特異性檢測干酪乳桿菌的引物探針設(shè)計

陳延寧 侯亞茹 杜麗霞 艾慶蕊 張大虎 侯少陽

摘 要：目的：基于腸桿菌科基因間重復(fù)共有序列聚合酶鏈反應(yīng)（Enterobacterialrepetitive Intergenic Consensus PCR，ERIC-PCR）技術(shù)，設(shè)計特異性引物探針，實現(xiàn)干酪乳桿菌的靶向檢測。方法：以干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）HP-B1142為研究對象，通過不同實驗，優(yōu)化干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）的ERIC-PCR反應(yīng)體系。通過凝膠電泳獲得特定的條帶，對其進行測序和分析，設(shè)計出特異性的引物探針，達到對干酪乳桿菌靶向鑒別的目的。結(jié)果：通過不同實驗，得到干酪乳桿菌的最佳ERIC-PCR反應(yīng)體系；基于干酪乳桿菌ERIC基因片段，獲得兩對特異性引物，可在多種DNA的混合溶液中快速靶向鑒別出干酪乳桿菌。結(jié)論：基于ERIC-PCR技術(shù)獲得的特異性引物探針，可高效、靈敏地實現(xiàn)復(fù)雜生境中干酪乳桿菌檢出。

關(guān)鍵詞：聚合酶鏈反應(yīng)；干酪乳桿菌；靶向檢測；引物探針

Abstract： Objective： To design specific primer probes based on ERIC-PCR technology to achieve targeted detection of Lactobacillus casei. Method： Using Lactobacillus casei HP-B1142 as the research object， the ERIC-PCR reaction system of Lactobacillus casei was optimized through different experiments. Specific bands were obtained by gel electrophoresis， sequenced and analyzed， and specific primer probes were designed to achieve the purpose of targeted identification of Lactobacillus casei. Result： Through different experiments， the optimal ERIC-PCR reaction system for Lactobacillus casei was obtained. Based on the ERIC gene fragment of Lactobacillus casei， two pairs of specific primers were obtained， which can quickly target and identify Lactobacillus casei in a mixture of multiple DNA solutions. Conclusion： The specific primer probe obtained based on ERIC-PCR technology can efficiently and sensitively detect Lactobacillus casei in complex habitats.

Keywords： polymerase chain reaction; Lactobacillus casei; targeted detection; primer probes

益生菌（Probiotics）于1907年由梅切尼科夫首次提出。益生菌廣泛存在于人體內(nèi)，種類多樣，具有促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收、提高機體免疫力等功能。此外，研究發(fā)現(xiàn)益生菌用于發(fā)酵乳制品能夠有效緩解乳糖不耐受癥狀[1]。此外，益生菌對維持宿主腸道菌群平衡有非常重要的作用[2-3]，同時，益生菌還可用于治療兒童急性腹瀉[4]。干酪乳桿菌屬于乳桿菌屬，為革蘭氏陽性菌，作為益生菌的一種，具有降血壓、降膽固醇、抑制腫瘤生長的功能，同時可以促進細(xì)胞分裂，具有增強人體免疫以及預(yù)防癌癥等作用[5]。目前針對腸道細(xì)菌的鑒定技術(shù)主要有生化反應(yīng)實驗、16S rRNA測序比對和細(xì)菌特異性基因檢測、全基因組測序[6]等分子生物學(xué)方法[7]。近些年來發(fā)展的基質(zhì)輔助激光解析飛行質(zhì)譜技術(shù)，可以通過檢測菌體蛋白質(zhì)指紋圖譜達到對不同細(xì)菌屬、種的鑒定[8]，同時基于MALDI-TOF的分型方法也在快速發(fā)展當(dāng)中[9]。但是上述方法均存在操作復(fù)雜等問題，急需一種簡便、高效的干酪乳桿菌鑒別方法，實現(xiàn)干酪乳桿菌的痕量檢出。

ERIC序列，即腸桿菌基因間重復(fù)序列，首先由Sharples等[10]于1990年發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌，并將其命名為基因間重復(fù)單位[11]。腸桿菌科基因間重復(fù)共有序列聚合酶鏈反應(yīng)（Enterobacterialrepetitive Intergenic Consensus PCR，ERIC-PCR）是根據(jù)ERIC的核心序列設(shè)計引物，PCR擴增兩個ERIC之間序列，不同細(xì)菌的ERIC序列在染色體的位置不一樣，因此可以根據(jù)擴增條帶位置和數(shù)量來判斷是否為同一基因型多位點序列分型[12]，ERIC序列具有高度保守性，因此通過普通PCR方法擴增片段可以獲得DNA指紋圖譜[13]。ERIC-PCR技術(shù)在DNA指紋圖譜技術(shù)中的廣泛應(yīng)用使得細(xì)菌在亞種層次上的鑒別分類有了更好的依據(jù)[14-15]。由于此方法較傳統(tǒng)鑒別方法更為便利，目前被廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)中的菌株鑒別分類方面。由于細(xì)菌基因組的復(fù)雜性，不同的細(xì)菌會有不同的反應(yīng)條件，通過不斷優(yōu)化反應(yīng)體系，利用ERIC-PCR技術(shù)設(shè)計出特異性引物，可在不同的細(xì)菌DNA中靶向鑒別出特定的菌株。

本實驗通過利用ERIC-PCR技術(shù)設(shè)計出特異性引物，首先將目的菌株進行分離純化，再運用改良的SDS堿裂解法提取目的菌株的DNA，通過對比不同反應(yīng)條件下的結(jié)果，對ERIC-PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化，再將產(chǎn)物進行凝膠電泳，并將目的片段進行回收測序，得到測序結(jié)果后，運用DNAMAN V6軟件進行特異性引物的設(shè)計，最終得到特異性引物并進行驗證。本實驗所設(shè)計的特異性引物可以在菌株混合基因組DNA中通過PCR技術(shù)檢測出干酪乳桿菌，提高了菌種的特異性鑒別效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

S1010掌上離心機，美國賽洛捷克；DYY-6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；YXQ-75G全自動數(shù)顯立式高壓蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海皓莊儀器有限公司；T100 Thermal PCR儀，美國BIO-RAD公司。

1.2 材料與試劑

瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司；2K plus Ⅱ DNA marker，北京全式金生物科技有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；Tris堿、十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS），德國Sigma公司；溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB），美國Amresco公司；Taq DNA聚合酶、T5單克隆載體，北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 目的基因DNA的提取純化

將干酪乳桿菌HP-B1142接種至MRS固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，獲得純化的目的菌株。目前有許多提取DNA的方法，為了提高實驗效率，本實驗使用改良的SDS堿裂解法，用50 μL含有RNase A酶（10 mg·L-1）的1×TE溶液重懸，于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 設(shè)計特異性引物探針

使用ERIC-PCR技術(shù)對HP-B1142基因組DNA進行PCR，對長度約為2 700 bp和500 bp的兩條DNA片段進行回收，連接至T5載體，送至金唯智生物科技有限公司進行測序。

將得到的兩組測序結(jié)果利用BLAST在線比對工具進行比對分析，同時將序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，接收序列號分別為OP700792、OP700793。利用DNAMAN V6軟件設(shè)計出對應(yīng)片段的特異性引物，最后進行引物的特異性檢驗。

1.3.3 引物探針的含量限度檢驗

從實驗室自建微生物資源菌庫中選取5株常用益生菌菌株，分別為植物乳桿菌HP-B1098、鼠李糖乳桿菌HP-B1083、副干酪乳桿菌HP-B1145、嗜酸乳桿菌HP-B1079、瑞士乳桿菌HP-B1126，將其作為陰性對照。取以上5種細(xì)菌等濃度的混合DNA溶液，等量混合，使混合基因組DNA濃度與干酪乳桿菌基因組DNA濃度相等。將干酪乳桿菌基因組DNA與5種細(xì)菌的混合DNA溶液相混合，配制成干酪乳桿菌基因組DNA相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%（絕對含量900 ng·mL-1）、30%（絕對含量270 ng·mL-1）、3%（絕對含量27 ng·mL-1）、0%（絕對含量0 ng·mL-1）的混合溶液作為模板，使用設(shè)計的兩對特異性引物進行PCR反應(yīng)。

1.3.4 引物的特異性檢驗

為了檢測本實驗中的兩組特異性引物是否可以特異性鑒別干酪乳桿菌，特從實驗室中選取了其他不同的5種細(xì)菌進行檢驗。5種細(xì)菌分別為植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌。以本實驗所設(shè)計的1142-a-F/1142-a-R為一對引物，1142-2-F/1142-2-R為一對引物進行PCR反應(yīng)。

1.3.5 引物的普適性檢驗

為了確定該引物探針是否可以通用地檢測出干酪乳桿菌這一菌種，現(xiàn)選取干酪乳桿菌的近緣菌株進行普適性檢驗，驗證其通用性。將Lactobacillus casei DSM 20011、Lactobacillus case JCM 8129、Lactobacillus case IDCC 3451、Lactobacillus case JX 20225、Lactobacillus case ATCC 11443共5株近緣干酪乳桿菌作為引物探針普適性檢驗的對照，分別對上述菌株及本實驗所研究的干酪乳桿菌HP-B1142進行PCR，以所設(shè)計的1142-a-F/1142-a-R為一對引物，1142-2-F/1142-2-R為一對引物，進行PCR檢測。

1.3.6 運用兩對特異性引物檢驗市售公示配方中含有干酪乳桿菌的產(chǎn)品

通過選取3種市售產(chǎn)品來進行檢驗，可以用來確定本實驗設(shè)計的兩對特異性引物是否可以精準(zhǔn)檢驗出產(chǎn)品中的干酪乳桿菌，檢測其實用效果。選取3種市售公示配方中含有干酪乳桿菌的產(chǎn)品，提取產(chǎn)品基因組DNA為模板，以所設(shè)計的1142-a-F/1142-a-R為一對引物，1142-2-F/1142-2-R為一對引物，進行PCR反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA測序及特異性引物的設(shè)計

以干酪乳桿菌DNA作為模板進行ERIC-PCR操作，獲得長度約為2 000 bp和500 bp的兩條DNA條帶，通過測序獲得其DNA序列，長度分別為1 815 bp和428 bp。使用DNAMAN V6軟件分別設(shè)計出針對兩條DNA片段的特異性引物探針。引物探針命名及序列分別為1142-a-F：5'-CTAAGGTAGCTGATCGGTGGCACGATC-3'，1142-a-R：5'-CACTCTTGCCAATGGTCATCGCTG-3'；1142-2-F：5'-CAATCCATCAGTCAGAATGTGGAAGC-3'，1142-2-R：5'-CGAATGCACATGAGGATATCATTTCAGC-3'。同時使用兩對特異性引物以干酪乳桿菌HP-B1142基因組DNA為模板進行PCR，可以得到條帶清晰長度約為400 bp和1 800 bp的目標(biāo)片段，實驗結(jié)果如圖1。

M：2K plus Ⅱ DNA marker；A圖中1以1142-2-F/1142-2-R為引物、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）HP-B1142基因組DNA為模板進行驗證。B圖中1以1142-a-F/1142-a-R為引物、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）HP-B1142基因組DNA為模板進行驗證。

2.2 引物的特異性檢驗

為了確定本特異性引物是否具有特異性，是否能達到特異性鑒別干酪乳桿菌的目的，采用PCR的方式驗證兩對引物探針的特異性。對所得PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證，由圖2可知，以干酪乳桿菌基因組DNA為模板的1、2泳道可成功獲得目標(biāo)條帶，而以其他菌株基因組DNA為模板的泳道均無法得到目標(biāo)條帶。由此，該特異性引物探針可特異性檢出干酪乳桿菌。

M：2K plus Ⅱ DNA marker；圖中1、3、5、7、9、11皆選用1142-a-F/1142-a-R為引物，所選用模板分別為干酪乳桿菌HP-B1142、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌基因組DNA。圖中2、4、6、8、10、12皆選用1142-2-F/1142-2-R為引物，所選用模板分別為干酪乳桿菌HP-B1142、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌基因組DNA。

2.3 引物探針可檢測基因組DNA的含量限度檢驗

為確定本研究所設(shè)計的兩對特異性引物探針可檢測的基因組DNA含量限度，以混合DNA溶液為模板進行PCR反應(yīng)。對所得PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。由圖3中可知，在干酪乳桿菌基因組DNA濃度為27 ng·mL-1時，本實驗的兩對引物探針依然可完成干酪乳桿菌的特異性檢出。

M：2K Plus Ⅱ DNA marker；1～2泳道為干酪乳桿菌含量100%（絕對含量900 ng·mL-1）、3～4泳道為干酪乳桿菌含量30%（絕對含量270 ng·mL-1）、5～6泳道為干酪乳桿菌含量3%（絕對含量27 ng·mL-1）、7～8泳道為干酪乳桿菌含量0%（絕對含量0 ng·mL-1）的溶液。1、3、5、7泳道使用的引物探針是1142-a-F/1142-a-R，2、4、6、8泳道使用的引物探針是1142-2-F/1142-2-R。

2.4 引物探針普適性檢驗

由于干酪乳桿菌作為益生菌被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)應(yīng)用和研究中，因此，準(zhǔn)確鑒別干酪乳桿菌種及其近緣種也同樣重要。采用本實驗中的兩對引物探針，對與HP-B1142近緣的5株干酪乳桿菌進行PCR驗證，圖4實驗結(jié)果表明兩對引物探針均可擴增出目標(biāo)條帶從而實現(xiàn)近緣干酪乳桿菌檢出。

M：2K Plus Ⅱ DNA marker；1～2、3～4、5～6、7～8、9～10、1～12泳道分別以干酪乳桿菌HP-B1142、DSM 20011、JCM 8129、IDCC 3451、JX 20225、ATCC 11443基因組DNA為模板。1、3、5、7、9、11泳道使用的引物探針是1142-a-F/1142-a-R，2、4、6、8、10、12泳道使用的引物探針是1142-2-F/1142-2-R。

2.5 運用兩對特異性引物檢驗市售公示配方中含有干酪乳桿菌的產(chǎn)品

選取3種市售產(chǎn)品來進行檢驗，可以用來確定本實驗設(shè)計的兩對特異性引物是否可以達到精準(zhǔn)檢驗產(chǎn)品中的干酪乳桿菌，檢測其實用效果。對所得PCR產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證。圖5中泳道均可得到目標(biāo)條帶，進而判斷市售產(chǎn)品中含有干酪乳桿菌。由此可知，本實驗涉及的兩對特異性引物探針可以用于市售產(chǎn)品中干酪乳桿菌的檢驗，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。

M：2K Plus Ⅱ DNA marker；1～2、3～4、5～6分別以市售混合益生菌產(chǎn)品一、市售混合益生菌產(chǎn)品二及市售益生菌產(chǎn)品三的基因組DNA為模板；1、3、5泳道使用的引物探針是1142-a-F/1142-a-R，2、4、6泳道使用的引物探針是1142-2-F/1142-2-R。

3 結(jié)論

ERIC-PCR技術(shù)在DNA指紋圖譜技術(shù)中的廣泛應(yīng)用，使得細(xì)菌在亞種層次上的鑒別分類有了更好的依據(jù)，本實驗通過使用ERIC-PCR技術(shù)設(shè)計得到的兩對特異性引物，已將引物序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，接收序列號為OP700792、OP700793。獲得兩對引物探針1142-a-F/1142-a-R，1142-2-F/1142-2-R，并驗證其特異性、普適性、含量限度及是否可鑒別市售產(chǎn)品中的干酪乳桿菌，大大增強了該引物探針的實用性及可靠性。上述兩對引物探針可以在微量DNA溶液（絕對含量27 ng·mL-1）中高效實現(xiàn)干酪乳桿菌的痕量檢出，并可在復(fù)雜生境中實現(xiàn)市售產(chǎn)品中干酪乳桿菌的特異性檢出。

本實驗設(shè)計的兩對特異性引物探針較現(xiàn)有干酪乳桿菌的鑒別方法有了較大優(yōu)化，克服了現(xiàn)有方法中操作復(fù)雜、易被污染的缺點，可簡單、快速檢出復(fù)雜生境樣本中干酪乳桿菌；在醫(yī)療保健、科研活動等方面有著良好的實用性和廣闊的市場前景。

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