高效液相色譜測定食品中固綠的前處理方法對比研究

許蕤竹

摘 要：采用高效液相色譜法測定食品中人工合成色素固綠，對比了4種不同前處理方法，包括直接提取法、液-液萃取法、聚酰胺粉吸附法和固相萃取法。分別對果汁、配制酒、糖果、蜜餞等不同基質(zhì)進(jìn)行測定，分析測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度，并結(jié)合方法的便捷度和經(jīng)濟(jì)效益等，確定各種不同基質(zhì)對應(yīng)的最優(yōu)前處理方法。

關(guān)鍵詞：固綠；高效液相色譜；前處理；食品

Abstract： High performance liquid chromatography was used to determine the fast green FCF of artificial synthetic pigments in food. Four different pretreatment conditions were compared， including direct extraction method， liquid-liquid extraction method， polyamide powder adsorption method and solid phase extraction method. Prepare different matrices such as wine， candy， and candied fruit for determination， analyze the accuracy and precision of the measurement results， and combine the convenience and economic benefits of the method to determine the optimal pretreatment method for various matrices.

Keywords： fast green FCF; high performance liquid chromatography; pretreatment; food

人工合成色素在生產(chǎn)過程中可能帶入有害物質(zhì)，其本身過量使用也會對人體造成損害?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中對允許在食品中添加的人工合成色素的種類和限量有著明確的規(guī)定。

固綠是人工合成色素的一種，是一種酸性染料，能溶于水和酒精。固綠在中國澳門、日本、美國、加拿大等地區(qū)允許作為食品添加劑使用[1]，但在中國大陸不允許使用。國內(nèi)有過進(jìn)口食品中檢出固綠的報告，但目前國標(biāo)中并沒有針對固綠的檢測方法。國內(nèi)外用于測定合成色素的儀器方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法等[2]，前處理方法有直接提取法、液-液萃取法、聚酰胺粉吸附法、固相萃取法等多種。本實驗采用高效液相色譜法測定食品中固綠的含量，為選擇出更合適的前處理方法，對比分析了不同前處理方法在檢測不同基質(zhì)樣品時的優(yōu)缺點，進(jìn)而探索出更合適的檢測食品中固綠的方法，以達(dá)到高效、靈敏、省時和省材的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀，配自動進(jìn)樣器和DAD檢測器，美國安捷倫；CS501恒溫水浴鍋，上海博迅；G3垂熔漏斗，上海暢輝；CP413分析天平：感量0.001 g，奧豪斯；AL204分析天平：感量0.000 1 g，梅特勒；Vortex 3渦旋混勻器，美國SI；KQ-100DB超聲波清洗儀，上海圣科。

1.2 材料與試劑

固綠標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：2353-45-9），德國Dr. E；實驗室用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水；正己烷（C6H14），分析純，國藥公司；三正辛胺-正丁醇溶液（5%），阿拉??；乙醇-氨水-水混合溶液，7∶2∶1（體積比），上海安譜公司；甲醇（CH3OH），色譜純，上海安譜公司；鹽酸（HCL），分析純，國藥公司；聚酰胺粉（尼龍6）：過200 ?m（目）篩，國藥公司；WAX固相萃取柱，150 mg/6 mL，艾杰爾公司；0.45 ?m水相微孔濾膜，上海安譜公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。準(zhǔn)確稱取按照其純度折算為100%質(zhì)量的固綠標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g（精確至0.000 1 g），置于100 mL容量瓶中，用pH值為6的水定容，配制成1.00 mg·mL-1的水溶液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。臨用時，移取適量標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，加水稀釋至20倍，用0.45 ?m微孔濾膜過濾，配制成50 ?g·mL-1的水溶液。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線配制。精密量取適量標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，用水稀釋，配制成濃度為5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1和50 mg·L-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜儀測定。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 前處理方法

（1）直接提取法[3]。稱取樣品10～20 g（精確至0.001 g），加入60 ℃的熱水，用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH值至6，用水定容至50 mL，用超聲波清洗儀超聲提取20 min，6 000 r·min-1離心10 min，上清液過0.45 ?m水相濾膜，收集至進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)高效液相色譜儀測定。

（2）液-液萃取法。稱取樣品10～20 g（精確至0.001 g）至分液漏斗中，加入2 mL鹽酸、15 mL三正辛胺-正丁醇溶液（5%），振搖分液漏斗提取，收集有機(jī)相，多次重復(fù)提取，直到有機(jī)相無色；合并有機(jī)相，用飽和硫酸鈉溶液洗3次，將有機(jī)相放蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至10 mL，再轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入10 mL正己烷，加氨水溶液萃取3次；合并氨水層，再用正己烷洗2次，氨水層加入乙酸調(diào)成中性，水浴蒸發(fā)至近干，加水定容到5 mL。用0.45 ?m水相濾膜過濾，收集至進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)高效液相色譜儀測定。

（3）聚酰胺粉吸附法。稱取樣品10～20 g（精確至0.001 g），加入60 ℃的熱水，用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至6，取1 g聚酰胺粉加少量水調(diào)成糊狀，倒入樣品溶液中，攪拌后用G3垂熔漏斗抽濾，用pH為4的60 ℃的水洗滌4次；用甲醇-甲酸混合溶液洗滌4次，然后用水洗至中性，加乙醇-氨水-水混合溶液（7∶2∶1，體積比）解吸，直到色素被完全解吸，解吸液中加乙酸中和，水浴蒸發(fā)至近干，加水定容到5 mL。用0.45 ?m水相濾膜過濾，收集至進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)高效液相色譜儀測定。

（4）固相萃取法[4]。稱取樣品10～20 g（精確至0.001 g），用乙醇-氨水（70∶30，體積比）混合溶液定容，用超聲波清洗儀超聲提取20 min，6 000 r·min-1離心10 min，精確移取上清液20 mL至蒸發(fā)皿中，水浴濃縮至5 mL左右，加入20 mL水稀釋；用5 mL水反復(fù)沖洗蒸發(fā)皿，合并溶液后調(diào)節(jié)pH至5，將溶液控制在1 mL·min-1左右的流速通過WAX固相萃取柱，當(dāng)溶液完全流出后，再用5 mL含有0.05%甲酸的甲醇溶液淋洗WAX固相萃取柱，最后用20 mL含有4%氨水的甲醇洗脫，收集洗脫液，水浴蒸發(fā)至近干，加水定容到5 mL。用0.45 ?m水相濾膜過濾，收集至進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)高效液相色譜儀測定。

1.5 儀器條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；DAD檢測器波長：635 nm[5]。梯度洗脫程序見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

C8色譜柱和C18色譜柱都是常用的反向色譜柱，本試驗一開始為了縮短儀器分析時間，選擇C8色譜柱進(jìn)行分析，固綠目標(biāo)峰保留時間為5.476 min。但發(fā)現(xiàn)在分析復(fù)雜基質(zhì)時，因干擾物質(zhì)較多，C8色譜柱不能提供合適的分離度，故后續(xù)試驗更換了C18色譜柱，并通過多次調(diào)整流動相的梯度洗脫程序，使得固綠目標(biāo)峰保留時間為10.154 min，目標(biāo)峰附近的雜峰明顯減少，達(dá)到了很好的分離效果。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性和檢出限

固綠標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍在5～50 mg·L-1，曲線方程為y=23.541 8x-3.624 7，相關(guān)系數(shù)0.999 85。選擇空白基質(zhì)加標(biāo)試驗，根據(jù)3倍信噪比計算出方法檢出限。直接提取法檢出限為1 mg·kg-1，液-液萃取法檢出限為2 mg·kg-1，聚酰胺粉吸附法檢出限為0.5 mg·kg-1，固相萃取法檢出限為0.3 mg·kg-1。

2.3 不同前處理方法對檢測結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度的影響

分別用4種不同的前處理方法對果汁、配制酒、糖果和蜜餞等4種不同基質(zhì)樣品進(jìn)行處理，做低（2 mg·kg-1）、中（5 mg·kg-1）、高（20 mg·kg-1）3種濃度加標(biāo)試驗，每個添加水平重復(fù)6次。通過加標(biāo)回收率來驗證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度，結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來驗證方法的精密度，實驗結(jié)果見表2和表3。

2.4 直接提取法

直接提取法操作簡單、快捷，實驗時間短，所需試劑耗材成本低，可快速處理大量樣品。對于簡單基質(zhì)如果汁和配制酒，加標(biāo)回收率在72.7%～105.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.54%～9.69%，有較好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足測試需求。但在處理較復(fù)雜的基質(zhì)如糖果和蜜餞時，不能很好地去除干擾，數(shù)據(jù)波動較大，加標(biāo)回收率在67.2%～113.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在7.13%～16.78%，精密度不能滿足測試要求，色譜圖雜峰多影響定量結(jié)果。

2.5 液-液萃取法

液-液萃取法所用試劑較多，對實驗人員的操作水平有一定的要求。加標(biāo)回收率在58.3%～82.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.15%～10.22%，相對于其他3個方法而言，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度和精密度均不具有優(yōu)勢，檢出限也是最高的，不予推薦。

2.6 聚酰胺粉吸附法與固相萃取法

聚酰胺粉吸附法的加標(biāo)回收率在75.7%～99.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.40%～8.54%。固相萃取法的加標(biāo)回收率在73.9%～106.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.58%～8.65%。這兩個方法所得到的結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度基本一致，均能達(dá)到測試需求。特別在處理復(fù)雜基質(zhì)如糖果和蜜餞時，數(shù)據(jù)明顯優(yōu)于直接提取法和液-液萃取法，檢出限也能做到更低。相比較而言，聚酰胺粉法比固相萃取法操作簡單，且有明顯的價格優(yōu)勢，故在處理復(fù)雜基質(zhì)時優(yōu)選聚酰胺粉吸附法。

3 結(jié)論

本研究利用高效液相色譜法對食品中固綠進(jìn)行檢測，對比了不同前處理方法的優(yōu)缺點，分析大量實驗數(shù)據(jù)，并從方法難易程度、測試效率、測試成本、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性等多個維度綜合考慮，得出以下結(jié)論。在處理相對干凈的液體基質(zhì)時優(yōu)先選擇直接提取法，該方法快速高效，成本低，數(shù)據(jù)可靠；在處理復(fù)雜基質(zhì)時，聚酰胺粉吸附法有著明顯的優(yōu)勢，操作簡便，成本相對較低，檢出限低，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確。

參考文獻(xiàn)

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