鏈式反應在沙門氏菌診斷方法中具有較高的特異性和靈敏度，是沙門氏菌感染診斷中最具有應用前景的一種方法。然而，常規(guī)PCR檢測時間長，對反應環(huán)境要求較高，且檢測儀器笨重。因此，建立一種反應快速、操作簡單、特異性靈敏的方法至關重要。目前，等溫擴增熒光法是一種能在恒定溫度下進行體外核酸擴增的技術，已被廣泛應用于醫(yī)學病原物檢測、食品安全檢測和植物病原物的檢測等方面[11]，有著極為廣泛的應用前景。

本文測試了4種非沙門氏菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌和惡臭假單胞菌），結果發(fā)現(xiàn)，本方法只對沙門氏菌的檢測結果呈陽性，而對4種非沙門氏菌的檢測結果呈陰性，表明該方法特異性良好。同時梯度稀釋方法進行沙門氏菌的靈敏度試驗，并與常規(guī)PCR檢測方法進行了比較。結果表明，本試驗建立的等溫擴增熒光法檢測沙門氏菌的靈敏度為5.28×10-2 ng·μL-1，而常規(guī)PCR的檢測限為5.28 ng·μL-1，比常規(guī)PCR靈敏100倍。

等溫擴增熒光法不需要反復變換溫度，檢測速度、易攜性等方面比PCR有很大的優(yōu)勢，有著操作簡單、快速、敏感性和特異性好等特點，具有良好的發(fā)展前景，是病原檢測的一項重要技術。

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