UPLC-MS/MS法同時快速測定保健食品中7種非法添加藥物

吳芳海 許琨琨 盧文斌 王曉峰 蔡振世

摘 要：目的：建立同時快速測定保健食品中阿伐那非、米羅那非、烏地那非、西地那非、他達拉非、沙格列汀和西布曲明等7種非法添加藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。方法：試樣前處理采用乙腈為提取溶劑，經(jīng)超聲處理，Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱分離，以水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）為流動相梯度洗脫，流速0.3 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量2 μL。質(zhì)譜采用電噴霧離子源，以正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式進行定性和定量分析。結(jié)果：7種非法添加藥物在本方法色譜和質(zhì)譜條件下8 min內(nèi)能得到快速分離，在10～500 ng·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R為0.997 1～0.999 2，檢出限為0.002 5 mg·kg-1。結(jié)論：本方法前處理過程簡單快速，選擇性強，靈敏度高，能夠快速、準確地同時對保健食品中非法添加的阿伐那非、米羅那非、烏地那非、西地那非、他達拉非、沙格列汀和西布曲明進行定性及定量測定。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）；保健食品；非法添加

Abstract： Objective： To establish an UPLC-MS/MS method for simultaneous determination of avanafil， mirodenafil， udenafil， sildenafil， tadalafil， saxagliptin and sibutramine in health food. Method： Samples was extracted with acetonitrile and handled by ultrasound， used Waters ACQUITY UPLC?BEH column C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） with mobile phase of water （contain 0.1% formic acid） and acetonitrile （contain 0.1% formic acid） by gradient elution ; the flow rate was 0.3 mL·min-1， the column temperature was 30 ℃， and the sample volume was 2 μL. ESI （electro spray ion source） was used for mass spectrometry， and positive ion multiple reaction monitoring mode was used for qualitative and quantitative analysis. Result： Seven illegally added drugs can be separated rapidly in 8 minutes under the conditions of this method， each component has a good linear relationship within the range of 10～500 ng·mL-1， the correlation coefficient R was between 0.997 1 and 0.999 2， the detection limit was 0.002 5 mg·kg-1. Conclusion： The pretreatment process of this method is simple and rapid， high selectivity， high sensitivity， it can be used as a rapid and simultaneous determination method for the illegally addition of avanafil， mirodenafil， udenafil， sildenafil， tadalafil， saxagliptin and sibutramine in health food.

Keywords： ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; health food; illegally added

近年來，隨著生活水平的提高，消費者對保健食品的需求也越來越強烈，其中補腎壯陽、降糖、減肥等熱門功效的保健食品尤其受到消費者的追捧，雖然目前與保健食品相關(guān)的法律法規(guī)越來越完善，保健食品行業(yè)日常監(jiān)管也日趨規(guī)范，但由于保健食品行業(yè)有著高熱度、高需求、高利潤等特點，在高額利益的驅(qū)使和誘惑下，保健食品中非法添加藥物的現(xiàn)象屢禁不止，如西地那非、他達拉非、西布曲明這些常見藥物在日常監(jiān)管中時有檢出。為了逃避監(jiān)管，甚至?xí)砑右恍┎⒉怀Ｒ姷乃幬锍煞只蛘咄瑫r添加多種不同功效的藥物，隱蔽性越來越高，嚴重危害廣大消費者的身心健康，因此本文在西地那非、他達拉非、西布曲明等常見的藥物之外，補充開發(fā)了阿伐那非、米羅那非、烏地那非和沙格列汀等新型藥物的檢測方法[1-5]，擴大了保健食品中非法添加物質(zhì)的檢測范圍，增加保健食品中非法添加物質(zhì)的檢測項目，提高檢測效率，為監(jiān)管部門整治行業(yè)亂象提供更多的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 實驗試劑與對照品

乙腈（色譜純，德國merck）；甲酸（色譜純，美國ROE）；水為超純水（由超純水器制備）；阿伐那非對照品（批號：S076065，F(xiàn)ist Standard）；米羅那非對照品（批號：ALT800166，F(xiàn)ist Standard）；烏地那非對照品（批號：FS1610680，F(xiàn)ist Standard）；西地那非對照品（批號：510068-202102，中國食品藥品檢定研究院）；他達拉非對照品（批號：510170-202102，中國食品藥品檢定研究院）；沙格列汀對照品（批號：FS1621842，F(xiàn)ist Standard）；西布曲明對照品（批號：100624-201802，中國食品藥品檢定研究院）；固體陰性供試品，某牌蛋白粉；液體陰性供試品：某牌鐵鋅鈣硒氨基酸口服液。

1.1.2 儀器

Triple Quad 5500超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國SCIEX公司；3-15臺式離心機，曦瑪離心機揚州有限公司；Dirent-Pure UP UV30超純水一體機，上海樂楓生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：2 μL；柱溫：30 ℃；流動相：A相為水（含0.1%甲酸），B相為乙腈（含0.1%甲酸），采用梯度洗脫見表1。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子掃描；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式；氣簾氣：20.0 psi；碰撞氣：9 psi；離子化電壓：5 500.0 V；溫度：500.0 ℃。噴霧氣：50 psi；輔助加熱氣：50 psi；7種分析物的詳細質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.2.3 混合對照品標準曲線的制備及測定

分別精密稱取適量阿伐那非、米羅那非、烏地那非、西地那非、他達拉非、沙格列汀和西布曲明對照品于同一容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成濃度為5 μg·mL-1的混合對照品溶液，分別精密移取混合對照品溶液0.02 mL、0.04 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL和1.00 mL置于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，即得濃度為10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、300 ng·mL-1和500 ng·mL-1系列標準溶液，按上述檢測條件進行測定，以對照品溶液的濃度為橫坐標，定量離子的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 供試品溶液的制備與測定

精密稱取一次服用量供試品（固體樣品研細），置于50 mL離心管中，加乙腈20 mL，渦旋振蕩1 min，超聲處理15 min，冷卻至室溫，5 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，向沉淀中再加入20 mL乙腈，重復(fù)提取1次，合并兩次提取上清液于同一50 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，過濾，即得供試品溶液。

不少保健食品中非法添加的藥物含量較高，為避免過高濃度的分析物組分污染質(zhì)譜系統(tǒng)，檢測過程中應(yīng)當先稀釋較大倍數(shù)溶液進樣，然后根據(jù)實際檢測結(jié)果調(diào)整至合適的稀釋倍數(shù)再進行測定[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性試驗

分別取濃度為100 ng·mL-1的混合對照品溶液和加標供試品溶液（濃度為100 ng·mL-1），按1.2的條件測定，記錄7種分析物的定量離子提取離子流色譜圖見圖1、圖2。結(jié)果顯示加標供試品溶液中7種組分的保留時間與混合對照品溶液一致，各組分分離效果和專屬性良好。

2.2 方法的線性范圍和檢出限

取某牌蛋白粉陰性供試品一次服用量（10 g），精確加入5 μg·mL-1的混合對照品溶液0.10 mL，按上述1.2.4方法步驟處理，即得每毫升含1 0 ng混合對照品的樣品溶液，再分別稀釋成各濃度檢測，以信噪比為3的溶液濃度計算各分析物的方法檢出限，試驗結(jié)果表明7種分析物在10～500 ng·mL-1線性關(guān)系良好，檢出限能達到0.002 5 mg·kg-1，本方法可滿足其檢測分析的需求。各分析物的線性和檢出限結(jié)果見表3。

2.3 加樣回收率試驗

分別取固體樣品（某牌蛋白粉）和液體樣品（某牌鐵鋅鈣硒氨基酸口服液）各6份（每份10 g），精確加入5 μg·mL-1的混合對照品溶液1 mL，按上述1.2.4方法步驟處理，制備成添加量為0.5 mg·kg-1的添加回收試樣溶液，測定結(jié)果計算平均回收率，結(jié)果見圖3。

由圖3可知米羅那非、烏地那非、西地那非、他達拉非、沙格列汀和西布曲明按本方法測定固體和液體兩種基質(zhì)樣品中的平均回收率結(jié)果為93.3%～118.4%，準確性和穩(wěn)定性較好，阿伐那非的回收率達到了135%以上，計算100 ng·mL-1濃度的阿伐那非在固體和液體兩種陰性基質(zhì)溶液中的峰面積與純?nèi)軇┲械姆迕娣e比分別為114%和122%，均大于100%，存在一定的基質(zhì)增強效應(yīng)[6]，可考慮采用配制基質(zhì)匹配標準曲線的方法來降低樣品基質(zhì)對阿伐那非的影響。

2.4 重復(fù)性試驗

記錄2.2中加標回收試樣溶液所測得的色譜峰面積，計算RSD結(jié)果，在固體樣品（某牌蛋白粉）和液體樣品（某牌鐵鋅鈣硒氨基酸口服液）中7種分析物的RSD分別為1.9%～8.8%和1.6%～6.1%，表明本方法在固體樣品和液體樣品的檢測中具有良好的重復(fù)性，具體結(jié)果見表4。

2.5 實際樣品檢測

采用本方法對71批保健食品（泉州市食品藥品檢驗所提供）進行測定，其中8批保健食品檢測出西地那非，含量差異較大，最低為25 mg/粒，最高為101 mg/粒，檢出率為11.3%，1批保健食品檢出他達拉非，添加量為42 mg/粒，檢出率為1.4%，1批保健食品檢出西布曲明，添加量為39 mg/粒，檢出率為1.4%，其余樣品未檢測出上述7種成分。

3 結(jié)論

本法采用乙腈為提取溶劑，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，建立了能夠同時快速測定保健食品中阿伐那非、米羅那非、烏地那非、西地那非、他達拉非、沙格列汀和西布曲明等7種非法添加藥物的測定方法，對方法的線性范圍、試樣加標回收率、精密度和檢出限等進行驗證和評價，并對多種實際的保健食品樣品進行了測定，結(jié)果準確檢出了含有西地那非、他達拉非、西布曲明等多種類不同功效的非法添加藥物成分，方法操作簡便、分離效能高、專屬性強、結(jié)果準確可靠，顯著縮短了分析時間，能夠滿足實驗室同時對上述7種不同功效的保健食品非法添加藥物的快速測定工作，也為市場監(jiān)管部門對保健食品非法添加藥物監(jiān)督管理的快速響應(yīng)提供有力的技術(shù)支持。

參考文獻

[1]吳鴛鴦，王任，周明昊，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定保健食品中阿伐那非與氟班色林含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2017，36（7）：783-785.

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